अपक्षयी नेत्र रोग जो आंख की रेटिना वर्णक उपकला परत को प्रभावित करते हैं, उनमें मोनोजेनिक और पॉलीजेनिक उत्पत्ति होती है। कई रोग मॉडल और एक सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन, लिपिडयूनेट, रोग के तंत्र, साथ ही संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है।
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) आंख के पीछे स्थित हेक्सागोनल कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है। यह फोटोरिसेप्टर और कोरॉयडल केशिकाओं को पोषण और समर्थन प्रदान करता है, फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों (पीओएस) के फागोसाइटोसिस करता है, और बाहरी रेटिना के होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए ध्रुवीकृत तरीके से साइटोकिन्स का स्राव करता है। उत्परिवर्तन, उम्र बढ़ने और पर्यावरणीय कारकों के कारण होने वाले डिस्फंक्शनल आरपीई के परिणामस्वरूप अन्य रेटिना परतों का अपघटन होता है और दृष्टि हानि का कारण बनता है। डिजेनरेटिंग आरपीई की एक हॉलमार्क फेनोटाइपिक विशेषता इंट्रा और उप-सेलुलर लिपिड समृद्ध जमा है। ये जमा विभिन्न रेटिना अपक्षयी रोगों में एक सामान्य फेनोटाइप हैं। विट्रो में मोनोजेनिक रेटिना अपघटन के लिपिड जमा फेनोटाइप को पुन: पेश करने के लिए, रोगियों के फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई (आईआरपीई) उत्पन्न किया गया था। स्टारगार्ड और लेट-ऑनसेट रेटिना डिजनरेशन (एल-ओआरडी) रोग वाले रोगियों से उत्पन्न सेल लाइनों को आरपीई शारीरिक कार्य को दोहराने के लिए 7 दिनों के लिए पीओएस के साथ खिलाया गया था, जिससे इन बीमारियों में पीओएस फागोसाइटोसिस-प्रेरित विकृति हुई। उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) के लिए एक मॉडल उत्पन्न करने के लिए, वैकल्पिक पूरक सक्रियण से जुड़ी एक पॉलीजेनिक बीमारी, आईआरपीई को वैकल्पिक पूरक एनाफिलाटॉक्सिन के साथ चुनौती दी गई थी। इंट्रा और उप-सेलुलर लिपिड जमा को नील लाल, बोरान-डिपाइरोमेथेन (बीओडीआईपीवाई), और एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। लिपिड जमा के घनत्व को निर्धारित करने के लिए, एक मशीन लर्निंग-आधारित सॉफ्टवेयर, लिपिडयूनेट, विकसित किया गया था। सॉफ्टवेयर को संस्कृति सतहों पर आईआरपीई की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। भविष्य में, इसे त्रि-आयामी (3 डी) छवियों का विश्लेषण करने और लिपिड बूंदों की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रशिक्षित किया जाएगा। लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर दवाओं की खोज के लिए एक मूल्यवान संसाधन होगा जो रोग मॉडल में लिपिड संचय को कम करता है।
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) रेटिना फोटोरिसेप्टर से सटे आंख के पीछे स्थित कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है। आरपीई फोटोरिसेप्टर को चयापचय और संरचनात्मक सहायता प्रदान करके उचित दृष्टि बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। स्वस्थ आरपीई कोशिकाओं को एक अलग हेक्सागोनल आकृति विज्ञान की विशेषता है। वे तंग जंक्शनों से जुड़े होते हैं, जो आरपीई को अपने बेसल साइड पर स्थित कोरियोकेशिकाओं और एपिकल रूप से स्थित फोटोरिसेप्टर के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करने की अनुमति देते हैं। रेटिना पारिस्थितिकी तंत्र को बनाए रखने के लिए, आरपीई प्रमुख मेटाबोलाइट्स, जैसे, ग्लूकोज, को फोटोरिसेप्टर में इस तरह से शटल करता है जो आरपीई1 में ग्लूकोज की खपत को कम करता है। इस सीमा के कारण, आरपीई फैटी एसिड सहित अपनी चयापचय आवश्यकताओं को बनाए रखने के लिए अन्य मेटाबोलाइट्स पर निर्भर करता है, जिसे आरपीई β-ऑक्सीकरण2 के माध्यम से कीटोन्स में परिवर्तित करता है। फैटी एसिड का उपयोग करने के लिए आरपीई की प्रवृत्ति को देखते हुए, जो संभवतः ऊर्जा स्रोत के रूप में फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड (पीओएस) पाचन से पुनर्नवीनीकरण होते हैं, आरपीई में लिपिड प्रसंस्करण मार्गों में हानिकारक परिवर्तन अक्सर मोनोजेनिक और पॉलीजेनिक अपक्षयीरेटिना रोगों दोनों में शामिल होते हैं।
उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), एक पॉलीजेनिक अपक्षयी आंख रोग जो आरपीई अध: पतन का कारण बनता है, को आरपीई मोनोलेयर में असामान्य ऑटोफैगी और लिपिड चयापचय से भी जोड़ा गया है। पीओएस को संसाधित करने और अन्य महत्वपूर्ण कार्यों को करने के लिए एक बेकार आरपीई मोनोलेयर की विफलता आरपीई और ब्रुच की झिल्ली के बीच स्थित बेसल रैखिक जमा (बीएलआईएनडी) नामक बाह्य (उप-आरपीई) जमा की ओर ले जाती है – एएमडी विकृति की एक पहचान। बीएलआईएनडी के प्रमुख घटकों में लिपोप्रोटीन शामिल हैं, जिनमें से सबसे प्रचुर मात्रा में एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) 4 है। बीएलआईएनडी की पतली परतों के संचय से नरम ड्रूसन हो सकता है, जिसे एएमडी 5,6 के नैदानिक लक्षण के रूप में पहचाना जाता है।
कई समूहों ने दिखाया है कि स्टेम सेल-व्युत्पन्न इन विट्रो रोग मॉडल जो आरपीई डिसफंक्शन का कारण बनते हैं, उनमें उप-आरपीई लिपिड संचय 7,8,9 होता है। (2017) ने सीएफएच जीन की बहुरूपता के कारण एएमडी के लिए उच्च जोखिम वाले रोगियों से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई (आईआरपीई) उत्पन्न किया। आईआरपीई ने एपीओई द्वारा चिह्नित ड्रूसन संचय दिखाया, और उच्च जोखिम वाले आरपीई ने कम जोखिमवाले रोगियों से उत्पन्न आईआरपीई की तुलना में बड़ी जमा जमा की।
एक इन विट्रो मॉडल बनाने के लिए जो एएमडी के सेलुलर हॉलमार्क, जैसे लिपिड ड्रॉपलेट्स और ड्रूसन जमाव को पुन: परिभाषित करता है, रोगी के रक्त के नमूनों से उत्पन्न आईआरपीई लाइनों को पहले प्रकाशित विकासात्मक रूप से निर्देशित प्रोटोकॉल11 का उपयोग करके स्थापित किया गया था। आईआरपीई को पूरक-सक्षम मानव सीरम (सीसी-एचएस) के अधीन किया गया था, एक समाधान जिसमें एनाफिलाटॉक्सिन होते हैं जो एएमडी के एक संभावित कारण की नकल करते हैं: वैकल्पिक पूरक सिग्नलिंगमें वृद्धि 8। लिपिड जमा के परिणामस्वरूप सेलुलर और उप-सेलुलर जमाव को आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले लिपिड और लिपोप्रोटीन मार्करों, एपीओई, नाइल रेड और बीओडीआईपीवाई का उपयोग करके मापा गया था। इन मार्करों के माध्यम से, यह दिखाया गया था कि सीसी-एचएस के माध्यम से सक्रिय पूरक सिग्नलिंग ने आईआरपीई कोशिकाओं8 में लिपिड संचय को बढ़ा दिया।
एक मोनोजेनिक रेटिना अपक्षयी बीमारी के लिए एक रोग मॉडल विकसित करने के लिए, आईआरपीई लाइनों को स्टारगार्ड रोग के रोगियों से विकसित किया गया था, जो आरपीई में एबीसीए 4 जीन में उत्परिवर्तन के कारण होने वाली बीमारी है। यह पहले दिखाया गया है कि जब एबीसीए 4 को बाहर कर दिया जाता है, तो ए 2 ई लिपोफसिन, एक इंट्रासेल्युलर जमा जिसमें फॉस्फोलिपिड्स और प्रकाश-निर्भर लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों के उच्च स्तर होते हैं, आरपीई12 के अंदर जमा होते हैं। एबीसीए 4 नॉकआउट लाइनों को रोगी लाइनों के साथ विकसित किया गया था, और दोनों को पीओएस फीडिंग के अधीन किया गया था। स्टारगार्ड आईआरपीई ने पीओएस फागोसाइटोसिस-प्रेरित विकृति का प्रदर्शन किया, जो बीओडीआईपीवाई स्टेनिंग द्वारा निर्धारित लिपिड संचय में वृद्धि का प्रदर्शन करता है। एबीसीए 4 केओ आईपीएससी से प्राप्त आरपीई को सीसी-एचएस उपचार के अधीन किया गया था; बीओडीआईपीवाई सिग्नल के परिमाणीकरण ने स्टार्गर्ड रोग मॉडलमें लिपिड हैंडलिंग में दोष दिखाया।
इन बीमारियों की व्यापकता और ऊपर वर्णित प्रासंगिक रोग मॉडल के साथ-साथ प्रभावी चिकित्सा विज्ञान की आवश्यकता को देखते हुए, संभावित उपचारों की प्रभावकारिता को निर्धारित करने के लिए मजबूत तरीकों को स्थापित करने की आवश्यकता है। लिपिड जमा को उद्देश्यपूर्ण, स्वचालित और मानकीकृत तरीके से निर्धारित करने के लिए, एक मशीन-लर्निंग-आधारित सॉफ्टवेयर, लिपिडयूनेट बनाया गया था, ताकि, जब मास्क विश्लेषण उपकरणों के साथ जोड़ा जाए, तो लिपिड जमाव को सामान्य मार्कर नील रेड, बीओडीआईपीवाई और एपीओई का उपयोग करके जल्दी और प्रभावी ढंग से पहचाना जा सके। इस विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके प्राप्त सारांश आंकड़ों का विश्लेषण किया जा सकता है और ग्राफिक रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है, जिससे उपचार की स्थिति की आसान तुलना हो सकती है। प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध: आरपीई कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट पर उगाया जाता है और विट्रो में विभिन्न प्रकार के रेटिना अपघटन को मॉडल करने के लिए सक्रिय मानव सीरम या शुद्ध गोजातीय बाहरी खंडों के साथ चुनौती दी जाती है। आरपीई कोशिकाओं को नाइल रेड, बीओडीआईपीवाई और एपीओई के साथ लिपोप्रोटीन जमा के लिए तय और दाग दिया जाता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग फ्लोरोसेंटली-लेबल लिपिड कणों के जेड-ढेर को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, जिन्हें बाद में 2 डी अधिकतम तीव्रता अनुमानों में संसाधित किया जाता है। एक मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम को लिपोप्रोटीन कणों को पहचानने और सही ढंग से विभाजित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था। कण गणना और विभिन्न आकार मैट्रिक्स युक्त सारांश तालिकाएं उत्पन्न होती हैं और बाद में प्लॉटिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयोग की जा सकती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यह प्रोटोकॉल अपक्षयी नेत्र रोगों के लिए मोनोजेनिक और पॉलीजेनिक इन विट्रो रोग मॉडल में लिपिड जमा को कुशलतापूर्वक लेबल, छवि और मात्रा निर्धारित करने की एक विधि प्रदान करता है। एआई-आधारित सॉफ्टवेयर, लिपिडयूनेट, को तीन सामान्य लिपिड मार्करों, एपीओई, नाइल रेड और बीओडीआईपीवाई पर लागू किया जा सकता है, और विश्लेषण के लिए एक तेज़, स्वचालित विधि प्रदान करता है जो परिमाणीकरण को मानक और निष्पक्ष होने की अनुमति देता है।
लिपिडयूनेट की मुख्य सीमा यह तथ्य है कि एआई के लिए प्रशिक्षण डेटासेट 96-वेल प्लेट में संवर्धित कोशिकाओं की 40x आवर्धन छवियों तक सीमित था। प्रशिक्षण छवि सेट के परिणामस्वरूप, लिपिडयूनेट, अपने वर्तमान रूप में, 40x आवर्धन छवियों का विश्लेषण करने तक सीमित है। सॉफ्टवेयर का उपयोग 96 वेल प्लेट के अलावा अन्य संस्कृति सतहों पर सुसंस्कृत कोशिकाओं की 40x छवियों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन सॉफ्टवेयर द्वारा सटीक थ्रेशोल्डिंग को सत्यापित करने के लिए उत्पन्न आउटपुट मास्क की जांच करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। अधिक छवि सेट (विभिन्न आवर्धन पर) की आवश्यकता होगी ताकि उन नमूनों / छवियों के दायरे का विस्तार किया जा सके जो इसका विश्लेषण कर सकते हैं।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। लिपिड मार्कर चरण में, उपयोगकर्ता को यह पुष्टि करनी चाहिए कि उनके चुने हुए लेबलिंग यौगिक (बीओडीआईपीवाई, एपीओई, नाइल रेड) ने अपने नमूने को प्रभावी ढंग से लेबल किया है। परिपक्व आरपीई कोशिकाएं अक्सर भारी रंजित होती हैं, जो एंटीबॉडी इम्यूनोस्टेनिंग के फ्लोरोसेंट सिग्नल को खराब कर सकती हैं। जब प्रतिदीप्ति संकेत कमजोर होता है या जब बहुत अधिक पृष्ठभूमि धुंधला होता है, तो लिपिडयूनेट लिपिड बूंदों को सटीक रूप से नहीं समझ सकता है। इसी तरह के कारण से, प्रोटोकॉल के स्वचालित इमेजिंग चरण के लिए ठीक से चयनित अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि अधिग्रहित छवियां खराब गुणवत्ता की हैं, तो लिपिडयूनेट छवियों को ठीक से मुखौटा करने के लिए संघर्ष करेगा और इसलिए, परिमाणीकरण गलत होगा (चित्रा 6 ए-एल)। अंत में, छवियों का पोस्ट-प्रोसेसिंग एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि लिपिडयूनेट में सॉफ्टवेयर के काम करने के लिए विशिष्ट आवश्यकताएं हैं।
जब लिपिड विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लोज़ की तुलना में जो मैनुअल थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करते हैं, या ऐसी तकनीकें जिनमें फिजी जैसे सॉफ़्टवेयर में स्वचालित थ्रेशोल्डिंग शामिल होती है, लिपिडयूनेट परिवर्तनीय लिपिड जमाव के साथ छवियों में एक गैर-पक्षपाती और विश्वसनीय विभाजन प्रदान करता है, जैसा कि लिपिड कणों की पहचान में एक छोटी त्रुटि दर से परिलक्षित होता है (चित्रा 7)। सॉफ्टवेयर अतिरिक्त प्रशिक्षण छवियों के उपयोगकर्ता प्रवेश की अनुमति देता है, जो उन लोगों से परे छवि सेटों के विश्लेषण की अनुमति देता है जो 40x आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करते हैं या यहां तक कि जो प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक अलग लिपिड मार्कर का उपयोग करते हैं। भविष्य में, सॉफ्टवेयर को 3 डी छवियों का विश्लेषण करने के लिए प्रशिक्षित किया जाएगा ताकि लिपिड जमा मात्रा का ठहराव संभव हो। अपक्षयी नेत्र रोग जो पैथोलॉजी में एक प्रमुख योगदानकर्ता के रूप में लिपिड जमाव को फंसाते हैं, प्रचलित हैं, और मामलों में वृद्धि की भविष्यवाणी की जाती है क्योंकि बुजुर्ग आबादीका विस्तार हो रहा है। सटीक रोग मॉडल और कुशल विश्लेषण उपकरण, जैसा कि हमने इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित किया है, नए चिकित्सीय हस्तक्षेपों के विकास की अनुमति देगा।
The authors have nothing to disclose.
हम ज़ीस कॉन्फोकल सिस्टम के उपयोग के लिए नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) हिस्टोलॉजी कोर को धन्यवाद देते हैं। यह काम एनईआई आईआरपी फंड (अनुदान संख्या ज़िया ईवाई000533-04) द्वारा समर्थित था।
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |