Identificazione di peptidi di piccole vescicole extracellulari da macrofagi derivati dal midollo osseo
Summary
Questo protocollo descrive una procedura per isolare piccole vescicole extracellulari dai macrofagi mediante ultracentrifugazione differenziale ed estrarre il peptidoma per l’identificazione mediante spettrometria di massa.
Abstract
Piccole vescicole extracellulari (sEV) sono tipicamente secrete dall’esocitosi dei corpi multivescicolari (MVB). Queste nanovescicole con un diametro di <200 nm sono presenti in vari fluidi corporei. Queste sEV regolano vari processi biologici come la trascrizione e la traduzione genica, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, l'immunità e l'infiammazione attraverso i loro carichi, come proteine, DNA, RNA e metaboliti. Attualmente, sono state sviluppate varie tecniche per l'isolamento delle sEV. Tra questi, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il gold standard ed è ampiamente utilizzato per l'isolamento delle sEV. I peptidi sono naturalmente biomacromolecole con meno di 50 amminoacidi di lunghezza. Questi peptidi partecipano a una varietà di processi biologici con attività biologica, come ormoni, neurotrasmettitori e fattori di crescita cellulare. Il peptidome ha lo scopo di analizzare sistematicamente peptidi endogeni in specifici campioni biologici mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Qui, abbiamo introdotto un protocollo per isolare le sEV mediante ultracentrifugazione differenziale e abbiamo estratto il peptidoma per l'identificazione mediante LC-MS/MS. Questo metodo ha identificato centinaia di peptidi derivati da sEVs da macrofagi derivati dal midollo osseo.
Introduction
Piccole vescicole extracellulari (sEV) con un diametro inferiore a 200 nm sono presenti in quasi tutti i tipi di fluidi corporei e secrete da tutti i tipi di cellule, tra cui urina, sudore, lacrime, liquido cerebrospinale e liquido amniotico1. Inizialmente, le sEV erano considerate come contenitori per lo smaltimento dei rifiuti cellulari, il che ha portato a una ricerca minima nel decennio successivo2. Recentemente, prove crescenti indicano che le sEV contengono proteine, lipidi, acidi nucleici e altri metaboliti specifici. Queste molecole vengono trasportate alle cellule bersaglio3, contribuendo alla comunicazione intercellulare, attraverso la quale partecipano a vari processi biologici, come la riparazione dei tessuti, l’angiogenesi, l’immunità4 e l’infiammazione 5,6, lo sviluppo del tumore e le metastasi 7,8,9, ecc.
Per facilitare lo studio delle sEV, è imperativo isolare le sEV da campioni complessi. Sono stati sviluppati diversi metodi di isolamento delle sEV sulla base delle proprietà fisiche e chimiche delle sEV, come la loro densità, la dimensione delle particelle e le proteine marcatrici di superficie. Queste tecniche includono metodi basati sull’ultracentrifugazione, metodi basati sulla dimensione delle particelle, metodi basati sulla cattura dell’immunoaffinità, metodi basati sulla precipitazione delle sEV e metodi basati sulla microfluidica10,11,12. Tra queste tecniche, il metodo basato sull’ultracentrifugazione è ampiamente riconosciuto come il gold standard per l’isolamento delle sEV ed è la tecnica più comunemente utilizzata13.
Una quantità crescente di prove suggerisce la presenza di una moltitudine di peptidi biologicamente attivi non ancora scoperti nei peptidomi di vari organismi. Questi peptidi contribuiscono in modo significativo a numerosi processi fisiologici regolando la crescita, lo sviluppo, la risposta allo stress 14,15 e la trasduzione del segnale16. L’obiettivo del peptidoma delle sEV è quello di scoprire i peptidi trasportati da queste sEV e fornire indizi sulle loro funzioni biologiche. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento delle sEV attraverso l’ultracentrifugazione differenziale, seguita dall’estrazione di peptidi da queste sEV per un’ulteriore analisi del loro peptidoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando si studia la funzione delle sEV, è imperativo ottenere sEV ad alta purezza da campioni biologici complessi per evitare potenziali contaminazioni. È stata sviluppata una varietà di metodi per l’isolamento delle sEV13 e, tra questi metodi, i metodi basati sull’ultracentrifugazione differenziale hanno mostrato una purezza relativamente elevata delle sEV. In questo studio, sono stati raccolti 200 mL di surnatante cellulare per 6 ore e circa 200-300 μg di sEV sono stati ottenuti mediante ult…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (3157270). Ringraziamo il Dr. Feng Shao (Istituto Nazionale di Scienze Biologiche, Cina) per aver fornito iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
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