使用未纯化的重组腺相关病毒载体在培养细胞中进行转基因表达

1. 质粒采集 注意：该方案将目的基因（GOI）克隆到具有巨细胞病毒（CMV）启动子和SV40聚腺苷酸化序列（pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40）的含ITR质粒中。然而，该质粒无需进一步克隆即可用于生产 rAAV，从而包装方便的 EGFP 和荧光素酶双报告基因。具有不同调控元件或不同应用（例如基于CRISPR的实验）的质粒可在线获得，并将遵循与以下类似的克隆步骤（有关其他克隆步骤，请参阅讨论）。此外，可以使用不同血清型的 rep/cap 或 反式 质粒——该方案将使用 AAV 血清型 2 的 rep/cap。 购买含有含ITR的 顺式 质粒、腺病毒辅助质粒、rep/cap质粒和含有GOI的质粒的细菌刺。在含有对每个质粒的耐药性具有特异性抗生素的单个琼脂平板上划线细菌。将细菌在30°C下孵育过夜以生长。注：如果不容易购买具有GOI的质粒，则可以在线购买合成DNA片段（参见 材料表）。此外，如果需要，可以使用合成DNA片段跳过整个PCR过程。 从每个平板中挑选一个菌落，并在30°C下在补充有相应抗生素的3mL Luria Bertani（LB）缓冲液中生长过夜，以180rpm振荡。将 1 mL 细菌转移到含有 50 mL 补充有相应抗生素的 LB 缓冲液的无菌 250 mL 锥形瓶中。在30°C，180rpm下振荡过夜。 将细菌转移到 50 mL 锥形管中，并在室温下以 3,000 x g离心 20 分钟。弃去上清液。按照制造商的说明，使用低内毒素或无内毒素的midiprep试剂盒分离质粒。注：ITR是不稳定的结构。为了防止ITR缺失或突变，细菌细胞应在30°C下生长，以减缓细胞分裂并减轻复制错误。为了提高质粒产量和纯度，midiprep或maxiprep试剂盒是理想的选择。建议使用低内毒素或无内毒素试剂盒，以减少细胞的下游内毒素污染。没有必要在层流罩内进行质粒分离，因为如果在标准工作台上进行，质粒制备不太可能受到污染。 2. 将目的基因克隆到含AAV ITR的质粒中 在DNA查看软件中打开含有GOI的质粒图谱。注意：由于衣壳的物理包装限制，包括 ITR 在内的完整盒不应超过 4.9 kb。此外，由于二级结构的原因，PCR扩增无法通过ITR实现。因此，不建议将Gibson组装用于rAAV转基因克隆。单击“序列”选项卡以显示质粒的完整 序列 。滚动到 GOI 序列的最 5′ 区域，然后单击 第一个核苷酸 ，同时向内拖向基因体以创建正向引物。一旦达到~55°C的熔化温度（Tm）就释放。 单击 “转发引物”。在引物序列的最末端 5′ 手动包括 EcoRI 限制性位点 （5′ GAATTC 3’） 的序列。此外，在该限制性位点的 5′ 端添加六个额外的随机碱基，以使酶有效地与 DNA 相互作用。单击 添加引物。有关代表性示例，请参阅 图 2 。 检查引物，确保它不会形成发夹或引物二聚体（回文的限制性部位除外）。如果形成发夹，则更改六个额外碱基的随机顺序。此外，确保引物不会与质粒上的其他任何地方结合。 重复这些步骤，在GOI向内到基因体的3’最区域创建反向引物。单击 Reverse Primer 并包括一个 NotI 限制位点 （5′ GCGGCCGC 3’）。注意：GOI 不能包含 EcoRI 或 NotI 限制性位点 – 如果是这样，则需要使用不同的限制性内切酶。 在 50 μL PCR 反应中扩增 GOI。使用 表 1 中所需的单个组件。将反应物置于热循环仪中，并按照表2中的循环参数进行编程。如果引物具有不同的 T m，则使用较低的 Tm 作为程序。 通过将 1 μL 凝胶上样染料 （6x） 加入 5 μL PCR 反应中来验证正确 PCR 片段的扩增。在含有溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上运行DNA分子量标准和PCR混合物，并用紫外光观察。注意：溴化乙锭是一种已知的诱变剂。 如果凝胶上出现单个特定条带，则按照制造商的说明使用基于柱的PCR纯化试剂盒纯化PCR联排管中剩余的PCR产物。如果出现多个条带（由于非特异性扩增），切除所需的条带，并按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒纯化 DNA。 在37°C下，用 表3 中所需的单个组分在50μL反应中消化纯化的PCR产物和pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40骨架质粒1小时。 由于凝胶提取后预期的回收率低下，因此需要更多的 pAAV 质粒 DNA。注：使用的限制性内切酶是高保真 （HF） 版本。常规 NotI 不能与 CutSmart 缓冲区一起使用。如果使用不同的酶，则可能需要不同的孵育温度和缓冲液。按照制造商的说明，使用基于柱的PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR产物。 通过向 50 μL 消化反应中加入 10 μL 凝胶上样染料 （6x） 来制备用于凝胶电泳的消化 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 骨架质粒。将DNA分子量标准，消化反应和250ng未消化的质粒（阴性对照）加载到含有溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上，具有宽齿孔。用紫外光观察，切除所需的片段 （~4.5 kb），并按照制造商的说明使用凝胶提取试剂盒纯化 DNA。 在20μL连接反应中将消化的PCR产物和消化的pAAV骨架质粒与 表4中所需的单个组分连接。要计算所需的PCR产物量，请使用公式1。通常，使用摩尔比为 3：1 的 PCR 产物（插入片段）与骨架 （pAAV），骨架质量数为 50 ng。一级方程式赛车 通过用水代替PCR产物进行阴性对照。将连接反应在16°C孵育过夜，或在室温下孵育2小时。 在冰上解冻一小瓶感受态重组缺陷细菌细胞（如 Stbl3 细胞），并将 50 μL 放入 1.5 mL 试管中。将 3 μL 连接反应直接加入细胞上，并在冰上孵育 30 分钟。注：ITR是不稳定的结构，因此需要重组缺陷的细菌菌株来限制ITR缺失和重组事件。DH5α 细胞可间歇性地用于增殖（一次或两次），但不建议长期使用。midiprep纯化后应定期检查ITR完整性。将细菌在42°C水浴中热休克30秒，然后立即转移到冰上2分钟。加入200μLLB缓冲液，在30°C，180rpm下振荡1小时。 将125μL混合物铺在含有相应抗生素的琼脂平板上，并在30°C下孵育过夜（~18小时）。 挑选多个克隆，并将每个克隆放入含有相应抗生素的 3 mL LB 的无菌塑料培养管中。在30°C，180rpm下振荡孵育过夜。注意：为了防止ITR缺失或突变，细菌细胞应在30°C下生长，以减缓细胞分裂并减少复制错误。此外，应选择较小的菌落，因为那些没有 ITR 的菌落可能比其他菌落具有生长优势。 将每种培养物 1.8 mL 移液到 2 mL 管中，并在室温下以 6,000 x g 离心 3 分钟。使用小量制备试剂盒分离DNA。将剩余的1.2mL培养物储存在4°C。 通过 DNA 测序或诊断限制性内切酶消化来验证正确的克隆。注：建议对插入片段进行Sanger测序，但通过ITR无法通过标准方法实现持续合成能力。ITR 应通过限制性摘要进行验证，如下所述。 将含有相应抗生素的 50 mL LB 缓冲液加入无菌 250 mL 锥形瓶中。向烧瓶中加入500μL剩余的培养物，并在30°C，180rpm下摇动，直到OD600 达到0.2-0.5（~18小时）。将细菌转移到50mL锥形管中，并在3,000× g，4°C下离心20分钟。 使用低内毒素或无内毒素的midiprep试剂盒分离DNA。 使用 XmaI（或 SmaI）用 20 μL 诊断限制性内切酶消化物检查 ITR 完整性。制备含有 500 ng 质粒、0.5 μL 酶和 1x 缓冲液的反应物;在37°C孵育1小时。 在0.8%琼脂糖凝胶上进行反应。如果 ITR 完好无损，则酶切将得到一个 ~2.9 kb 的条带和另一个盒大小的条带。如果没有观察到这个不同的条带，ITR可能不完整，需要重做克隆。注意：含有XmaI（或SmaI）限制性位点的质粒（除了ITR中的位点）将在凝胶上出现额外的条带。 图 2：引物设计的代表性示例。 mScarlet转基因的正向和反向引物设计（代表性示例）。 请点击这里查看此图的较大版本. 量 元件 X 微升 DNA 模板 （25 ng） 1微升 F引物（10μM） 1微升 R引物（10μM） 1微升 dNTP（10毫米） 10微升 Phusion 缓冲液 （5x） 1微升 Phusion聚合酶 X 微升 水 50微升 最终卷 表1：PCR扩增试剂。 成功PCR反应所需的组分。 步 温度 时间 初始变性 98 摄氏度 1 分钟 30 周期 98 摄氏度 10 秒 底漆的Tm 30 秒 72 摄氏度 每 kb 30 秒 最终延期 72 摄氏度 10 分钟 拿 4 摄氏度 无限期 表2：PCR扩增编程。 成功PCR反应所需的循环参数。 量 元件 X 微升 PCR产物（1μg）或pAAV质粒（3μg） 5微升 缓冲液 （10x） 1微升 EcoRI-HF系列 1微升 NotI-HF型 X 微升 水 50微升 最终卷 表3：消解试剂。 成功消化反应所需的组分。 量 元件 X 微升 插入 （X ng） X 微升 骨架 （50 ng） 2微升 T4 DNA 连接酶缓冲液 （10x） 1微升 T4 DNA连接酶 X 微升 水 20微升 最终卷 表4：连接试剂。 成功连接反应所需的组分。 3. 使用三质粒转染进行载体生产 注：以下值针对 6 孔板的单孔进行了优化，该孔板的最终粗制剂体积为 2 mL。对于最终体积为 20 mL 的 15 cm 板，所有值都可以放大 10 倍，对于最终体积为 500 μL 的 24 孔板，所有值都可以放大 4 倍。 通过将 100 mg PEI MAX 溶解在 100 mL 蒸馏水中，制备 1 μg/μL 聚盐酸亚胺 （PEI） MAX 原液。用NaOH调节pH至7.1。过滤：用0.22μm过滤器对混合物进行灭菌，并在-20°C下冷冻1mL等分试样以长期储存。解冻后，将试剂在4°C下储存1个月。 将 3 x 10 5 个 HEK293 或 HEK293T 细胞接种到 6 孔板中，该板含有补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的预热 Dulbecco 改良的 eagle 培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠）。在设置在37°C和5%CO2的培养箱中生长至~75%-90%汇合度（图3）。注：已观察到用青霉素/链霉素 （P/S） 培养的细胞会降低载体产量。使用适当的无菌技术可绕过使用 P/S 的需要，因此建议不要用抗生素20 培养 HEK293 细胞。如果下游转导需要P/S，建议在收获后将P/S添加到粗制剂中。 在 2 mL 管中，制备含有 1.3 μg pAAV2/2（Rep/Cap，血清型 2）、1.3 μg pAAV.GOI、2.6 μg pAdΔF6 和无血清 （SF） DMEM（4.5 g/L 葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠）的混合物，总体积为 100 μL（方便计算，参见 补充表 1 ）。 通过用任何不相关的质粒替换pRep / Cap，在单独的试管中制备阴性对照。阴性对照解释了粗制剂中存在的未包装的pAAV.GOI质粒，这些质粒可能在转导过程中转染细胞，尽管很少见。注：低内毒素或无内毒素的maxiprep或midiprep质粒是三重转染的理想选择，与小量制备DNA相比，通常产生更高的滴度载体，尽管小量制备DNA可用于快速和肮脏的初步测试。 向质粒混合物中加入 5.2 μL PEI MAX;这是一种质粒：PEI混合物，比例为1：1。在设置为 10 的涡旋混合器上脉冲 15-7 次，充分混合。如果产生多个载体制剂，则以1分钟的交错时间间隔（即，在t = 0 min时制备PEI，在t = 1 min时制备制备2，以在以下步骤中留出足够的时间吸出孔并稀释反应。注：已观察到质粒：PEI 的 1：1 比例是最佳的。但是，单个用户可以优化此比率以获得最大效率。有关如何执行PEI优化的讨论（另请参阅 补充表2）。 将每个试管孵育 15 分钟，然后用 1.9 mL SF DMEM（4.5 g/L 葡萄糖，110 mg/L 丙酮酸钠）稀释反应物，最终体积为 2 mL。轻轻移液 2 次混合。过混合会破坏质粒/PEI复合物，导致转染效率降低。 从孔中吸出培养基，并在孔侧轻轻添加质粒：PEI混合物，以防止细胞脱离。将细胞在37°C和5%CO2下孵育72小时。孵育过程中的细胞裂解和分离是rAAV产生的正常过程（图4）。 图 3：准备转染的 HEK293 细胞。 三质粒转染所需的HEK293细胞的理想汇合度（75%-90%）。 请点击这里查看此图的较大版本. 图 4：转染后的 HEK293 细胞。 转染 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40、pAAV2/2、pAdΔF6 和 1：1 比例的质粒：PEI 后 1、2 或 3 天前后 HEK293 细胞的外观。比例尺：400 μm。 请点击这里查看此图的较大版本. 4. 收获粗制载体制剂 将转染细胞的整个板在-80°C下冷冻30分钟，然后在37°C下解冻30分钟。 重复总共三个冻融循环。不要取下盖子——板内部必须保持无菌。板可以保持在-80°C，直到准备进行下一步。注意：非加湿培养箱最适合解冻，可最大限度地减少板外部可能导致意外污染的冷凝。 使用无菌技术在层流罩中执行以下两个步骤。通过移液混合每个孔，以确保最大限度地破坏细胞。将裂解物转移到 2 mL 试管中，并在室温下以 15,000 x g离心 15 分钟以除去细胞碎片。 小心地将上清液转移到新的 2 mL 试管中。这种粗制剂可立即使用，无需滴定或纯化。载体可在4°C下储存数月或-20°C储存数年。注：如果需要，可以通过定量PCR（qPCR）通过量化DNase抗性颗粒内的载体基因组（VG）数量来计算滴度。因此，滴度以 VG/mL 为单位给出。在4°C下储存数月的载体在使用前应重新滴定，因为载体可以聚集和/或结合管壁，降低制剂的滴度。 5. 转导 根据转导的持续时间，将所需的细胞类型（例如，Huh7）铺在96孔板中以50%-75%的目标汇合度接种。更大的汇合度可能导致AAV转导效率降低。 在不知道粗制剂滴度的情况下向细胞中添加载体（例如，CMV.mScarlet），用于剂量无关的应用，例如测试一组衣壳在新细胞类型中的转导。在无血清 （SF） 培养基中对粗制剂进行 1：3 稀释系列，以获得应用所需的最佳载体量。从 96 孔板中吸出培养基，并向孔中加入 50-100 μL 稀释的粗制剂。在37°C和5%CO2下孵育细胞。注意：血清可能含有可以中和AAV载体并降低转导效率的抗体。然而，血清可用于敏感细胞类型的转导。 转导后 （hpt） 48 小时后除去载体，并用预热的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞一次。对于敏感细胞类型，也可以在 2 hpt 时去除载体并用含血清的培养基替换。对于许多应用，进行过夜孵育以转导细胞，并在早上用含血清的新鲜培养基替换孔。Huh7 和 U2-OS 等稳健细胞类型无需更换培养基。 通过将细胞固定在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中 10 分钟来终止转导。根据应用，还可以使用各种终止方法（例如裂解）。对于大多数细胞类型，峰值表达发生在 48 hpt 时，因此是一个常见的实验终点。 6. 不同细胞类型转导方法的变化 注意：不同的细胞类型需要不同的培养条件。因此，应根据细胞类型的需要优化转导载体的添加。以下是代表性结果中包含的细胞类型的非常具体的转导方案，说明了研究人员可能希望根据自己的需要尝试的转导方案的一些变化。 小鼠小肠类器官从 C57BL/6J 小鼠的小肠隐窝制备中获得小鼠小肠类器官 （mSIO）。将类器官包埋在90%基底膜基质中，并在含有类器官生长培养基（不含抗生素）或预转导培养基（50%Wnt3a条件培养基[在类器官生长培养基中使用L Wnt-3A细胞内部生产]，10mM烟酰胺，10μROCK抑制剂和2.5μM CHIR99021）的24孔板中培养一次（5-7天），然后在37°C和5%CO2下转导。 在转导之前，用D-PBS冲洗类器官，通过移液破坏基底膜基质圆顶，并通过在37°C下在解离培养基中孵育10分钟并进一步移液将类器官解离成小细胞簇。 通过在含有15mM HEPES的DMEM / F-12中加入5S来终止细胞解离过程，将细胞簇转移到离心管中，并通过在室温下以1000× g离心5分钟来收集细胞簇。 将细胞簇重悬于转导培养基（含有 10 μg/mL 聚凝胺的预转导培养基或含有 10 μg/mL 聚凝胺的类器官生长培养基）中并转移到 48 孔板中，然后加入 AAV 粗制剂包装 CMV.mScarlet 用于转导。 通过将板在600× g 和37°C下离心1小时，然后在37°C下再孵育6小时来进行类器官的转导。将转导的类器官收集在 1.5 mL 微量离心管中，在室温下以 1000 x g离心 5 分钟，然后置于冰上。 除去上清液后，将转导的类器官重悬于预转导培养基或类器官生长培养基中的90%基底膜基质中，并将20μL的种子液滴重悬于预热腔盖玻璃的一个孔中。 在培养箱中孵育10分钟后，将液滴嵌入350μL预转导培养基或类器官生长培养基中，并在培养箱中在37°C下孵育。通过在共聚焦显微镜上对转导的类器官进行成像来确定转导后 2-5 天的转导效率，并估计每个类器官的红色荧光细胞百分比。 BeWo 电池在转导前 24 小时，以 96 孔板每孔 10,000 个细胞铺平人胎盘绒毛膜癌 BeWo 细胞。在无血清 F12-K BeWo 培养基中将粗 AAV 制剂包装 CMV.mScarlet 稀释至 1：1，每孔总体积高达 50 μL。从孔中吸出培养基，并用每孔 50 μL 稀释的 AAV 替换。 将细胞在37°C下孵育过夜（~18小时），然后加入100μL含有10S的F12-K BeWo培养基，使总体积增加至150μL。 将细胞再孵育 6 小时，转导后总共 24 小时 （hpt）。 对于成像，用 Hoechst 染料在 F12-K 培养基中染色活细胞 30 分钟，然后将培养基换成含有 10% FBS、1x glutamax 补充剂和 1x 丙酮酸钠补充剂的无酚 DMEM 进行成像。使用DAPI（用于Hoechst成像）和mCherry（用于mScarlet成像）滤光片组在37°C和5%CO2的共聚焦显微镜上进行活细胞成像。 Hepa1-6 和 Huh7 细胞在转导前 24 小时，将小鼠 Hepa1-6 肝细胞和人 Huh7 肝细胞铺在 DMEM（4.5 g/L 葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠、10% FBS）中，每孔 5,000 个细胞。 将50μL未稀释的粗AAV制剂包装CMV.mScarlet直接添加到细胞中，并在37°C下孵育48小时。在PBS中洗涤细胞一次，固定在4%PFA中，并用Hoechst染料染色10分钟。使用DAPI（用于Hoechst成像）和mCherry（用于mScarlet成像）滤光片组在共聚焦显微镜上进行成像。 C2C12 和 HSkMC 细胞在转导前 72 小时，以 96 孔板每孔 5,000 个细胞铺平未分化的小鼠 C2C12 成肌细胞和未分化的人原代骨骼肌细胞 （HSkMC） 成肌细胞。 将粗AAV制剂包装CMV.mScarlet稀释至1：1，用于C2C12成肌细胞的DMEM（4.5g / L葡萄糖，Penn / Strep，20S）或用于HSkMC成肌细胞的骨骼肌生长培养基。通过将培养基更改为分化培养基来区分HSkMC成肌细胞到肌管。 将成肌细胞和肌管在稀释的AAV制剂中在37°C孵育24小时。 用Hoechst染料染色活细胞10分钟，并使用DAPI（用于Hoechst成像）和mCherry（用于mScarlet成像）滤光片组在共聚焦显微镜上成像。