Les maladies oculaires dégénératives qui affectent la couche d’épithélium pigmentaire rétinien de l’œil ont des origines monogéniques et polygéniques. Plusieurs modèles de maladies et une application logicielle, LipidUNet, ont été développés pour étudier les mécanismes de la maladie, ainsi que les interventions thérapeutiques potentielles.
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules hexagonales située à l’arrière de l’œil. Il nourrit et soutient les photorécepteurs et les capillaires choroïdiens, effectue une phagocytose des segments externes des photorécepteurs (POS) et sécrète des cytokines de manière polarisée pour maintenir l’homéostasie de la rétine externe. L’EPR dysfonctionnelle, causée par des mutations, le vieillissement et des facteurs environnementaux, entraîne la dégénérescence d’autres couches rétiniennes et entraîne une perte de vision. Une caractéristique phénotypique caractéristique de la dégénérescence de l’EPR est les dépôts intra et subcellulaires riches en lipides. Ces dépôts sont un phénotype commun à différentes maladies dégénératives de la rétine. Pour reproduire le phénotype de dépôt lipidique des dégénérescences rétiniennes monogéniques in vitro, un EPR induit dérivé de cellules souches pluripotentes (iRPE) a été généré à partir des fibroblastes des patients. Les lignées cellulaires générées par des patients atteints de Stargardt et de dégénérescence rétinienne tardive (L-ORD) ont été nourries avec POS pendant 7 jours pour reproduire la fonction physiologique RPE, ce qui a provoqué une pathologie induite par la phagocytose POS dans ces maladies. Pour générer un modèle de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie polygénique associée à une activation alternative du complément, l’iRPE a été mis au défi avec d’autres anaphylatoxines du complément. Les dépôts lipidiques intra et subcellulaires ont été caractérisés à l’aide de rouge de Nil, de bore-dipyrrométène (BODIPY) et d’apolipoprotéine E (APOE). Pour quantifier la densité des dépôts lipidiques, un logiciel basé sur l’apprentissage automatique, LipidUNet, a été développé. Le logiciel a été formé sur des images de projection d’intensité maximale d’iRPE sur des surfaces de culture. À l’avenir, il sera formé pour analyser des images tridimensionnelles (3D) et quantifier le volume de gouttelettes lipidiques. Le logiciel LipidUNet sera une ressource précieuse pour découvrir des médicaments qui diminuent l’accumulation de lipides dans les modèles de maladies.
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules située à l’arrière de l’œil adjacente aux photorécepteurs rétiniens. L’EPR joue un rôle essentiel dans le maintien d’une bonne vision en fournissant un soutien métabolique et structurel aux photorécepteurs. Les cellules RPE saines sont caractérisées par une morphologie hexagonale distincte. Ils sont reliés par des jonctions serrées, ce qui permet à l’EPR d’agir comme une barrière entre le choriocapillaris situé sur sa face basale et les photorécepteurs situés apicalement. Pour maintenir l’écosystème rétinien, l’EPR transporte des métabolites clés, par exemple le glucose, vers les photorécepteurs de manière à minimiser la consommation de glucose dans l’EPR1. En raison de cette limitation, l’EPR dépend d’autres métabolites pour maintenir leurs besoins métaboliques, y compris les acides gras, que l’EPR convertit en cétones par β-oxydation2. Compte tenu de la propension de l’EPR à utiliser les acides gras, qui sont probablement recyclés à partir de la digestion du segment externe des photorécepteurs (POS), comme source d’énergie, les changements préjudiciables aux voies de traitement des lipides dans l’EPR conduisent souvent à des maladies dégénératives rétiniennes monogéniques et polygéniques3.
La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie oculaire dégénérative polygénique qui provoque la dégénérescence de l’EPR, a également été liée à une autophagie aberrante et au métabolisme des lipides dans la monocouche de l’EPR. L’échec d’une monocouche RPE dysfonctionnelle à traiter le POS et à remplir d’autres fonctions critiques conduit à des dépôts extracellulaires (sous-RPE) appelés dépôts linéaires basaux (BLinD) situés entre l’EPR et la membrane de Bruch – une caractéristique des pathologies de la DMLA. Les principaux composants de BLinD comprennent les lipoprotéines, dont la plus abondante est l’apolipoprotéine E (APOE)4. L’accumulation de couches minces de BLinD peut conduire à des drusen mous, qui sont reconnus comme un symptôme clinique de la DMLA 5,6.
Plusieurs groupes ont montré que les modèles de maladies in vitro dérivés de cellules souches qui causent un dysfonctionnement de l’EPR présentent une accumulation lipidique inférieureà l’EPR 7,8,9. Hallam et coll. (2017) ont généré une EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (iRPE) chez des patients présentant un risque élevé de DMLA en raison d’un polymorphisme du gène ZH. L’iRPE a montré une accumulation de drusen, marquée par l’APOE, et l’EPR à haut risque a accumulé des dépôts plus importants que l’iRPE générée par les patients à faible risque10.
Pour créer un modèle in vitro qui récapitule les caractéristiques cellulaires de la DMLA, telles que les gouttelettes lipidiques et le dépôt de drusen, des lignées iRPE générées à partir d’échantillons de sang de patients ont été établies à l’aide d’un protocole guidé par le développement11 publié précédemment. Les iRPE ont été soumis au sérum humain à complément compétent (CC-HS), une solution contenant des anaphylatoxines qui imitent une cause possible de DMLA : augmentation de la signalisation alternativedu complément 8. Le dépôt cellulaire et sous-cellulaire résultant des dépôts lipidiques a été mesuré à l’aide de marqueurs lipidiques et lipoprotéiques couramment utilisés, APOE, Nile Red et BODIPY. Grâce à ces marqueurs, il a été démontré que la signalisation activée du complément via CC-HS exacerbait l’accumulation de lipides dans les cellules iRPE8.
Pour développer un modèle de maladie pour une maladie dégénérative rétinienne monogénique, des lignées iRPE ont été développées à partir de patients atteints de la maladie de Stargardt, une maladie causée par des mutations du gène ABCA4 dans l’EPR. Il a déjà été démontré que lorsque ABCA4 est éliminé, la lipofuscine A2E, un dépôt intracellulaire connu pour contenir des niveaux élevés de phospholipides et de produits de peroxydation lipidiques dépendants de la lumière, s’accumule à l’intérieur de l’EPR12. Les lignes knockout ABCA4 ont été développées parallèlement aux lignes de patients, et les deux ont été soumises à une alimentation POS. L’iRPE de Stargardt a démontré une pathologie induite par la phagocytose POS, présentant une accumulation accrue de lipides quantifiée par la coloration BODIPY. L’EPR dérivé des CSPi ABCA4 KO a été soumis à un traitement CC-HS; la quantification du signal BODIPY a également montré un défaut dans la manipulation des lipides dans le modèle de la maladie de Stargardt9.
Compte tenu de la prévalence de ces maladies et de la nécessité de mettre en place des traitements efficaces, ainsi que des modèles de maladies pertinents décrits ci-dessus, il est nécessaire d’établir des méthodes robustes pour quantifier l’efficacité des traitements potentiels. Pour quantifier les dépôts lipidiques de manière objective, automatisée et standardisée, un logiciel basé sur l’apprentissage automatique, LipidUNet, a été créé afin que, lorsqu’il est associé à des outils d’analyse de masque, les dépôts lipidiques puissent être identifiés rapidement et efficacement à l’aide des marqueurs communs Nile Red, BODIPY et APOE. Les statistiques sommaires obtenues à l’aide de ce pipeline d’analyse peuvent ensuite être analysées et affichées graphiquement, ce qui permet de comparer facilement les conditions de traitement. Le schéma du protocole est illustré à la figure 1.
Figure 1 : Schéma du protocole : Les cellules EPR sont cultivées sur une plaque de 96 puits et mises au défi avec du sérum humain actif ou des segments externes bovins purifiés pour modéliser différents types de dégénérescence rétinienne in vitro. Les cellules EPR sont fixées et colorées pour les dépôts de lipoprotéines avec Nile Red, BODIPY et APOE. Un microscope confocal est utilisé pour acquérir des piles Z de particules lipidiques marquées par fluorescence, qui sont ensuite transformées en projections d’intensité maximale 2D. Un algorithme d’apprentissage automatique a été formé pour reconnaître et segmenter correctement les particules de lipoprotéines. Des tableaux récapitulatifs contenant le nombre de particules et diverses mesures de forme sont générés et peuvent être utilisés pour le traçage ultérieur et l’analyse statistique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Ce protocole fournit une méthode pour étiqueter, imager et quantifier efficacement les dépôts lipidiques dans des modèles de maladies in vitro monogéniques et polygéniques pour les maladies oculaires dégénératives. Le logiciel basé sur l’IA, LipidUNet, peut être appliqué à trois marqueurs lipidiques courants, APOE, Nile Red et BODIPY, et fournit une méthode d’analyse rapide et automatique qui permet à la quantification d’être standard et impartiale.
La principale limitation de LipidUNet est le fait que l’ensemble de données d’apprentissage pour l’IA était limité à des images de grossissement 40x de cellules cultivées dans une plaque de 96 puits. À la suite de l’ensemble d’images d’apprentissage, LipidUNet, dans sa forme actuelle, est limité à l’analyse d’images d’agrandissement 40x. Le logiciel peut être utilisé pour analyser des images 40x de cellules cultivées sur d’autres surfaces de culture en plus d’une plaque de 96 puits, mais il faut prendre soin d’examiner les masques de sortie générés pour vérifier le seuillage précis par le logiciel. Plus d’ensembles d’images (à différents grossissements) seront nécessaires pour élargir la portée des échantillons/images qu’il peut analyser.
Le protocole comporte plusieurs étapes critiques. À l’étape du marqueur lipidique, l’utilisateur doit confirmer que le composé de marquage choisi (BODIPY, APOE, Nile Red) a marqué efficacement son échantillon. Les cellules EPR matures sont souvent fortement pigmentées, ce qui peut altérer le signal fluorescent de l’immunomarquage des anticorps. Lorsque le signal de fluorescence est faible ou lorsqu’il y a trop de coloration de fond, LipidUNet ne peut pas discerner les gouttelettes lipidiques avec précision. Pour une raison similaire, des paramètres d’acquisition correctement sélectionnés pour l’étape d’imagerie automatique du protocole doivent être utilisés. Si les images acquises sont de mauvaise qualité, LipidUNet aura du mal à masquer correctement les images et, par conséquent, la quantification sera inexacte (Figure 6A-L). Enfin, le post-traitement des images est une étape importante, car LipidUNet a des exigences spécifiques pour que le logiciel fonctionne.
Par rapport aux flux de travail pour l’analyse des lipides qui utilisent le seuillage manuel, ou aux techniques qui impliquent un seuillage automatique dans des logiciels comme Fiji, LipidUNet offre une segmentation non biaisée et fiable entre les images avec un dépôt lipidique variable, comme en témoigne un faible taux d’erreur dans l’identification des particules lipidiques (Figure 7). Le logiciel permet à l’utilisateur d’entrer des images d’entraînement supplémentaires, permettant l’analyse d’ensembles d’images au-delà de celles qui utilisent un objectif de grossissement 40x ou même celles qui utilisent un marqueur lipidique différent, comme indiqué dans le protocole. À l’avenir, le logiciel sera formé pour analyser des images 3D afin de permettre la quantification du volume de dépôt lipidique. Les maladies oculaires dégénératives qui impliquent les dépôts de lipides comme un contributeur majeur à la pathologie sont répandues, et les cas devraient augmenter à mesure que la population âgée augmente13. Des modèles de maladie précis et des outils d’analyse efficaces, comme nous l’avons souligné dans ce protocole, permettront le développement de nouvelles interventions thérapeutiques.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le noyau d’histologie du National Eye Institute (NEI) pour l’utilisation du système confocal Zeiss. Ce travail a été financé par les fonds du PRI NEI (numéro de subvention ZIA EY000533-04).
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |