Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Emery L. Ng; Ashley L. Reed; Christopher B. O&#8217;Connell; Nathan N. Alder

doi:10.3791/65561

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neurosciences

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Published: June 30, 2023

doi:

10.3791/65561

Emery L. Ng¹, Ashley L. Reed², Christopher B. O’Connell¹, Nathan N. Alder²

¹Center for Open Research Resources and Equipment,University of Connecticut, ²Department of Molecular and Cell Biology,University of Connecticut

Summary

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Abstract

Mitokondri, enerji üretimi,^Ca2+ homeostazının düzenlenmesi, lipid biyosentezi ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi dahil olmak üzere hücrede birçok önemli rol oynar. Bu mitokondri aracılı süreçler, nöronlarda özel roller üstlenir, bu hücrelerin yüksek enerji taleplerini karşılamak için aerobik metabolizmayı koordine eder,^Ca2+ sinyalini modüle eder, akson büyümesi ve rejenerasyonu için lipitler sağlar ve nöronal gelişim ve işlev için ROS üretimini ayarlar. Mitokondriyal disfonksiyon bu nedenle nörodejeneratif hastalıklarda merkezi bir itici güçtür. Mitokondriyal yapı ve işlev ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır. Cristae adı verilen yapısal kıvrımlara sahip morfolojik olarak karmaşık iç zar, mitokondrinin imza süreçlerini gerçekleştiren birçok moleküler sistemi barındırır. İç zarın mimari özellikleri ultrastrüktüreldir ve bu nedenle geleneksel kırınım sınırlı çözülmüş mikroskopi ile görselleştirilemeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle, mitokondriyal üst yapı hakkındaki bilgilerin çoğu, sabit numuneler üzerindeki elektron mikroskobundan gelmiştir. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü floresan mikroskobunda ortaya çıkan teknolojiler artık onlarca nanometreye kadar çözünürlük sağlayarak canlı hücrelerdeki ultrayapısal özelliklerin görselleştirilmesine izin veriyor. Bu nedenle süper çözünürlüklü görüntüleme, mitokondriyal yapının, nano ölçekli protein dağılımlarının ve cristae dinamiklerinin ince ayrıntılarını doğrudan görüntülemek için benzeri görülmemiş bir yetenek sunar ve mitokondriyi insan sağlığı ve hastalığına bağlayan temel yeni bilgiler sağlar. Bu protokol, canlı insan nöroblastom hücrelerinin ve primer sıçan nöronlarının mitokondriyal üst yapısını görselleştirmek için uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) süper çözünürlüklü mikroskopinin kullanımını sunar. Bu prosedür beş bölüm halinde düzenlenmiştir: (1) SH-SY5Y hücre hattının büyümesi ve farklılaşması, (2) birincil sıçan hipokampal nöronlarının izolasyonu, kaplanması ve büyümesi, (3) canlı STED görüntüleme için hücrelerin boyanması prosedürleri, (4) referans için bir STED mikroskobu kullanılarak canlı hücre STED deneyleri için prosedürler ve (5) iç zarın morfolojik özelliklerini ölçmek ve ölçmek için örnekler kullanarak segmentasyon ve görüntü işleme için rehberlik.

Introduction

Mitokondri, ara metabolizma ve ATP üretimi, iyon homeostazı, lipid biyosentezi ve programlanmış hücre ölümü (apoptoz) dahil olmak üzere birçok önemli hücresel süreci düzenlemekten sorumlu olan endosimbiyotik kökenli ökaryotik organellerdir. Bu organeller topolojik olarak karmaşıktır ve birden fazla alt bölme¹ oluşturan bir çift zar sistemi içerir (Şekil 1A). Dış mitokondriyal membran (OMM) sitozol ile arayüz oluşturur ve doğrudan organeller arası temaslar kurar ^2,3. İç mitokondriyal membran (IMM), ATP sentezini ve diğer enerji gerektiren süreçleri ^4,5 yönlendirmek için esas olarak bir elektrik membran potansiyeli (ΔΨ_m) olarak depolanan iyon gradyanlarını koruyan enerji tasarrufu sağlayan bir membrandır. IMM ayrıca, OMM’ye yakından bastırılan iç sınır zarına (IBM) ve cristae membranı (CM) tarafından bağlanan cristae adı verilen çıkıntılı yapılara bölünmüştür. Bu zar, en içteki matris bölmesini intrakristal boşluktan (ICS) ve zarlar arası boşluktan (IMS) ayırır.

Mitokondri, dinamin süper ailesinin⁶ mekanoenzimleri tarafından yönetilen sürekli ve dengeli fisyon ve füzyon süreçlerine dayanan dinamik bir morfolojiye sahiptir. Füzyon, bağlantının artmasına ve retiküler ağların oluşumuna izin verirken, fisyon mitokondriyal parçalanmaya yol açar ve hasarlı mitokondrinin mitofaji ile uzaklaştırılmasını sağlar⁷. Mitokondriyal morfoloji, doku tipi⁸ ve gelişim evresi^9’a göre değişir ve hücrelerin enerjik ihtiyaçlar^10,11 ve stresörler ¹² gibi faktörlere uyum sağlamasına izin verecek şekilde düzenlenir. Mitokondrinin ağ oluşumunun kapsamı (birbirine bağlı ve parçalanmış), çevre, alan, hacim, uzunluk (en boy oranı), yuvarlaklık ve dallanma derecesi gibi standart morfometrik özellikleri, standart optik mikroskopi ile ölçülebilir ve ölçülebilir, çünkü bu özelliklerin boyutları ışığın kırınım sınırından (~200 nm) daha ^{büyüktür13}.

Cristae mimarisi, mitokondrinin iç yapısını tanımlar (Şekil 1B). Krista morfolojilerinin çeşitliliği genel olarak düz (lameller veya diskoidal) veya tübüler-veziküler¹⁴ olarak kategorize edilebilir. Tüm cristae, IMS’yi ICS’den ve IBM’i CM^15’ten bölümlere ayırmaya hizmet edebilen cristae bağlantıları (CJ’ler) olarak adlandırılan boru şeklindeki veya yuva benzeri yapılar aracılığıyla IBM’e bağlanır. Cristae morfolojisi, (1) CJ’lerde bulunan ve IMM-OMM kontaklarını stabilize eden mitokondriyal temas bölgesi ve cristae düzenleme sistemi (MICOS) dahil olmak üzere IMM’nin temel protein kompleksleri tarafından düzenlenir 16, (2) optik atrofi 1 (OPA1) CRISTA yeniden şekillenmesini düzenleyen GTPaz 17,18,19 ve (3) cristae uçlarında (CT’ler) stabilize edici oligomerik düzenekler oluşturan F ₁F_O ATP ^sentaz20^,²¹. Ek olarak, IMM, oldukça kavisli IMM^22’yi stabilize eden iki tabakalı olmayan fosfolipidler fosfatidiletanolamin ve kardiyolipin bakımından zenginleştirilmiştir. Cristae ayrıca dinamiktir, farklı metabolik durumlar 23,24, farklı solunum substratları²⁵, açlık ve oksidatif stres 26,27, apoptoz ^28,29 ve yaşlanma³⁰ gibi çeşitli koşullar altında morfolojik değişiklikler gösterir. Son zamanlarda, cristae’nin saniyeler içinde büyük yeniden şekillenme olaylarına maruz kalabileceği ve dinamik doğalarının altını çizdiği gösterilmiştir³¹. Bireysel cristae içindeki yapıların boyutları (örneğin, CJ genişliği, crista uzunluğu ve genişliği) ve bireysel crista’yı diğer yapılarla ilişkilendiren parametreler (örneğin, cristae içi boşluk ve OMM’ye göre cristae olay açısı) dahil olmak üzere cristae’nin çeşitli özellikleri ^{ölçülebilir32}. Bu ölçülebilir cristae parametreleri, fonksiyon ile doğrudan bir korelasyon gösterir. Örneğin, mitokondriyal ATP üretiminin kapsamı, cristae yoğunluğu veya başka bir özelliğe normalleştirilmiş cristae sayısı olarak ölçülen cristae bolluğu ile pozitif ilişkilidir (örneğin, OMM alanı başına cristae)^33,34,35. IMM morfolojisi nano ölçekli özelliklerle tanımlandığından, ışık kırınım sınırından daha yüksek çözünürlük sağlayan görüntüleme teknikleri gerektiren mitokondriyal üst yapıyı içerir. Aşağıda tarif edildiği gibi, bu tür teknikler arasında elektron mikroskobu ve süper çözünürlüklü mikroskopi (nanoskopi) bulunur.

Merkezi sinir sisteminin (CNS) nöral ve glial hücreleri özellikle mitokondriyal fonksiyona bağlıdır. Ortalama olarak, beyin toplam vücut ağırlığının sadece %2’sini oluşturur, ancak toplam vücut glikozunun %25’ini kullanır ve vücut oksijen tüketiminin %20’sini oluşturur, bu da onu enerji metabolizmasındaki bozulmalara karşı savunmasız hale getirir³⁶. Alzheimer hastalığı (AD), amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington hastalığı (HD), multipl skleroz (MS) ve Parkinson hastalığı (PD) dahil olmak üzere ilerleyici nörodejeneratif hastalıklar (ND’ler), bugüne kadar en kapsamlı şekilde çalışılan patolojilerden bazılarıdır ve bu hastalıkların moleküler temellerini anlamaktan potansiyel terapötik önleme ve müdahaleler aramaya kadar uzanan araştırma çabaları. ND’ler, kısmen mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC)³⁷ tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinden (ROS) kaynaklanan artan oksidatif stresin yanı sıra değişen mitokondriyal kalsiyum işleme 38 ve mitokondriyal lipid metabolizması³⁹ ile ilişkilidir. Bu fizyolojik değişikliklere, MS 40,41,42,43,44, ALS 45,46, HD^47,48,49, MS 50 ve PD ^51,52,53 ile ilişkili mitokondriyal morfolojide belirtilen kusurlar eşlik eder. Bu yapısal ve işlevsel kusurlar, karmaşık neden-sonuç ilişkileriyle birleştirilebilir. Örneğin, cristae morfolojisinin OXPHOS enzimlerini⁵⁴ stabilize ettiği göz önüne alındığında, mitokondriyal ROS sadece ETC tarafından üretilmekle kalmaz, aynı zamanda ETC’nin bulunduğu altyapıya zarar vermek için hareket eder ve oksidatif hasara duyarlılığı artıran ileri beslemeli bir ROS döngüsünü teşvik eder. Ayrıca, cristae düzensizliğinin mitokondriyal DNA (mtDNA) salınımı ve otoimmün, metabolik ve yaşa bağlı bozukluklara bağlı inflamatuar yollar gibi süreçleri tetiklediği gösterilmiştir⁵⁵. Bu nedenle, mitokondriyal yapının analizi, ND’lerin ve bunların moleküler temellerinin tam olarak anlaşılması için anahtardır.

Transmisyon elektron mikroskobu, elektron tomografisi ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ve X-ışını tomografisi, özellikle kriyo-yumuşak X-ışını tomografisi dahil olmak üzere kristaları görüntülemenin popüler yöntemleri önemli bulgular ortaya çıkarmış ve çeşitli numune türleri ile çalışmıştır 56,57,58,59,60 . Organel üst yapının daha iyi gözlemlenmesine yönelik son gelişmelere rağmen, bu yöntemler hala numune fiksasyonu gerektirme uyarısı ile birlikte gelir ve bu nedenle, cristae’nin gerçek zamanlı dinamiklerini doğrudan yakalayamaz. Süper çözünürlüklü floresan mikroskobu, özellikle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM), genleşme mikroskobu (ExM) ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu, klasik optik mikroskopi yöntemlerini kısıtlayan kırınım sınırının altında çözünürlük gerektiren yapıları görüntülemenin popüler yolları haline gelmiştir. ExM başka bir süper çözünürlük tekniği ile birlikte kullanıldığında, sonuçlar etkileyicidir, ancak numune bir jel⁶¹ içinde sabitlenmeli ve boyanmalıdır. Karşılaştırıldığında, SIM, PALM / STORM ve STED’in tümü canlı örneklerle başarıyla kullanılmıştır ve genellikle IMM’yi boyayan yeni ve umut verici boyalar, mitokondri cristae dinamiklerinin^canlı görüntülenmesi için yeni ve kolay bir yaklaşım sağlar 62,63,64,65,66. STED görüntüleme için canlı boyalardaki son gelişmeler, boya parlaklığını ve fotostabiliteyi iyileştirmiştir ve bu boyalar, IMM’yi öncekilerden daha yüksek bir özgüllük derecesinde hedeflemektedir. Bu gelişmeler, süper çözünürlüklü görüntüleme ile uzun vadeli timelapse ve z-stack deneylerinin toplanmasına izin vererek, mitokondriyal üst yapı ve dinamiklerin daha iyi canlı hücre analizine kapı açar.

Burada, STED⁶³ kullanılarak PKmito Orange (PKMO) boyası ile boyanmış farklılaşmamış ve farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi için protokoller sağlanmaktadır. SH-SY5Y hücre hattı, metastatik nöroblastom^{67,68,69,70’in} kemik iliği biyopsisinden üretilen ebeveyn hücre hattı SK-N-SH’den üç kez alt klonlanmış bir türevdir. Bu hücre hattı, ND araştırmalarında, özellikle mitokondriyal disfonksiyonun yoğun bir şekilde dahil olduğu AD, HD ve PD gibi hastalıklarda yaygın olarak kullanılan bir in vitro modeldir 10,43,71,72,73. SH-SY5Y hücrelerini, kültür ortamını manipüle ederek nöron benzeri bir fenotipe sahip hücrelere ayırt etme yeteneğinin, birincil nöronal hücrelere güvenmeden sinirbilim araştırmaları için uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır^10,74. Bu protokolde, SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşmasını indüklemek için hücre kültürü ortamına retinoik asit (RA) eklendi. RA bir A vitamini türevidir ve hücre döngüsünü düzenlediği ve nöronal farklılaşmayı düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu desteklediği gösterilmiştir⁷⁵. Sıçan hipokampusundan izole edilen nöronların kültürlenmesi ve canlı hücre görüntülemesi için bir protokol de sağlanmıştır. Hipokampusun mitokondriyal dejenerasyondan etkilendiği ve korteks ile birlikte yaşlanmada önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ve ND 76,77,78,79,80.

Protocol

1. SH-SY5Y hücrelerinin yayılması ve farklılaşması Hücre büyümesi ve bakımı için ortamın hazırlanmasıEksiksiz, yüksek glikozlu Dulbecco’nun Modifiye Eagle’s Medium’unu (DMEM, 4.5 g / L D-glikoz, 4 mM L-glutamin, 110 mg / L sodyum piruvat) nihai% 1 (h / h) antibiyotik-antimikotik (10.000 birim / mL penisilin, 10.000 μg / mL streptomisin ve 25 μg / mL Amfoterisin B) ve değişen miktarlarda fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edin (bkz. Farklılaşma ortamındaki FBS miktarları nihai , %5 veya %2 (h/h) FBS arasında değişmektedir. Hücre bakımıHücreleri (h/h) FBS ile takviye edilmiş DMEM’de tutun ve 37 °C ve O2’ye yerleştirin, ardından farklılaşma için %5 (h/h) FBS içeren DMEM’e tohumlayın. Donmuş hücre stokları FBS’de 1-2 x 107 hücre/mL’de (h/h) dimetil sülfoksit (DMSO) ile depolandı. Retinoik asidin (RA) hazırlanması5 mM stok çözeltisi elde etmek için 7.51 mg all-trans-RA’yı (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 mL taze hazırlanmış% 95 etanol içinde çözün. Stok çözeltisinin etanol içinde 5 μM’de seyreltilmesi kullanılarak, üreticinin protokolü81’deki ürün bilgi sayfasından elde edilen 350 nm’de (ɛ = 44.300 M-1 cm-1) absorbanslı konsantrasyonu doğrulayın. 5 mM stoğu ışıktan koruyarak 4 °C’de 6 haftaya kadar saklayın. Lamel kaplama için poli-D-lizin hazırlanmasıNOT: Satıcı sitesi82’nin Belgeler ve İndirmeler bölümünde bulunan poli-D-lizin (PDL) ürün protokolü, çeşitli kültür kaplarının kaplanması için bilgi sağlar.Bu protokol, steril #1.5 borosilikat örtü camı tabanları ile oyuk başına 4 cm 2 alana sahip2 oyuklu odacıklı bir kaba dayalı hacimleri içerir (bkz. PDL’nin stok çözeltisini Dulbecco’nun PBS’si (DPBS; kalsiyum yok, magnezyum yok) ile iki kat 50 μg / mL’ye seyreltin.NOT: #1.5 veya #1.5H kapak camı, görüntü kalitesi için gerekli olan kabul edilebilir kalınlıklardır. Diğer kalınlıklar küresel sapmaya neden olur ve bundan kaçınılmalıdır. PDL ile lamel kaplamaNOT: Lameller, daha fazla sterilizasyon için bir biyogüvenlik kabininde 10-15 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakılabilir.Bir hücre kültürü kabinindeki steril odacıklı lamellerin her bir oyuğuna 1.2 mL 50 μg / mL PDL çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. PDL solüsyonunu çıkarın ve 3.6 mL damıtılmış su ile üç kez durulayın. Son yıkamayı tamamladıktan sonra, durulamadan ve hemen kullanmadan önce kaplanmış haznenin havaya maruz kalarak 2 saat kurumasını bekleyin veya hava geçirmez bir kapta 4 °C’de 2 haftaya kadar saklayın.NOT: Fazla PDL hücreler için toksik olabileceğinden lamelleri iyice durulayın. SH-SY5Y hücrelerinin RA ile farklılaşmasıNOT: 15. pasajın üzerindeki hücreleri kullanmayın. Hücreler -90 birleşimde geçer. Farklılaşma prosedürleri farklıdır ancak benzer adımları takip eder. Nöroblastomlardan olgun nöronlara ek farklılaşma, beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)68,83,84,85 ile daha ileri tedavi ile elde edilir, ancak bu protokolde gerçekleştirilmemiştir.İSTEĞE BAĞLI: Kapak camına tohumlamadan önce en az 24 saat hücreler oluşturun. Dondurulmuş stoklardan hücre hazırlamak için, 1 mL donmuş hücre şişesini hızla çözün ve% 10 FBS ile desteklenmiş 9 mL önceden ısıtılmış ortama ekleyin, ardından 10 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 350 x g’da döndürün ve DMSO’yu çıkarmak için süpernatanı atın. Hücre peletini 5 mL önceden ısıtılmış ortamda ve tohum hücrelerini bir T-25 şişesinde yeniden süspanse edin. Hücreler -90 birleşmeye ulaştığında, hücreleri sayarak ve uygun olduğunda farklılaşma için tohumlayarak geçirin.0. Gün: Tohum hücreleri.Hücreleri, donmuş stoklardan veya çalışan bir şişeden odacıklı bir kapak camına tohumlayın. 1,5 x 104 hücre/cm2 tohumlama yoğunluğu kullanın.NOT:4 cm2 kültür alanına sahip standart 2 oyuklu odacıklı bir kapak camındaki tek bir kuyucuk 6.0 x 104 hücre gerektirecektir. Farklılaşmayacak hücreler (h/h) FBS ile desteklenmiş DMEM ile, farklılaşacak hücreler ise %5 (h/h) FBS ile desteklenmiş DMEM ile tohumlanmalıdır. 1. Gün: RA farklılaşma tedavisine başlayın.Bu farklılaşma prosedürü için araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere% 5 (h / h) FBS,% 1 (h / h) antibiyotik-antimikotik ve% 10 μM RA veya aynı katkı hacmine sahip etanol nihai konsantrasyonu ile desteklenmiş DMEM hazırlayın. Tohumlama için kullanılan odacıklı kapak camındaki ortamı çıkarın, 1x PBS ile durulayın ve yeni DMEM’i kuyucuklara ekleyin. 3. Gün: Ortamı taze RA veya etanol içeren ortamla değiştirin.1. Günden itibaren medyayı çıkarın ve bu farklılaştırma prosedürü için araç kontrolü olarak hizmet etmek üzere %2 (h/h) FBS, %1 (h/h) antibiyotik-antimikotik ve aynı katkı hacmine sahip 10 μM RA veya etanol ile desteklenmiş taze ortamla değiştirin. Tohumlama için kullanılan odacıklı kapak camındaki ortamı çıkarın, 1x PBS ile durulayın ve kuyucuklara yeni ortam ekleyin. 6. Gün: Hücrelerin görüntülenmesini gerçekleştirin.NOT: Hücre farklılaşma süreleri protokole göre değişir, ancak RA’ya altı gün maruz kalmak, SH-SY5Y hücrelerinde nöron benzeri bir fenotipi indüklemek için yeterlidir86.Bölüm 3 ve 4’teki ayrıntılarla canlı görüntüleme gerçekleştirin (Şekil 2). 2. Birincil sıçan hipokampal nöron kültürü Sıçan hipokampal nöron izolasyonu için malzeme hazırlama.Taze takviye edilmiş DMEM hazırlayın. (h/h) ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS, %1 (h/h) sodyum piruvat çözeltisi ve %1 (h/h) penisilin-streptomisin (10.000 U/mL) ile desteklenmiş bir DMEM (yüksek glikoz, sodyum piruvat içermeyen) karışımını filtreyle sterilize edin. 4 °C’de 2 haftaya kadar saklayın. Taze takviye edilmiş nöron büyüme ortamı hazırlayın.%2 (h/h) B27 takviyesi, %0.25 (h/h) glutamin takviyesi ve %1 (h/h) penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş bir nöron büyüme ortamı karışımını filtreyle sterilize edin (bkz. 4 °C’de 2 haftaya kadar saklayın. Birincil hipokampal nöron kültürünü hazırlayın.Daha önce yayınlanmış çalışmayı87 ve diseke edilmiş E18 sıçan hipokampusunun elde edildiği üreticinin sitesindeki ürün protokolünden88 birincil hipokampal nöron kültürünü hazırlayın (bkz. Bu protokol, %<2 astrosit içeren çoğunlukla nöronal bir popülasyonla sonuçlanır.NOT: Bu dokunun gönderildiği hazırda bekletme ortamı, bu protokolün gelecekteki adımları için kullanılacaktır. Atmayın. Doku ayrışması için malzeme ve ortam hazırlayın.Açıklık çapını azaltmak için bir Pasteur pipetini alevlendirin ve kullanıma kadar kontaminasyonu önlemek için folyoda saklayın. Hazırlanan DMEM’i, 1X Hank’in Tamponlu Tuz Çözeltisini (HBSS) ve nöron büyüme ortamını 37 °C’ye ısıtın. 15 mL’lik konik bir tüpe steril cımbızla 2 pul DNAaz ekleyin. Doku ayrışması gerçekleştirin.Dokuyu DNAaz içeren 15 mL’lik konik tüpe yerleştirmeden ve 37 ° C’de kısa bir süre inkübe etmeden önce, diseke edilmiş E18 sıçan hipokampusunun depolandığı hazırda bekletme ortamının mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. 900 μL 1X HBSS ve ardından 100 μL% 0.5 tripsin ekleyin. Dokuyu 37 °C’de 15 dakika inkübe edin.NOT: PDL kaplı plakalar depodan çıkarılabilir ve bu inkübasyon süresi boyunca kullanılana kadar bir inkübatöre yerleştirilebilir. Doku homojenizasyonu ve hücre sayımı gerçekleştirin.Tripsin ile inkübasyonun ardından, besiyerini çıkarın ve dokuya önceki adımdan 1 mL önceden ısıtılmış hazırda bekletme besiyeri-DNAaz ekleyin ve Pasteur pipeti ile homojenize edin. Medya opak görünecek ve homojenizasyon devam ettikçe yavaş yavaş netleşecektir. 4 mL önceden ısıtılmış DMEM ile yeni bir tüpe ayrışmış nöronlar ekleyin ve ardından bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Hücre kaplamasını ve birincil hücrelerin büyümesini gerçekleştirin.DMEM’de yaklaşık 1.65 x 104 hücre/cm2 yoğunlukta plaka hücreleri. 2 oyuklu odacıklı bir kapak camı (4cm2) için, 2 mL DMEM ile oyuk başına 65.000 – 70.000 hücre tohumlayın. Yapışmayı kontrol etmeden önce hücreleri 37 °C ve O2’de 2 saat inkübe edin. Hücreler yapışmaya başladığında, 1 mL ortamı çıkarın ve aynı hacimde hazırda bekletme ortamıyla değiştirin, ardından karıştırmak için hafifçe çalkalayın. Ortam karıştırıldıktan sonra, bu işlemi tekrarlayın ve mevcut ortamın yarısını çıkarın ve aynı hacimde nöron büyüme ortamı ile değiştirin, ardından yavaşça karıştırın.NOT: Kaplama günü, in vitro (DIV) 0 günü olarak kabul edilir ve hücreler DIV 7’de görüntülenmeye hazırdır (Şekil 2). 3. Canlı hücre görüntüleme için hücrelerin hazırlanması NOT: Hücre tipleri ve orijini (yani, kültürlenmiş ve birincil hücreler) boyama gereksinimlerine göre farklılık gösterebilir; Daha fazla ayrıntı için yayınlanmış raporlara bakın62,63. PKmito Portakal HazırlanışıNOT: Genel olarak İBB’yi lekeleyen diğer boyalar64,65,66 olarak bildirilmiştir ve ticari olarak temin edilebilir. PKMO, bu protokolde kullanılan tek protokoldür.Toz PKMO’yu (Malzeme Tablosuna bakın) üreticinin talimatlarına göre DMSO’da yeniden süspanse edin89. Ortamı hücrelerden aspire edin ve önceden ısıtılmış fenol kırmızısı içermeyen ortamda yıkayın. Farklılaşma durumuna bağlı olarak %2 (h/h) FBS veya (h/v), 20 mM’lik nihai konsantrasyona kadar HEPES ve %1 (h/h) antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış, fenol kırmızısı içermeyen DMEM’de bir PKMO stoğu hazırlayın. PKMO içermeyen bu formülasyon, canlı hücre görüntüleme ortamıdır. PKMO ile hücre boyamaHücreleri boya ile 37 ° C’de ve% 5CO2’de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri canlı hücre görüntüleme ortamıyla üç kez yıkayın ve son yıkama için 37 ° C’de,% 5 CO2’de 30 dakika inkübe edin. Taze, önceden ısıtılmış canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin. Hücreler artık görüntüleme için hazırdır.NOT: Akut tedaviler (ör., ilaçlar ve/veya stresörler), kullanıldığında, canlı görüntülemeden önce eklenir; Tartışma bölümüne ve Ek Şekil 1’e bakın. 4. STED mikroskobu ile canlı hücrelerin görüntülenmesi NOT: Bu protokol, Malzeme Tablosunda belirtilen sistemle ters çevrilmiş bir mikroskop etrafında inşa edilmiş bir STED sistemi kullanır. Bu sistem, darbeli uyarma lazerleri (nominal güç ~300 μW ile 561 nm lazer) ve darbeli 775 nm STED tükenme lazeri (nominal güç 1,2 W), sürekli ayarlanabilir bir galvano tarayıcı ve 615/20 nm filtre tabanlı çığ fotodiyot dedektörü (APD) ile donatılmıştır. Burada STED için 100x/1.40 yağa daldırma lensi kullanılmıştır. Görüntü alımı için Lightbox yazılımı kullanılır. Sağlanan tüm detaylar doğrudan bu yazılım ve sistem kurulumu ile ilgilidir. Görüntüleme için genel yönergeler ve adımlarHücre canlılığını korumak için bir sahne üstü inkübatör veya çevre odası kullanın, ancak kısa süreli oda sıcaklığı deneyleri de kabul edilebilir. Bu adımlar, yukarıda açıklanan STED kurulumuna özgüdür. Görüntüleme için lazer ve filtre setlerini seçin.Boya Listesinden boyamada kullanılan boyayı/boyaları veya kullanılan boyaya/boyalara en yakın spektral özelliklere sahip olanı seçerek turuncu boya için parametreleri kullanın. Bunları, çift tıklayarak veya “Boyaları buraya sürükleyin” yazan örnek listeye sürükleyerek etkinleştirin. Görüntülemek için bir bölge seçin.Genel bakışta, dikdörtgen ROI düğmesini seçip bölgeyi şekillendirmek için tıklayıp sürükleyerek ilgilenilen bir mitokondri etrafında bir ilgi alanı ( ROI ) oluşturun. ROI, fareyi bir köşenin üzerine getirdiğinizde görünen ROI köşeleri veya kavisli kenarlar kullanılarak yeniden boyutlandırılabilir ve döndürülebilir.NOT: Önerilen görüntüleme parametrelerinin bir özeti Tablo 1’de bulunabilir. Bu parametreler, bu STED kurulumu ve boya kombinasyonu63 için daha önce bildirilenler kullanılarak ampirik olarak ayarlanmıştır. Geçitlemeyi ayarlayın.Genel menüsünün yanında, Geçit menüsünü seçin veya menüyü görünüme eklemek için tıklayıp basılı tutun. STED dedektör kapısının burada sunulduğu gibi 1-1.05 ila 7.8-7.85 ns’ye ayarlanması önerilir. Geçit süreleri değişebilir ve 1-1.05 ila 7-7.05 ns kadar kısa olabilir. Yoğunluğu örneğe göre uygun şekilde ayarlayın.NOT: Genel olarak, STED için kullanılan uyarma gücü, konfokal için kullanılan gücün 2-3 katıdır, bu nedenle konfokal için %5 uyarma lazer gücü gerektiren bir numune, STED alımı sırasında -15 uyarma lazer gücü kullanabilir.STED için uyarma lazerini -20’ye ve STED tükenme lazerini 10 çizgi birikimi ile -25’e ayarlayın. Piksel boyutu 20-25 nm olan 4 μs’lik bir piksel bekleme süresi kullanın. İğne deliği, daha yoğun paketlenmiş mitokondride optik kesitlemeyi iyileştirmek için kültürlenmiş hücreler için 1.0 AU’da ve birincil sıçan hipokampal hücreleri için 0.7 AU’da tutuldu.NOT: Yan yana karşılaştırma için konfokal ve STED görüntülerin her ikisi de elde edilebilir (Şekil 3A, B, Şekil 4A) veya yalnızca STED elde edilebilir. Zaman serisi/z serisi için ek bilgilerZaman serisini seçin.Zaman açılır menüsünü seçin. Timelapse için istenen yineleme sayısını (burada 5 kullanılır) ve zaman aralığını (burada 25 veya 30 s kullanılır) tanımlayın (Şekil 3C, D, Şekil 4B).NOT: Aralık, alım süresinden daha kısaysa, yinelemeler herhangi bir gecikme olmadan devam eder. Timelapse gerçekleştirirken, olası sapmayı önlemek için mükemmel bir odak ünitesi veya benzer bir odak takibi kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Ses aralığını ayarlayın.Volume seçeneğini etkinleştirerek ve aralığın iki ucunu ayarlayarak z-volume aralığını istediğiniz gibi ayarlayın. Bu protokolde 2D görüntüleme için kullanılan adım boyutları 150-200 nm idi. Ham STED’in evrişiminin giderilmesi için gerekli olan Nyquist örneklemesine göre önerilen adım boyutu, çevrimiçi araçlarlahesaplanabilir 90.NOT: STED tükenme lazer gücü ve görüntülenen düzlem sayısı, boya fotoağartmasını ve hücreye ışık maruziyetini zararlı seviyelere çıkarabilir. Edinimden sonra fototoksisite ve fotohasar belirtileri olup olmadığını kontrol edin. 5. Mitokondriyal üst yapı için işleme ve analitik araçlar NOT: Görüntü işleme (yani, evrişim devolüsyon) isteğe bağlıdır, ancak genellikle yayın için STED görüntüleri oluştururken ve analiz ederken kullanılır. Kontrastı iyileştirmek ve gürültüyü azaltmak için dekonvolüsyon, aşağıda açıklandığı gibi, bireysel kristaların optimal segmentasyonu için şiddetle tavsiye edilir (Şekil 2). STED görüntü evrişim dekonvolüsyonuNOT: Bu protokolde evrişimi gidermek için kullanılan yazılım Malzeme Tablosunda verilmiştir.Görüntünün mikroskobik parametrelerini ayarlayın.NOT: Mikroskop meta verilerinin görüntü Mikroskobik Parametrelerine doğru girildiğinden emin olun. Bu, montaj ortamı kırılma indisini içerir; daldırma ortamı; piksel boyutu; uyarma, emisyon ve tükenme dalga boyları; ve diğer ilgili bilgiler. Bu parametrelere sahip şablonlar yeniden kullanım için kaydedilebilir. Yazılım algoritması ile ham STED görüntülerini deconvolute.Dekonvolüsyon yazılımındaki otomatik dekonvolüsyon algoritmalarına erişim, uygulamalı dekonvolüsyon görüntü işlemeye izin verir. Ekspres düğmesini seçin ve çeşitli derecelerde evrişim gücü için evrişim türünü Hızlı, Standart, Agresif veya Muhafazakar olarak ayarlayın. Agresif ayarlarla Ekspres Evrişim kullanan temsili görüntüler gösterilmektedir (Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5). Evrişim çözme yazılımındaki görüntüleri ICS2 formatında kaydedin. El ile evrişim için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.Kısaca, el ile evrişim açma işlemi gerçekleştirirken, tutarlılık için evrişim sihirbazı şablonlarını kaydedin ve sihirbazı başlattıktan sonra bir şablon yükleme seçeneğine sahip olun. Alım kurulumu ve parametreleriyle oluşturulmuşsa, ölçülen nokta yayılma işlevi (PSF) bilgilerini kullanın. Evrişim yazılımının görüntüyü otomatik olarak stabilize etmesini sağlamadan önce gerekirse ham STED görüntüsünü kırpın. Evrişim giderme yazılım paketlerine yapılan eklentiler, termal sapma ve renk sapmaları gibi olası görüntüleme artefaktlarının belirli bir şekilde telafi edilmesini sağlar. Ardından, arka plan çıkarma işlemini manuel veya otomatik olarak gerçekleştirmek için logaritmik bir histogram oluşturun. Klasik en yüksek olabilirlik tahmini (CMLE) evrişim çözme algoritmasını seçin.NOT: Evrişim için ayarlanacak temel değerler sinyal-gürültü oranı eşiği, yineleme sayısı ve kalite eşiğidir. Bu değerler ayarlanabilir ve en uygun ayarları belirlemek için evrişimin önizlemesi yapılabilir. Segmentasyon ve partikül analiziNOT: Bu protokol, açık kaynaklı bir yazılım olan FIJI’yi (Is Just ImageJ) kullanır (bkz. Malzeme Tablosu), segmentasyon ve analiz için. CellProfiler, Icy, Ilastik ve QuPath dahil olmak üzere diğer karşılaştırılabilir yazılımlar bu amaçlar için kullanılabilir.Görüntüleri segmentasyon için hazırlayın.Dosya → Aç’a giderek veya dosyaları tıklayıp ImageJ araç çubuğuna sürükleyerek evrişim yazılımından .obf ham STED görüntülerini veya .ics2 dosyalarını açın. Buradan, görüntülerin segmentasyona ayrılmasını kolaylaştıran herhangi bir işlem, segmentasyondan önce gerçekleştirilebilir. Değişikliklerin tutarlı olmasını sağlamak için, Eklentiler → Makrolar’ı kullanarak işlevleri kaydedin → Eklentiler → Yeni → Makrosu’ndan anahtar komutları kaydedin ve kopyalayıp kopyalayıp yeni bir makroya yapıştırın. Makroyu çalıştırmadan önce işlenecek görüntüyü seçtiğinizden emin olun.NOT: Boyut ve şeklin nicelleştirilmesi için yaygın olarak kabul edilen değişiklikler arasında kırpma, z yığını yansıtma ve yumuşatma devre dışı bırakılmış arka plan çıkarma yer alır. Değişiklikler, bir veri seti içindeki görüntüler arasında tutarlı bir şekilde yapılmalı ve raporlanmalıdır. Eğitilebilir Weka Segmentasyon Ayarlarını YapınNOT: Yarı otomatik segmentasyon aracının kullanımı ve mitokondri için aşağı akış analizleri için adım adım talimatlar içeren ek ayrıntılar yayınlanmıştır91.Eklentiler → Segmentasyon ve Eğitilebilir Weka Segment→asyonu altında bulunan Eğitilebilir Weka Segmentasyonu (TWS)92 eklentisinde dekonvolved STED görüntülerini açın. Segmentasyon Ayarları’nda Gauss bulanıklığı, membran projeksiyonları ve Sobel filtresi özelliklerini seçin. Varsayılan membran kalınlığı 1’dir ve membran yama boyutu varsayılanı 19’dur. Sınıf 1 veya 2’yi “Cristae” ve diğerini “Arka Plan” olarak etiketleyin (Şekil 2). Modeller ayrıca Sınıflandırıcıyı kaydet düğmesiyle de kaydedilebilir. Bu ayarları diğer görüntülerde yeniden kullanmak için Yük sınıflandırıcısını seçin. TWS sınıf izlemeleri gerçekleştirin.Çizginin veya arka planın bir kısmını vurgulamak için çizgi aracını veya diğer şekilleri kullanın. En azından bazı arka plan seçimleri, cristae arasında boşluklar içermelidir. Her iki sınıfa da atamak için yapının üzerine bir çizgi çizin, ardından cristae veya arka plan için sağ taraftaki Ekle düğmesini seçin. Yapıyı bu etiketten kaldırmak için bir izlemeye çift tıklayın. TWS sınıflandırma eğitimi gerçekleştirin.Eklentiye sağlanan bilgilere dayalı olarak bir harita oluşturmak için sol taraftaki Sınıflandırıcıyı eğit düğmesini seçin. Segmentlere ayrılmış sınıfların kaplaması, Kaplamayı Değiştir düğmesiyle açılıp kapatılabilir ve kaplamanın opaklığı Ayarlar’da ayarlanabilir. Sınıflandırıcı ek etiketlerle yeniden eğitilebilir. Memnun kaldığınızda, Olasılığı Al düğmesini seçin. Parçacıkları ölçün.Cristae olasılık haritasını kullanarak, bir maske oluşturmak için görüntünün eşiğini alın ve ardından Parçacıkları Analiz Et → Analiz Et’e gidin. Genel olarak, varsayılan eşik türü kullanılabilir ve tüm kristaların hesaba katılmasını sağlamak için aralık ayarlanabilir. Partiküllerin analiz edilmesiyle sağlanan ölçümler, Analiz → Set Ölçümleri ile ayarlanabilir.NOT: Cristae’nin alanı, çevresi, daireselliği ve en boy oranı gibi boyut ve şekil parametrelerinin örnekleri, seçilen ölçümlere göre ölçülür ve görüntülenir (Şekil 2, Şekil 5A, Ek Tablo 1). İSTEĞE BAĞLI: Döngüden çıkarılmış görüntüyle aynı boyutlara sahip ham STED görüntüsünü seçin ve yöneticiden ROI’leri uygulayın, ardından yoğunluk değerlerini elde etmek için ROI yöneticisinde Ölç’ü seçin. Çizgi grafikleri elde edin.Çizgi grafikleri, dekonvolved STED görüntülerinden oluşturuldu. Çok noktalı bir çizgi çizin, gürültünün ortalamasını almak için çizgi kalınlığını birkaç piksel genişliğe ayarlayın ve çizgiyi mitokondriye sığacak şekilde eğrin (Şekil 2, Şekil 5B). Elde edilen çizgi grafiği, belirli bir aralıktaki cristae’nin periyodikliğini ve dağılımını bildirmek için tepeden tepeye mesafeleri ölçmek için kullanılır.NOT: İlgili olarak, cristae yoğunluğu, mitokondrinin dış kısmı ölçülerek belirlenen belirli bir alandaki bağımsız cristae sayısı olarak rapor edilebilir. Mitokondriyal alan, bir maske oluşturmak için dekonvolved veya ham STED görüntüsüne bir filtre uygulanarak belirlenebilir. Alanı ölçmeden önce maskenin mitokondrinin ana hatlarına tam olarak uyduğundan emin olun.

Representative Results

Bu protokol, canlı hücre STED görüntülemesine ve ardından mitokondriyal krista analizlerine odaklanarak kültürlenmiş ve birincil hücreler için hücre büyüme koşullarını açıklar. Farklılaşmamış SH-SY5Y (Şekil 3A) ve RA ile farklılaşmış SH-SY5Y (Şekil 3B) hücrelerinden mitokondri ImageJ ile yapılan projeksiyonlar, geleneksel konfokal ve STED ile z-yığınları olarak toplanabilir ve ham STED görüntüleri daha sonra dekonvolvasyon yapılabilir. Timelapse görüntüleme de yapılabilir ve daha sonra dekonvolvasyon yapılabilir (Şekil 3C,D). Primer sıçan hipokampal nöronları için biraz farklı görüntüleme parametreleri kullanılarak (Tablo 1), konfokal ve ham STED görüntüleri z-yığınları olarak elde edilebilir ve ham STED görüntüleri dekonvolvasyon yapılabilir (Şekil 4A). Primer nöronlardan mitokondrinin timelapse görüntülenmesi de mümkündür (Şekil 4B). Genel olarak, hızlandırılmış görüntüler mitokondriyal dinamik olayları gösterebilmelidir. Segmentasyon için kullanılan örneklerden ham STED ve dekonvolved STED z-yığını projeksiyonları tutarlı göründüğünde, kantitatif ölçümler gerçekleştirilir. TWS eklentisi, bir olasılık maskesi yapmak için bölümlere ayırmak için dekonvolved STED görüntüsünü kullanır ve bu daha sonra boyut ve şekil parametreleri elde etmek için cristae’nin ikili bir maskesini oluşturmak için kullanılır (Şekil 5A). Bu maskedeki bölgeler ROI yöneticisine kaydedilir ve göreli yoğunluktaki farklılıkları ölçmek için istenirse ham STED görüntüsüne uygulanabilir. Dekonvolved STED projeksiyonları, belirli bir alandaki kristae periyodikliğini ve yoğunluğunu belirlemek için de kullanılabilir (Şekil 5B). Şekil 1: Mitokondriyal morfoloji. Mitokondri, farklı alt bölmeleri (A) tanımlayan iki zarlı bir sisteme sahiptir. Cristae, tanımlanmış özelliklere (B) sahip iç zarın kıvrımlarıdır. Kısaltmalar: OMM, dış mitokondriyal membran; ICS, intrakristal uzay; IMS, zarlar arası boşluk; CM, cristae membranı; IBM, iç sınır zarı; IMM, iç mitokondriyal membran; CT, cristae ucu; CJ, cristae kavşağı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: İş akışının şeması. SH-SY5Y hücreleri veya birincil sıçan hipokampal nöronları, PDL kaplı bir kapak camı üzerinde büyütülür. SH-SY5Y hücreleri, farklılaşmadan kalacak şekilde paralel olarak büyütülür veya altı gün boyunca RA farklılaşmasına maruz kalır. Birincil sıçan hipokampal nöronları, yedi gün boyunca hipokampal bölümlerden izole edildikten sonra PDL kaplı bir kapak camı üzerinde büyütüldü. Görüntülenmeye hazır olduğunda, hücreler PKMO ile boyandı ve STED ile görüntülendi. Ham STED görüntüleri daha sonra dekonvolvasyona tabi tutulur ve dekonvolvasyonlu görüntüler, cristae yoğunluğu, alan, çevre, dairesellik ve en boy oranı gibi boyut ve şekil ölçümleri elde etmek için FIJI’de işlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: SH-SY5Y hücrelerinde mitokondrinin görüntülenmesi. PKMO boyamalı farklılaşmamış (A) ve RA farklılaşmış (B) SH-SY5Y hücrelerinden mitokondrinin temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve Huygens dekonvolvasyonlu STED görüntüsü z-yığını projeksiyonları (sağda) gösterilmektedir. 30 sn aralıklarla ve RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin 5 yinelemesine sahip bir zaman atlamalı (C) gösterilir (C) seçilen bölgeler (beyaz kutular) genişletilerek (D) bu bölgelerin enterpolasyon olmadan ölçeklendirilmiş görüntüleri kullanılarak. Ölçek çubukları: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Primer sıçan hipokampal nöronlarında mitokondrinin görüntülenmesi. Temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve Huygens dekonvolved STED (sağda) görüntüsü primer sıçan hipokampal nöronlarından mitokondrinin z-yığını projeksiyonları gösterilmiştir (A). Bu nöronlarda 25 s aralıklarla ve 5 mitokondri yinelemesi ile bir timelapse gösterilmiştir (B). Ölçek çubukları: A, 250 nm; B, 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: ImageJ’de dekonvolved STED görüntülerinin işlenmesi. Cristae boyutunu ve şeklini ölçmek için Eğitilebilir Weka Segmentasyon eklentisinin temsili kullanımı gösterilmiştir (A). Soldan sağa, aşağıdaki görüntüler gösterilir: dekonvolved görüntüsü, TWS eklentisinden segmentasyona dayalı olasılık haritası, olasılık haritasını girdi olarak kullanarak FIJI’de eşiklemeden maske, ROI’lerin ana hatlarıyla belirtildiği maske ve ROI’ler orijinal dekonvolved STED görüntüsünün üzerine bindirilir. Bu nesnelere karşılık gelen alan, çevre, dairesellik ve en boy oranı ölçümleri Ek Tablo 1’de bulunabilir. Cristae yoğunluğu için bir okuma olarak tepeden tepeye mesafeleri ölçmek için dekonvolved STED görüntüsünü kullanan bir çizgi grafiği gösterilir (B). Ölçek çubukları: 0,5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Piksel boyutu (nm) Bekleme süresi (μs) Hat acc. STED edinimi sırasında 561 nm uyarılma (%) 775 nm STED tükenme gücü (%) Adım boyutu (nm) İğne deliği (AU) Timelapse aralık(lar)ı Zaman atlamalı yinelemeler Farksız SH-SY5Y 20 4 10 15 20 200 1.0 30 5 RA-Diferansiyel SH-SY5Y 20-25 4 10-12 15 20-22 150-200 1.0 30 5 Birincil Nöronlar 20-25 4 10 10 25 200 0.7 30 5 NOT: Piksel boyutu, görüntüleme gereksinimlerine ve görüntülerin bulanıklığını giderme amacına bağlı olarak değişebilir. Dekonvolüsyon için uygun örnekleme gereklidir. Evrişim olmadan ham STED görüntüler için piksel boyutları 30 nm’ye kadar çıkabilir. Tablo 1: STED edinme parametrelerinin özeti. Her hücre tipi, farklılaşmamış SH-SY5Y, RA ile farklılaşmış SH-SY5Y ve primer sıçan hipokampal nöronları için 2D STED görüntüleme için kullanılan ayarlar görüntülenir. Tüm zaman atlamaları için, ROI boyutuna göre değişen aralıklarla 5 yineleme alındı. Ek Şekil 1: SH-SY5Y hücrelerinin amiloid-β (Aβ) ilavesi ile görüntülenmesi. PKMO boyası (üstte) ve Aβ-HiLyte647 (altta) ile RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve dekonvolvasyonlu STED (sağda) görüntüleri gösterilmektedir (A). Ham Aβ STED (macenta) (B) ile ham PKMO STED (yeşil) veya dekonvolved Aβ STED (macenta) (C) ile dekonvolved PKMO STED’in (yeşil) birleştirilmiş z-yığını projeksiyonları gösterilmektedir. Ölçek çubukları: 0,5 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 1: Parçalı cristae’nin boyut ve şekil ölçümleri. Segmentli mitokondriden Şekil 5A’da özetlenen nesnelere karşılık gelen alan (μm2), çevre (μm), dairesellik ve en boy oranının boyut ve şekil ölçümleri gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Tablo 2: Amiloid β numuneleri ile edinim parametrelerinin özeti. Farklılaşmamış ve RA farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinde PKMO ve Aβ-HiLyte647’nin 2D STED görüntülemesi için kullanılan ayarlar görüntülenir. Aβ-HiLyte647’nin konfokal olması, çözülecek belirli bir yapı olmadığı için tek başına kullanılabilir; Aβ-HiLyte647’nin STED görüntüleri, daha küçük parçacık boyutları için burada gösterilmektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Amiloid β tedavi protokolü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, canlı hücre STED görüntüleme için yeni IMM-hedeflemeli PKMO boyası ile insan nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y ve primer sıçan hipokampal nöronlarının kullanımını sunar. PKMO’nun yeniliği nedeniyle, şu anda canlı STED görüntüleme için bu boyayı kullanan çok az yayın var. STED görüntüleme için bu hücre tiplerini kullanmak, özellikle nöronal hücrelerin daha dar mitokondriye sahip olması nedeniyle zorluklar doğurur. Bu protokolün bir sınırlaması, hücreler için toksik olabileceğinden kullanılan PKMO boyasıdır. Farklı hücreler ve hücre hatları boyaya farklı tepki verir, bu nedenle, hücrelere zarar vermeden güçlü sinyal için sonuçları optimize etmek için boya konsantrasyonunda ve inkübasyon süresinde ayarlamalar gerekebilir. Önerilen bir çözüm, konsantrasyonu düşürmek ve boyama süresini^{arttırmaktır 63}; Bununla birlikte, bu, hücre canlılığını artırmadan daha zayıf boyamaya neden olabilir.

PKMO’ya benzer şekilde, ticari boya Live Orange mito (Malzeme Tablosu) da bir miktar hücre toksisitesi sergiler. Bu boya, çeşitli kültürlenmiş hücreler için kullanıldı, ancak RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinde, farklılaşmamış muadilleriyle aynı parametrelerle (yayınlanmamış gözlemlerimiz) başarılı bir şekilde karşılaştırılabilir boyama sergileyemedi. Bununla birlikte, uygun boyama protokolleri bu prob ve seçilen hücre tipleri için optimize edilebilir. Bu boya ile 1-1.05 ila 7-7.05 ns dedektör geçit süreleri kullanılmış ve Tablo 1’deki diğer tüm parametreler aynı kalmıştır. Genel olarak, 45 dakika boyunca 200-250 nM Canlı Turuncu mito ile boyama hücreleri, PKMO sonuçlarının gösterdiği gibi karşılaştırılabilir sonuçlar verdi. Daha az süre için daha yüksek konsantrasyonlu boyama veya aynı süre veya biraz daha uzun süre için daha düşük konsantrasyonlu boyama farklı sonuçlar verebilir ve diğer hücre tipleri veya büyüme koşulları için uygun olabilir.

Primer sıçan hipokampal nöronlarının görüntülenmesi, akson ve dendrit projeksiyonlarının doğası ve görüntüleme sırasındaki mitokondriyal dağılım nedeniyle ölümsüzleştirilmiş hücrelerden farklıdır. Protokolün bu bölümündeki bir zorluk, tohumlama yoğunluğunun, birincil kültürlerin sağlıklı bir şekilde yapışıp büyüyemeyeceğini belirlemesi ve daha yüksek yoğunluklarda, projeksiyonların DIV 10 tarafından aşırı büyüme eğiliminde olmasıdır. Bu nedenle, bu birincil nöronlardan görüntülenen mitokondri muhtemelen çıkıntılardan değil hücre gövdesinden gelecektir; Bununla birlikte, daha düşük bir başlangıç hücre yoğunluğundan başarılı bir büyüme, daha sonraki büyüme zamanlarında daha iyi görüntüleme sonuçları verir. Önemli olan, STED için en iyi kontrasta sahip olmak için düşük arka plan ve odak dışı ışık sağlamaktır. Hücre popülasyonu ile ilgili endişeleri gidermek için, B27 takviyeli nöron büyüme ortamında birincil hipokampal hücrelerin kültürlenmesi, glial hücrelerin büyümesini önler ve kaynak, hücrelerin %<5'inin astrosit olduğunu ve büyüme ortamında NbActiv1 takviyesinin bulunmamasının kültürlerdeki astrosit sayısını %<2'ye düşürdüğünü ^{bildirmektedir87}. Hem kültürlenmiş SH-SY5Y hücreleri hem de birincil sıçan hipokampal nöronları için, büyüme için kullanılan PDL kaplaması, görüntülerde arka plan bulanıklığına katkıda bulunur. (Tablo 1)’de bildirilen ayarlarla yeterli sinyal-gürültü gerçekleştirilir ve evrişim giderme, gözlemlenen arka planın çoğunu kaldırır.

Burada ele alınan görüntülemeye ek olarak, görüntüleme öncesinde veya sırasında hücrelere tedaviler veya stres eklemek de mümkündür. Örneğin, tert-bütil hidrojen peroksit (tBHP) eklenmesi oksidatif strese neden olur ve ilaveden sonra zaman içinde mitokondrideki değişiklikleri izlemek mümkündür. Bir floresan etiketli amiloid-β (Aβ) ilavesi, bu peptidin zaman içinde mitokondri ve mitokondriyal yapı ile ilgili dağılımının izlenmesini sağlar. Mitokondriyal sağlık, AD’de yoğun bir şekilde yer almaktadır ve Aβ toksisitesinde^rol oynadığı yaygın olarak desteklenmektedir 43,71,72. Özellikle, SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşma durumu, Aβ protein öncüsü (AβPP) lokalizasyonunu^{etkiler 85} ve AβPP kullanan deneyler dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Bu protokolün nasıl uyarlanabileceğine bir örnek olarak, floresan varyantı Aβ (1-42) -HiLyte 647’nin görüntülemeden 15 dakika önce PKMO lekeli hücrelere eklenebileceği gösterilmiştir (Ek Şekil 1). Görüntüleme parametreleri benzerdir (Ek Tablo 2), temel fark, daha dar mitokondriyi görüntülerken daha küçük bir iğne deliğine ihtiyaç duyulmasıdır. Aβ-HiLyte647’nin STED ile görüntülenmesi, daha az genel uyarılma (% 6 -% 8) ve STED tükenmesi (% 10 -% 12) lazer gücü ve daha az birikim gerektirir (altı). Dedektör kapısı da 0,1’den 10 ns’ye uzatılmıştır. Aβ’nın STED çözünürlüğü gerekli olmasa da, ham STED’in genel sinyal-gürültü oranı ve Aβ partikül boyutu, konfokal görüntülerinkinden daha iyiydi ve daha sonra evrişim de gerçekleştirilebilir. STED görüntülerinin toplanması ve Aβ’nın ham STED z-yığını projeksiyonlarının ayrıştırılması, PKMO lekesinin ham STED veya dekonvolved STED görüntüleri ile birleştirilirken özellikle yararlı görünmektedir (Ek Şekil 1B, C). Her iki kanal da tek bir kare adımında toplandı. Şekil 2’de listelenenlere ve Şekil 5’te gösterilenlere benzer zamana bağlı lokalizasyon ölçümleri ve uygun olduğunda cristae mimarisi farklılıkları, stres tedavisi veya diğer eklemelerin ardından elde edilebilir.

Burada bildirilmeyen ancak başkaları tarafından bildirilen mitokondrinin canlı hücre STED’inde çift etiketleme için diğer olası yöntemler arasında SNAP etiketli proteinlerin⁹³, Halo etiketli proteinlerin kullanımı ve mtDNA⁶³ gibi jenerik hedeflere sahip diğer hücre geçirgen boyaların kullanımı yer alır. Özellikle, SNAP ve Halo etiketlemenin etiketleme stratejisi,^94’ü görüntülerken ortaya çıkan floresan sinyal yoğunluğunu ve uzun ömürlülüğünü etkiler. Ek olarak, bu protokol, bölümlere ayrılmış mitokondriye uygulanabilecek birkaç analiz örneği sunarken, yazılım paketlerinin bu görüntüler üzerinde gerçekleştirebileceği birçok başka analiz vardır.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Primer sıçan hipokampal nöronları, Connecticut Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü’nden Dr. George Lykotrafitis ve Shiju Gu tarafından sağlandı (Storrs, CT, ABD). Açık Araştırma Kaynakları ve Ekipmanları Merkezi’ndeki Gelişmiş Işık Mikroskobu Tesisinde bulunan Abberior STED cihazı, NIH hibesi ile satın alındı S10OD023618 Christopher O’Connell’e verildi. Bu araştırma NIH hibesi tarafından finanse edildi R01AG065879 Nathan N. Alder’a verildi.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	25300054
0.4% Trypan blue	Invitrogen	T10282
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red	Gibco	15400054
100 X antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens	Olympus		Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4
All-trans-retinoic acid	Sigma	R2625
Amyloid-β (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)	AnaSpec	AS-64161	Other fluorescent conjugates available
B27 supplement (50 X), serum free	Gibco	17504044
Cell Counter (Countess II FL)	Life Technologies	AMQAF1000
Centrifuge	Eppendorf	5804-R
Counter slides	Invitrogen	C10283
Conical tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	339650
Cuvettes (Quartz Cells)	Starna Cells, Inc.	9-Q-10	Used with Spectrometer as described in Section 1.3
DMEM (high glucose with sodium pyruvate)	Gibco	11995073	Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1
DMEM (high glucose no sodium pyruvate)	Gibco	11965092	Used for primary cell materials as described in Section 2
DMEM (phenol red-free)	Gibco	31053028	Used for imaging as described in Section 3
DMSO	Sigma	D8418
DNAase I from bovine pancreas	Sigma	DN25	Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2
DPBS (no calcium, no magnesium)	Gibco	14190144
E18 Rat Hippocampus	Transnetyx Tissue	SDEHP
Ethanol (200 proof)	Fisher Bioreagents	BP28184
Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated	Gibco	26140079	For cultured cells, in Section 1
Fetal bovine serum (heat inactivated)	Gibco	10082147	For primary cell culture, Section 2
Filter sterilization unit (0.1 µm, 500 mL)	Thermo Fisher Scientific	5660010
FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in	—	—	Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text
GlutaMAX supplement (100 X)	Gibco	35050061	Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2
Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers	Hausser Scientific	267110
HBSS (no calcium, no magnesium)	Gibco	14170120	Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2
HEPES	Gibco	15630080
Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)	Scientific Volume Imaging (SVI)	—	The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5
IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus	Olympus	—	This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4
Lightbox software (V. 16.3.16118)	Abberior	—	Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4
Live Orange Mito dye	Abberior	LVORANGE-0146-30NMOL	Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion
Neurobasal media	Gibco	21103049	Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2
Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass	Nunc	155379	Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5
Pasteur Pipets (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22183632
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
PKmito Orange dye	Spirochrome	SC053
Poly-D-lysine	Gibco	A3890401
SH-SY5Y Cell line	ATCC	CRL2266
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070	Used for primary cell materials described in Section 2
Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)	Thermo Fisher Scientific	840309000
STED Expert Line microscope	Abberior	—	STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior’s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol
T25 flask (TC-treated, filter cap)	Thermo Fisher Scientific	156367	Other culture vessels and sizes available

References

Iovine, J. C., Claypool, S. M., Alder, N. N. Mitochondrial compartmentalization: emerging themes in structure and function. Trends in Biochemical Sciences. 46 (11), 902-917 (2021).
Gupta, A., Becker, T. Mechanisms and pathways of mitochondrial outer membrane protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1862 (1), 148323 (2021).
Gordaliza-Alaguero, I., Cantó, C., Zorzano, A. Metabolic implications of organelle-mitochondria communication. EMBO Reports. 20 (9), e47928 (2019).
Klecker, T., Westermann, B. Pathways shaping the mitochondrial inner membrane. Open Biology. 11 (12), 210238 (2021).
Navarro, A., Boveris, A. The mitochondrial energy transduction system and the aging process. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (2), C670-C686 (2007).
Yu, R., Lendahl, U., Nistér, M., Zhao, J. Regulation of mammalian mitochondrial dynamics: opportunities and challenges. Frontiers in Endocrinology. 11, 374 (2020).
Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. The Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Frontiers in Physiology. 11, 541040 (2020).
Bahat, A., et al. MTCH2-mediated mitochondrial fusion drives exit from naïve pluripotency in embryonic stem cells. Nature Communications. 9 (1), 5132 (2018).
Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial fusion/fission dynamics in neurodegeneration and neuronal plasticity. Neurobiology of Disease. 90, 3-19 (2016).
Zemirli, N., Morel, E., Molino, D. Mitochondrial dynamics in basal and stressful conditions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 564 (2018).
Harwig, M. C., et al. Methods for imaging mammalian mitochondrial morphology: a prospective on mitograph. Analytical Biochemistry. 552, 81-99 (2018).
Pánek, T., Eliáš, M., Vancová, M., Lukeš, J., Hashimi, H. Returning to the fold for lessons in mitochondrial crista diversity and evolution. Current Biology. 30 (10), R575-R588 (2020).
Gottschalk, B., Madreiter-Sokolowski, C. T., Graier, W. F. Cristae junction as a fundamental switchboard for mitochondrial ion signaling and bioenergetics. Cell Calcium. 101, 102517 (2022).
Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
Frezza, C., et al. OPA1 controls apoptotic cristae remodeling independently from mitochondrial fusion. Cell. 126 (1), 177-189 (2006).
Meeusen, S., et al. Mitochondrial inner-membrane fusion and crista maintenance requires the dynamin-related GTPase Mgm1. Cell. 127 (2), 383-395 (2006).
Patten, D. A., et al. OPA1-dependent cristae modulation is essential for cellular adaptation to metabolic demand. The EMBO Journal. 33 (22), 2676-2691 (2014).
Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO Journal. 21 (3), 221-230 (2002).
Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of nonbilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of Cell Biology. 30 (2), 269-297 (1966).
Dlasková, A., et al. Mitochondrial cristae narrowing upon higher 2-oxoglutarate load. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1860 (8), 659-678 (2019).
Pérez-Hernández, C. A., et al. Mitochondrial ultrastructure and activity are differentially regulated by glycolysis-, krebs cycle-, and microbiota-derived metabolites in monocytes. Biologie. 11 (8), 1132 (2022).
Mannella, C. A. Structural diversity of mitochondria: functional implications. Annals of the New York Academy of Sciences. 1147, 171-179 (2008).
Plecitá-Hlavatá, L., Ježek, P. Integration of superoxide formation and cristae morphology for mitochondrial redox signaling. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 31-50 (2016).
Scorrano, L., et al. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Developmental Cell. 2 (1), 55-67 (2002).
Heath-Engel, H. M., Shore, G. C. Mitochondrial membrane dynamics, cristae remodelling and apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 549-560 (2006).
Brandt, T., et al. Changes of mitochondrial ultrastructure and function during ageing in mice and Drosophilia. eLife. 6, e24662 (2017).
Kondadi, A. K., et al. Cristae undergo continuous cycles of membrane remodelling in a MICOS-dependent manner. EMBO Reports. 21, e49776 (2020).
Quintana-Cabrera, R., Mehrotra, A., Rigoni, G., Soriano, M. E. Who and how in the regulation of mitochondrial cristae shape and function. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 94-101 (2018).
Nielsen, J., et al. Plasticity in mitochondrial cristae density allows metabolic capacity modulation in human skeletal muscle: Enlarged mitochondrial cristae density in athletes. The Journal of Physiology. 595 (9), 2839-2847 (2017).
Afzal, N., Lederer, W. J., Jafri, M. S., Mannella, C. A. Effect of crista morphology on mitochondrial ATP output: A computational study. Current Research in Physiology. 4, 163-176 (2021).
Heine, K. B., Parry, H. A., Hood, W. R. How does density of the inner mitochondrial membrane influence mitochondrial performance. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 324 (2), R242-R248 (2023).
Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: a key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24, 1583 (2019).
Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Human Molecular Genetics. 20 (23), 4515-4529 (2011).
Petersen, C. A. H., et al. The amyloid beta-peptide is imported into mitochondria via the TOM import machinery and localized to mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (35), 13145-13150 (2008).
Gan, X., et al. Inhibition of ERK-DLP1 signaling and mitochondrial division alleviates mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease cybrid cell. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease. 1842 (2), 220-231 (2014).
Baloyannis, S. J., Costa, V., Michmizos, D. Mitochondrial alterations Alzheimer’s disease. American Journal of Alzheimer’s Disease & Other Dementias. 19 (2), 89-93 (2004).
Tillement, L., Lecanu, L., Papadopoulos, V. Alzheimer’s disease: Effects of β-amyloid on mitochondria. Mitochondrion. 11 (1), 13-21 (2011).
Choi, S. Y., et al. C9ORF72-ALS/FTD-associated poly(GR) binds Atp5a1 and compromises mitochondrial function in vivo. Nature Neuroscience. 22 (6), 851-862 (2019).
Smith, E. F., Shaw, P. J., De Vos, K. J. The role of mitochondria in amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 710, 132933 (2019).
Costa, V., et al. Mitochondrial fission and cristae disruption increase the response of cell models of Huntington’s disease to apoptotic stimuli. EMBO Molecular Medicine. 2 (12), 490-503 (2010).
Costa, V., Scorrano, L. Shaping the role of mitochondria in the pathogenesis of Huntington’s disease: Mitochondrial and Huntington’s disease. The EMBO Journal. 31 (8), 1853-1864 (2012).
Vanisova, M., et al. Mitochondrial organization and structure are compromised in fibroblasts from patients with Huntington’s disease. Ultrastructural Pathology. 46 (5), 462-475 (2022).
de Barcelos, I. P., Troxell, R. M., Graves, J. S. Mitochondrial dysfunction and multiple sclerosis. Biologie. 8 (2), 37 (2019).
Park, J., et al. Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin. Nature. 441, 1157-1161 (2006).
Meng, H., et al. Loss of Parkinson’s disease-associated protein CHCHD2 affects mitochondrial crista structure and destabilizes cytochrome c. Nature Communications. 8, 15500 (2017).
Lu, L., et al. CHCHD2 maintains mitochondrial contact site and cristae organizing system stability and protects against mitochondrial dysfunction in an experimental model of Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 135 (13), 1588-1596 (2022).
Cogliati, S., et al. Mitochondrial Cristae shape determines respiratory chain supercomplexes assembly and respiratory efficiency. Cell. 155 (1), 160-171 (2013).
He, B., et al. Mitochondrial cristae architecture protects against mtDNA release and inflammation. Cell Reports. 41 (10), 111774 (2022).
Polo, C. C., et al. Three-dimensional imaging of mitochondrial cristae complexity using cryo-soft X-ray tomography. Scientific Reports. 10, 21045 (2020).
Rybka, V., et al. Transmission electron microscopy study of mitochondria in aging brain synapses. Antioxidants. 8 (6), 171 (2019).
Mannella, C. A. Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1763 (5-6), 542-548 (2006).
Fry, M. Y., et al. In situ architecture of Opa1-dependent mitochondrial cristae remodeling. biorxiv. , (2023).
Barad, B. A., Medina, M., Fuentes, D., Wiseman, R. L., Grotjahn, D. A. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. The Journal of Cell Biology. 222 (4), 202204093 (2023).
Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617 (2020).
Yang, Z., et al. Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging. Chemical Science. 11 (32), 8506-8516 (2020).
Liu, T., et al. Multi-color live-cell STED nanoscopy of mitochondria with a gentle inner membrane stain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (52), e2215799119 (2022).
Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nature Communications. 11, 3699 (2020).
Zheng, S., et al. Long-term, super-resolution HIDE imaging of the inner mitochondrial membrane in live cells with a cell-permeant lipid probe. biorxiv. , (2022).
Wang, C., et al. A photostable fluorescent marker for the superresolution live imaging of the dynamic structure of the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15817-15822 (2019).
Feles, S., et al. Streamlining culture conditions for the neuroblastoma cell line sh-sy5y: a prerequisite for functional studies. Methods and Protocols. 5 (4), 58 (2022).
Shipley, M. M., Mangold, C. A., Szpara, M. L. Differentiation of the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Journal of Visualized Experiments. (108), e53193 (2016).
Kovalevich, J., Langford, D., Amini, S., White, M. K. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Neuronal Cell Culture. 1078, 9-21 (2013).
Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Recherche en cancérologie. 33 (11), 2643-2652 (1973).
Swerdlow, R. H. Mitochondria and mitochondrial cascades in alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 62 (3), 1403-1416 (2018).
Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Molecular Neurodegeneration. 15, 30 (2020).
Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction in aging and alzheimer’s disease: strategies to protect neurons. Antioxidants & Redox Signaling. 9 (10), 1647-1658 (2007).
Horn, A., Raavicharla, S., Shah, S., Cox, D., Jaiswal, J. K. Mitochondrial fragmentation enables localized signaling required for cell repair. Journal of Cell Biology. 219 (5), e201909154 (2020).
Korecka, J. A., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS ONE. 8 (5), e63862 (2013).
Baghel, M. S., Thakur, M. K. Vdac1 downregulation causes mitochondrial disintegration leading to hippocampal neurodegeneration in scopolamine-induced amnesic mice. Molecular Neurobiology. 56 (3), 1707-1718 (2019).
Jiang, S., et al. Mfn2 ablation causes an oxidative stress response and eventual neuronal death in the hippocampus and cortex. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 5 (2018).
Mu, Y., Gage, F. H. Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer’s disease. Molecular Neurodegeneration. 6, 85 (2011).
Rao, Y. L., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer’s disease: a review. 3 Biotech. 12 (2), 55 (2022).
Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., Ang, M. J., Kang, S., Kim, J. -. S., Moon, C. Structural Plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3349 (2022).
. Poly-D-Lysine Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401 (2023)
Dravid, A., Raos, B., Svirskis, D., O’Carroll, S. J. Optimised techniques for high-throughput screening of differentiated SH-SY5Y cells and application for neurite outgrowth assays. Scientific Reports. 11, 23935 (2021).
Hromadkova, L., et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes molecular polarization and differentiation of immature neuroblastoma cells into definitive neurons. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1867 (9), 118737 (2020).
Riegerová, P., et al. Expression and Localization of AβPP in SH-SY5Y cells depends on differentiation state. Journal of Alzheimer’s Disease. 82 (2), 485-491 (2021).
Hoffmann, L. F., et al. Neural regeneration research model to be explored: SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neural Regeneration Research. 18 (6), 1265-1266 (2022).
Abiraman, K., Tzingounis, A. V., Lykotrafitis, G. K. Ca 2 channel localization and regulation in the axon initial segment. The FASEB Journal. 32 (4), 1794-1805 (2018).
E18 Rat Hippocampus. Transnetyx Tissue Available from: https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4 (2023)
Kmito ORANGE – Probe for live cell imaging of mitochondria. Spirochrome Available from: https://spirochrome.com/product/pkmito_orange/ (2023)
Nyquist Calculator. Scientific Volume Imaging Available from: https://svi.nl/Nyquist-Calculator (2023)
Segawa, M., et al. Quantification of cristae architecture reveals time-dependent characteristics of individual mitochondria. Life Science Alliance. 3 (7), e2019000620 (2020).
Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
Stephan, T., Roesch, A., Riedel, D., Jakobs, S. Live-cell STED nanoscopy of mitochondrial cristae. Scientific Reports. 9, 12419 (2019).
Erdmann, R. S., et al. Labeling strategies matter for super-resolution microscopy: A comparison between HaloTags and SNAP-tags. Cell Chemical Biology. 26 (4), 584-592 (2019).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Ng, E. L., Reed, A. L., O’Connell, C. B., Alder, N. N. Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models. J. Vis. Exp. (196), e65561, doi:10.3791/65561 (2023).