De-novo-Verfolgung von Lipiden mittels stabiler Isotopenmarkierung LC-TIMS-TOF MS/MS

Bei der Analyse von Lipiddaten ist die Markierung stabiler Isotope (SIL) eine effektive Methode, um Stoffwechselwege in lebenden Organismen zu beurteilen. Bei dieser Methode werden Atome innerhalb eines Analyten durch stabile Isotope ersetzt, die ¹³C oder ²H enthalten. Diese Isotope werden weiter in Vorläufer eingebaut, die später in die Fettsäuren eingebettet werden und die Bereiche markieren, in denen sie sich befinden. Mit diesen Isotopen ist man in der Lage, die Verteilung und den Stoffwechsel von Lipiden zu identifizieren, da sie sich vom unmarkierten Hintergrund^{abheben 1}. Gängige Massenspektrometrie-Plattformen sind nicht in der Lage, das Signal, das von endogenen Molekülen ausgeht,^{zu unterscheiden 2}. Der Erfolg von SIL erfordert den Einsatz ultrahochauflösender Analysewerkzeuge. Die Flüssigchromatographie in Verbindung mit der hochauflösenden Mobilitätsspektrometrie für gefangene Ionen, der sequentiellen Fragmentierung, der Flugzeit-Tandem-Massenspektrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) ermöglicht die Trennung von markierten und unmarkierten Spezies². Der Vorteil der LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-Analyse besteht darin, dass das MS-Signal nach der Retentionszeit (RT) und Mobilität gefiltert werden kann, wodurch potenzielle Interferenzen endogener Moleküle sowie die Quantifizierung und Trennung aller gewünschten Spezies reduziert werden². Bei TIMS wird ein Ion zunächst gegen eine gasmobile Phase stationär gehalten und anschließend entsprechend ihrer Beweglichkeit wieder freigesetzt. Dies bietet hochauflösende Mobilogramme und arbeitet gleichzeitig mit einer niedrigeren Spannung als frühere IMS-Instrumente³. Mobilogramme sind Diagramme der Masse zu Ladung im Vergleich zur Driftzeit, die zur Unterscheidung zwischen Verbindungen auf der Grundlage ihrer Driftzeit und des Ausmaßes der Überlappung^{verwendet werden können 4}.

Durch die Verwendung einer zusätzlichen PASEF-Technik wird die Sequenzierungsgeschwindigkeit erheblich erhöht, ohne die Empfindlichkeit zu beeinträchtigen⁵. Die PASEF-Theorie beinhaltet die Akkumulation von Ionen, gefolgt von ihrer sequentiellen Freisetzung in der Reihenfolge ihrer Mobilität. Dies geschieht durch die Akkumulation von Ionen in paralleler Ausrichtung zu ihrer Beweglichkeit. Die Akkumulation auf diese Weise verhindert den Ionenverlust. Darüber hinaus erfolgt die Auswahl der Vorläuferionen gleichzeitig mit der Akkumulation und Freisetzung der Ionen. Bei dieser Methode wählt PASEF bei jedem TIMS-Scan mehrere Vorläufer in Reihe aus, anstatt der einzelnen Vorläufer pro Scan, die für ein TIMS-Gerät typisch sind, das PASEF nicht verwendet. Wenn die Vorläuferionen gleichzeitig akkumuliert und in 2-ms-Spitzen innerhalb eines TIMS-Scans von etwa 100 ms pro Frame freigesetzt werden, wird das Signal um mehr als eine Größenordnung verstärkt, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis³ erhöht wird. Die PASEF-Ergänzung des TIMS erhöht die Effizienz des MS/MS. Da TIMS-PASEF mit MS/MS gekoppelt ist, ist eine effizientere Fragmentierung möglich. Im Gegensatz zur herkömmlichen MS/MS-Detektion wird das Vorläufersignal vom TIMS-PASEF komprimiert, und die Fragmentionen werden gleichzeitig mit der TIMS-Elutionszeit und der Ionenmobilitätsposition des Vorläufers³ detektiert.

Bei der Datenerfassung von einem Massenspektrometer gibt es Optionen im gewünschten Scan-Modus. Bei der datenabhängigen Erfassung (DDA) werden Vorläuferionen aus dem MS1-Scan basierend auf ihren Häufigkeiten ausgewählt, bevor sie fragmentiert und der MS2-Scan durchgeführt wird. In diesem Scan-Modus werden so viele Vorläufer wie möglich fragmentiert. Der DDA-Ansatz ist zielgerichtet, und die Ergebnisse hängen von der Ionenauswahl^{ab 3}. Allerdings hat DDA-PASEF oft Probleme bei der Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten. Während DDA ein großartiges Werkzeug für eine fokussierte Analyse ist, haben komplexe Mischungen größere Schwierigkeiten bei der Datenerfassung⁶. Dies liegt daran, dass nur eine kleine Menge an Ionen gleichzeitig überwacht werden kann³. Die datenunabhängige Erfassung (DIA) ist eine Methode, bei der vorausgewählte Fenster von m/z unabhängig von ihrer Intensität fragmentiert werden und alle innerhalb des Bereichs⁷ gescannt werden. Mit diesem Scan-Modus werden ganze Ionenwolken vom IMS zum Massenspektrometer³ übertragen. In Proteomik-Studien führt dies dazu, dass im Vergleich zu DDA größere Mengen an Proteinen in kürzerer Zeit quantifiziert werden können. Darüber hinaus fehlen bei DIA im Vergleich zu DDA weniger m/z-Werte. Daher hat diese Alternative große Verbesserungen bei der Reproduzierbarkeit der Daten im Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Quantifizierung als DDA gezeigt. In der vorliegenden Arbeit ist es unser Ziel, DIA in die von Tose et ^al.2 beschriebene Methode zu implementieren. Wir verbesserten die Reproduzierbarkeit und Intensität der Signale und lieferten weitere und schlüssigere Informationen über die Mobilisierung, Verteilung und den Metabolismus von SIL-Lipiden in biologischen Proben, indem wir die Vorteile der DDA- und DIA-Akquisition nutzten.