使用活细胞STED成像可视化神经元细胞模型中的线粒体内膜超微结构

1. SH-SY5Y细胞的增殖和分化 制备用于细胞生长和维持的培养基制备完整的高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，4.5 g/L D-葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、110 mg/L 丙酮酸钠），补充有最终的 1% （v/v） 抗生素-抗真菌药（10,000 单位/mL 青霉素、10,000 μg/mL 链霉素和 25 μg/mL 两性霉素 B）和不同量的胎牛血清 （FBS）（参见 材料表）。分化培养基中的FBS含量在最终的10%、5%或2%（v/v）FBS之间变化。 细胞维护将细胞维持在补充有10%（v / v）FBS的DMEM中，并将它们置于37°C和5%CO2中，然后接种在含有5%（v / v）FBS的DMEM中进行分化。将冷冻细胞储备液储存在含有 10% （v/v） 二甲基亚砜 （DMSO） 的 FBS 中，浓度为 1-2 x 107 个细胞 /mL。 视黄酸（RA）的制备将 7.51 mg 全反式 RA（参见材料表）溶解在 5 mL 新鲜制备的 95% 乙醇中，以获得 5 mM 储备溶液。使用从制造商协议81的产品信息表中获得的350nm处的吸光度（ɛ = 44,300M-1cm-1）处的浓度验证浓度，使用在乙醇中以5μM稀释储备溶液。将5 mM原液储存在4°C避光保存长达6周。 用于盖玻片包衣的聚-D-赖氨酸的制备注：聚-D-赖氨酸 （PDL） 产品方案位于供应商网站82 的“文档和下载”部分下，提供了有关包被各种培养容器的信息。该协议包括基于2孔腔室容器的体积，每孔面积为4cm2 ，无菌#1.5硼硅酸盐盖玻片底部（参见 材料表）。用Dulbecco’s PBS（DPBS;不含钙，不含镁）将PDL储备溶液稀释两倍至50μg/ mL。注意： #1.5 或 #1.5H 盖玻片都是可接受的厚度，这对图像质量至关重要。其他厚度会引起球差，应避免。 PDL盖玻片涂层注意：盖玻片可以在生物安全柜中暴露在紫外线 （UV） 下 10-15 分钟以进行进一步灭菌。将 1.2 mL 的 50 μg/mL PDL 溶液应用于细胞培养柜中无菌腔室盖玻片的每个孔中，并在室温下孵育 1 小时。取出PDL溶液，用3.6 mL蒸馏水冲洗三次。完成最终洗涤后，让涂层室在空气中干燥2小时，然后冲洗并立即使用或与4°C的密封容器一起储存长达2周。注意：彻底冲洗盖玻片，因为过量的PDL可能对细胞有毒。 SH-SY5Y细胞与RA的分化注意：不要使用第 15 次以上的单元格。细胞以80%-90%的汇合度传代。鉴别程序不同，但遵循相似的步骤。通过用脑源性神经营养因子（BDNF）68,83,84,85进一步治疗，获得从神经母细胞瘤到成熟神经元的额外分化，但未在该方案中进行。可选：在盖玻片上接种之前建立细胞至少 24 小时。为了从冷冻储备液中制备细胞，快速解冻 1 mL 冷冻细胞小瓶，并加入补充有 10% FBS 的 9 mL 预热培养基中，然后以 350 x g 旋转 10 分钟（在室温下）并弃去上清液以除去 DMSO。将细胞沉淀重悬于 5 mL 预热培养基中，并将细胞接种在 T-25 烧瓶中。一旦细胞达到 80%-90% 汇合度，通过计数和接种进行传代，以便在适用时进行分化。第 0 天：接种细胞。将细胞从冷冻原液或工作烧瓶接种到有腔的盖玻片上。使用接种密度为 1.5 x 104 个细胞/cm2。注：培养面积为 4 cm 2 的标准2 孔盖玻片中的单孔需要 6.0 x 104 个细胞。未分化的细胞应接种补充有 10% （v/v） FBS 的 DMEM，将要分化的细胞应接种补充有 5% （v/v） FBS 的 DMEM。 第 1 天：开始 RA 分化治疗。制备补充有 5% （v/v） FBS、1% （v/v） 抗生素 – 抗真菌剂和终浓度为 10 μM RA 或相同添加剂体积的乙醇的 DMEM，作为该分化过程的载体对照。取出用于播种的腔室盖玻片中的培养基，用1x PBS冲洗，并将新的DMEM添加到孔中。 第 3 天：用新鲜的 RA 或含乙醇的培养基替换培养基。从第 1 天取出培养基，并用补充有 2% （v/v） FBS、1% （v/v） 抗生素 – 抗真菌剂和相同添加剂体积的 10 μM RA 或 95% 乙醇的新鲜培养基代替，作为该分化过程的载体对照。取出用于播种的腔室盖玻片中的培养基，用1x PBS冲洗，然后向孔中加入新培养基。 第 6 天：对细胞进行成像。注：细胞分化时间因方案而异，但暴露于 RA 六天足以诱导 SH-SY5Y 细胞中的神经元样表型86。执行实时成像，详情见第 3 节和第 4 节（图 2）。 2.原代大鼠海马神经元培养 大鼠海马神经元分离的材料制备。准备新鲜补充的DMEM。对补充有 10% （v/v） 热灭活 FBS、1% （v/v） 丙酮酸钠溶液和 1% （v/v） 青霉素-链霉素 （10,000 U/mL） 的 DMEM（高葡萄糖，无丙酮酸钠）的混合物进行过滤灭菌。在4°C下储存长达2周。 准备新鲜补充的神经元生长培养基。过滤灭菌补充有 2% （v/v） B27 补充剂、0.25% （v/v） 谷氨酰胺补充剂和 1% （v/v） 青霉素 – 链霉素的神经元生长培养基混合物（参见 材料表）。在4°C下储存长达2周。 准备原代海马神经元培养物。按照先前发表的工作87 和制造商网站上的产品方案制备原代海马神经元培养物，从中获得解剖的E18大鼠海马体88 （参见 材料表）。该协议导致大多数神经元群体具有 <2% 的星形胶质细胞。注意：运输此组织的冬眠培养基将用于本协议的后续步骤。不要丢弃它。 准备用于组织解离的材料和培养基。点燃巴斯德移液器以减小孔径，并将其存放在箔纸中以防止使用前污染。将制备的DMEM，1X Hank缓冲盐溶液（HBSS）和神经元生长培养基预热至37°C。 用无菌镊子将 2 片 DNA 酶加入 15 mL 锥形管中。 进行组织解离。在将组织放入含有DNAase的15mL锥形管中并在37°C下短暂孵育之前，尽可能多地去除解剖的E18大鼠海马体储存的冬眠培养基。 加入 900 μL 1X HBSS，然后加入 100 μL 0.5% 胰蛋白酶。将组织在37°C孵育15分钟。注意：PDL涂层板可以从储存中取出并放置在培养箱中，直到在此培养时间内使用。 进行组织匀浆和细胞计数。与胰蛋白酶孵育后，除去培养基，将上一步预热的冬眠培养基-DNAase加入组织中，并用巴斯德移液管匀浆。介质看起来不透明，然后随着均质化的继续而逐渐清晰。 将解离的神经元加入到装有 4 mL 预热 DMEM 的新管中，然后使用细胞计数器对细胞进行计数。 进行原代细胞的细胞铺板和生长。在DMEM中以约1.65×104 个细胞/cm2 的密度铺板细胞。对于 2 孔腔盖玻片 （4 cm 2），每孔接种 65,000 – 70,000 个细胞，加入2 mL DMEM。在检查粘附性之前，将细胞在37°C和5%CO 2下孵育2 小时。一旦细胞开始粘附，取出 1 mL 培养基并用相同体积的冬眠培养基代替，然后轻轻搅拌混合。混合培养基后，重复此过程并去除一半的培养基，并用相同体积的神经元生长培养基替换，然后轻轻混合。注：接种日被认为是 体外 日（DIV）0，细胞准备在DIV 7处成像（图2）。 3. 活细胞成像的细胞制备 注：细胞类型和来源（即培养细胞和原代细胞）的染色要求可能不同;详见已发布的报告62,63. PKmito橙的制备注：据报道，通常对 IMM 进行染色的其他染料为64,65,66，并且是市售的。PKMO是该协议中唯一使用的。按照制造商的说明将粉末 PKMO（见材料表）重悬于DMSO中89。从细胞中吸出培养基，并在预热的无酚红培养基中洗涤。在预热的、无酚红的DMEM中制备PKMO储备液，补充有2%（v / v）FBS或10%（v / v），具体取决于分化状态，HEPES至终浓度为20mM和1%（v / v）抗生素 – 抗真菌剂，然后按照制造商的说明对细胞进行染色。该配方不含PKMO，是活细胞成像介质。 用PKMO进行细胞染色将细胞与染料在37°C和5%CO2 下孵育30分钟。用活细胞成像培养基洗涤细胞三次，并在37°C，5%CO2下孵育30分钟。 加入新鲜的预热活细胞成像培养基。细胞现在可以进行成像了。注意：急性治疗（例如，药物和/或应激源）在使用时，在实时成像之前添加;请参阅“讨论”部分和 补充图 1。 4. 通过STED显微镜对活细胞进行成像 注意：该协议使用围绕倒置显微镜构建的STED系统，该系统在 材料表中指定。该系统配备了脉冲激发激光器（561 nm激光器，标称功率~300 μW）和脉冲775 nm STED耗尽激光器（标称功率1.2 W），连续可调的振镜扫描仪和基于615/20 nm滤光片的雪崩光电二极管探测器（APD）。这里使用用于 STED 的 100x/1.40 油浸镜头。Lightbox 软件用于图像采集。提供的所有详细信息都与此软件和系统设置直接相关。 影像学检查的一般指南和步骤使用载物台顶部培养箱或环境室来保持细胞活力，但短期室温实验也是可以接受的。这些步骤特定于上述 STED 设置。 选择用于成像的激光器和滤光片组。通过从染料列表中选择染色中使用的染料或光谱特性与所用染料最接近的染料，使用橙色 染料的参数。通过双击或将它们拖动到样品列表中来激活它们，其中显示“在此处拖动染料”。 选择要成像的区域。在概述中，通过选择矩形 ROI 按钮 并单击并拖动来塑造感兴趣区域 （ROI），在感兴趣的线粒体周围创建感兴趣区域 （ROI）。可以使用将鼠标悬停在角落上时出现的 ROI 角 或 弯曲边缘 来调整 ROI 的大小和旋转。注：建议的成像参数摘要见 表1。使用先前报道的该STED设置和染料组合63的参数对这些参数进行经验调整。 设置门控。在 “常规 ”菜单旁边，选择“ 门控 ”菜单，或单击并按住以将菜单添加到视图中。建议将STED检测器门控调整为1-1.05至7.8-7.85 ns，如下所示。门控时间可以变化，短至 1-1.05 至 7-7.05 ns。 根据样品适当调整强度。注：通常，用于STED的激发功率是共聚焦使用的功率的2-3倍，因此需要5%激发激光功率进行共聚焦的样品在STED采集过程中可以使用10%-15%的激发激光功率。将STED的激发激光设置为15%-20%，将STED耗尽激光设置为20%-25%，并有10条线累积。使用4 μs的像素停留时间，像素尺寸为20-25 nm。培养细胞的针孔保持在 1.0 AU，原代大鼠海马细胞的针孔保持在 0.7 AU，以改善更密集的线粒体中的光学切片。注意：共聚焦和STED图像都可以采集以进行并排比较（图3A，B，图4A），或者只能采集STED。 有关时间序列/z 系列的其他信息选择时间序列。选择时间下拉菜单。定义延时摄影所需的迭代次数（此处使用的 5 次）和时间间隔（此处使用的 25 或 30 秒）（图 3C、D、图 4B）。注意：如果间隔短于采集时间，则迭代将继续进行，没有任何延迟。在进行延时摄影时，强烈建议使用完美的对焦单元或类似的对焦跟踪，以避免潜在的漂移。 设置音量范围。通过启用 Volume 选项并调整范围的两端，根据需要设置 z 体积范围。该协议用于2D成像的步长为150-200nm。关于原始STED反卷积所需的奈奎斯特采样的推荐步长可以使用在线工具90计算。注意：STED耗尽激光功率和成像的平面数量会将染料光漂白和细胞的光暴露增加到有害水平。采集后检查是否有光毒性和光损伤的迹象。 5. 线粒体超微结构的加工和分析工具 注意：图像处理（即反卷积）是可选的，但通常用于制作和分析 STED 图像以供发布。强烈建议进行反卷积以提高对比度和减少噪声，以优化单个嵴的分割，如下所述（图 2）。 STED 图像反卷积注：本协议中用于反卷积的软件在 材料表中提供。设置图像的微观参数。注意：确保在图像 显微参数中正确输入显微镜元数据。这包括安装介质的折射率;浸泡介质;像素大小;激发波长、发射波长和耗尽波长;以及任何其他相关信息。可以保存具有这些参数的模板以供重复使用。 使用软件算法对原始 STED 图像进行去卷积。通过访问反卷积软件中的自动反卷积算法，可以进行不干涉的反卷积图像处理。选择“快速”按钮，并将反卷积类型设置为“快速”、“标准”、“主动”或“保守”，以获得不同程度的反卷积能力。显示了使用具有激进设置的快速反卷积的代表性图像（图 3、图 4 和图 5）。 将反卷积软件中的图像保存为 ICS2 格式。 对于手动反卷积，请执行以下步骤。简而言之，在执行手动反卷积时，请保存反卷积向导模板以保持一致性，并可以选择在启动向导时加载模板。使用测量点扩散函数 （PSF） 信息（如果通过采集设置和参数生成）。 如果需要，在让反卷积软件自动稳定图像之前，先裁剪原始 STED 图像。反卷积软件包的附加组件允许对可能的成像伪影进行特定补偿，例如热漂移和色差。 接下来，生成一个对数直方图以手动或自动执行背景减法。选择经典的最大似然估计 （CMLE） 反卷积算法。注意：对于反卷积，要调整的关键值是信噪比阈值、迭代次数和质量阈值。可以调整这些值，并且可以预览反卷积以确定最佳设置。 分割和颗粒分析注意：该协议使用 FIJI（Is Just ImageJ），一种开源软件（请参阅 材料清单），进行分割和分析。其他类似的软件，包括 CellProfiler、Icy、Ilastik 和 QuPath，也可用于这些目的。准备用于分割的图像。通过转到 “文件”→“打开 ”或单击并将文件拖动到 ImageJ 工具栏，从反卷积软件中打开 .obf 原始 STED 图像或 .ics2 文件。从这里开始，可以在分割之前执行任何使图像更容易分割的处理。 要保持一致更改，请使用 插件 → 宏 →录制 功能，并将关键命令复制并粘贴到新宏中，从 插件 →新建 →宏。确保在运行宏之前选择要处理的映像。注意：通常可接受的大小和形状定量更改包括裁剪、投影 z 堆栈和禁用平滑的背景减法。更改应在数据集内的图像之间一致地执行并报告。 调整可训练的 Weka 分段设置注：使用半自动分割工具和线粒体下游分析的分步说明的更多详细信息已发布91。在可训练的 Weka Segmentation （TWS）92 插件中打开去卷积的 STED 图像，该插件位于 Plugins → Segmentation → Trainable Weka Segmentation 下。在分割 设置中，选择 高斯模糊、 膜投影和 Sobel 滤波器 要素。膜厚度默认值为 1，膜贴片大小默认值为 19。 将 1 类或 2 类标记为“Cristae”，将另一个标记为“背景”（图 2）。也可以使用 “保存分类器 ”按钮保存模型。选择 “加载分类器 ”以将这些设置重用于其他图像。 执行TWS类跟踪。使用线条工具或其他形状突出显示一些嵴或背景。至少一些背景选择应该在嵴之间包括空格。在结构上画一条线以分配给任一类，然后选择右侧的“ 添加到 ”按钮作为嵴或背景。双击跟踪以从该标签中删除结构。 进行TWS分类训练。选择左侧的“训练分类器”按钮，根据提供给插件的信息生成映射。可以使用“切换叠加”按钮打开和关闭分段类的叠加，并且可以在“设置”中调整叠加的不透明度。可以使用其他标签重新训练分类器。满意后，选择“获取概率”按钮。 测量颗粒。使用嵴概率图，对图像设置阈值以生成蒙版，然后转到“分析”→“分析 粒子”。通常，可以使用默认阈值类型并调整范围以确保考虑整个嵴。通过分析颗粒提供的测量值可以通过分析→设置测量值进行调整。注：尺寸和形状参数的示例，例如嵴的面积、周长、圆度和纵横比，是根据选定的测量值测量和显示的（图2， 图5A， 补充表1）。 可选：选择与反卷积图像具有相同尺寸的原始 STED 图像，并从管理器中应用 ROI，然后在 ROI 管理器中选择 测量 以获取强度值。 获取折线图。从去卷积的STED图像生成线图。绘制一条多点线，将线条粗细调整到几个像素宽以平均噪声，然后将线样条以适合线粒体（图2， 图5B）。生成的线图用于测量峰峰值距离，以报告一定范围内嵴的周期性和分布。注：与此相关的是，嵴密度可以报告为通过测量线粒体外部确定的给定区域内独立嵴的数量。线粒体面积可以通过对去卷积或原始 STED 图像应用过滤器来生成掩模来确定。在测量该区域之前，确保面罩准确贴合线粒体的轮廓。