Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse
Summary
Ce protocole décrit une procédure permettant d’isoler de petites vésicules extracellulaires des macrophages par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par spectrométrie de masse.
Abstract
Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont généralement sécrétées par l’exocytose des corps multivésiculaires (MVB). Ces nanovésicules d’un diamètre de <200 nm sont présentes dans divers fluides corporels. Ces sEV régulent divers processus biologiques tels que la transcription et la traduction des gènes, la prolifération et la survie des cellules, l’immunité et l’inflammation par le biais de leurs cargaisons, telles que les protéines, l’ADN, l’ARN et les métabolites. À l’heure actuelle, diverses techniques ont été mises au point pour l’isolation des sEV. Parmi eux, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or et est largement utilisée pour l’isolation des sEV. Les peptides sont naturellement des biomacromolécules de moins de 50 acides aminés de longueur. Ces peptides participent à une variété de processus biologiques ayant une activité biologique, tels que les hormones, les neurotransmetteurs et les facteurs de croissance cellulaire. Le peptidome est destiné à l’analyse systématique des peptides endogènes dans des échantillons biologiques spécifiques par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Ici, nous avons introduit un protocole permettant d’isoler les sEVs par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par LC-MS/MS. Cette méthode a permis d’identifier des centaines de peptides dérivés de sEVs à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse.
Introduction
De petites vésicules extracellulaires (sEV) d’un diamètre inférieur à 200 nm sont présentes dans presque tous les types de fluides corporels et sécrétées par toutes sortes de cellules, y compris l’urine, la sueur, les larmes, le liquide céphalo-rachidien et le liquide amniotique1. Initialement, les sEV étaient considérés comme des réceptacles pour l’élimination des déchets cellulaires, ce qui a conduit à un minimum de recherches au cours de la décennie suivante2. Récemment, de plus en plus de preuves indiquent que les sEV contiennent des protéines, des lipides, des acides nucléiques et d’autres métabolites spécifiques. Ces molécules sont transportées vers les cellules cibles3, contribuant à la communication intercellulaire, à travers laquelle elles participent à divers processus biologiques, tels que la réparation des tissus, l’angiogenèse, l’immunité4 et l’inflammation5,6, le développement tumoral et les métastases 7,8,9, etc.
Pour faciliter l’étude des sEV, il est impératif d’isoler les sEV à partir d’échantillons complexes. Différentes méthodes d’isolement des sEVs ont été développées en fonction des propriétés physiques et chimiques des sEV, telles que leur densité, leur taille de particules et leurs protéines marqueurs de surface. Ces techniques comprennent des méthodes basées sur l’ultracentrifugation, des méthodes basées sur la taille des particules, des méthodes basées sur la capture de l’immunoaffinité, des méthodes basées sur la précipitation des sEV et des méthodes basées sur la microfluidique10,11,12. Parmi ces techniques, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est largement reconnue comme l’étalon-or pour l’isolation des sEVs et est la technique la plus couramment utilisée13.
De plus en plus de preuves suggèrent la présence d’une multitude de peptides biologiquement actifs non découverts dans les peptidomes de divers organismes. Ces peptides contribuent de manière significative à de nombreux processus physiologiques en régulant la croissance, le développement, la réponse au stress 14,15 et la transduction du signal16. L’objectif du peptidome des sEVs est de découvrir les peptides portés par ces sEVs et de fournir des indices sur leurs fonctions biologiques. Nous présentons ici un protocole d’isolement des sEVs par ultracentrifugation différentielle, suivi de l’extraction des peptides de ces sEVs pour une analyse plus approfondie de leur peptidome.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de l’étude de la fonction des sEV, il est impératif d’obtenir des sEV de haute pureté à partir d’échantillons biologiques complexes afin d’éviter toute contamination potentielle. Diverses méthodes d’isolement des sEVs ont été mises au point13 et, parmi ces méthodes, les méthodes basées sur l’ultracentrifugation différentielle ont montré une pureté relativement élevée des sEV. Dans cette étude, 200 mL de surnageant cellulaire ont été prélevés pendant 6 h, et e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (3157270). Nous remercions le Dr Feng Shao (Institut national des sciences biologiques, Chine) pour la mise à disposition de l’iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
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