JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Tarladaki olgunlaşmamış tefritid meyve sineklerini tespit etmek için meyve özü elemek

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/65501
, , , , , , , , ,
1Animal Plant Health Inspection Service (APHIS), Plant Protection and Quarantine (PPQ), Science and Technology (S&T) Miami,United States Department of Agriculture (USDA), 2Division of Plant Industry,Florida Department of Agriculture and Consumer Services, 3APHIS, PPQ, S&T,USDA, 4IFAS, Tropical Research and Education Center,University of Florida, 5Agricultural Research Service (ARS), Pacific Basin Agricultural Research Center,USDA, 6APHIS, PPQ, Field Operations,USDA, 7ARS, Subtropical Horticulture Research Station,USDA

Summary

Tarladaki olgunlaşmamış tefritid meyve sineklerinin tespitinin arttırılması, bu yıkıcı zararlıların popülasyonlarını ortadan kaldırmak için zamanında çabaları tetikleyebilir. Geç instar larvalarını tespit etmek, konakçı meyveyi bir torbada karıştırırken ve hamuru bir dizi elek içinden geçirirken, elle kesme ve görsel muayeneden daha hızlı ve daha doğrudur.

Abstract

Tephritidae familyasının meyve sinekleri, dünyadaki en yıkıcı ve istilacı tarım zararlıları arasındadır. Birçok ülke, yeni başlayan popülasyonları ortadan kaldırmak için pahalı eradikasyon programları üstlenmektedir. Eradikasyon programları sırasında, larvaları tespit etmek için uyumlu bir çaba sarf edilir, çünkü bu, üreyen bir popülasyonu güçlü bir şekilde gösterir ve istilanın mekansal kapsamını belirlemeye yardımcı olur. Olgunlaşmamış yaşam aşamalarının tespiti, zararlıların daha fazla yayılmasını önlemek ve önlemek için ek kontrol ve düzenleyici eylemleri tetikler. Geleneksel olarak, larva tespiti, bireysel konakçı meyvelerin kesilmesi ve görsel olarak incelenmesiyle gerçekleştirilir. Bu yöntem emek yoğundur, çünkü sadece sınırlı sayıda meyve işlenebilir ve larva kaçırma olasılığı yüksektir. I) konakçı meyvenin plastik bir torbada öğütülmesini, ii) hamurun bir dizi elek ile süzülmesini, iii) tutulan hamurun kahverengi şekerli bir su çözeltisine yerleştirilmesini ve iv) yüzeye yüzen larvaların toplanmasını birleştiren bir ekstraksiyon tekniği test edildi. Yöntem, Florida’da Anastrepha suspensa tarafından doğal olarak istila edilen tarlada toplanan guava ile değerlendirildi. Bir meyve sineği eradikasyon programını daha fazla temsil eden düşük popülasyonları taklit etmek için, Hawaii’deki mangolar ve papaya, bilinen, düşük sayıda Bactrocera dorsalis larvaları ile istila edildi. Yöntemin uygulanabilirliği, acil bir meyve sineği programı sırasında işçilerin yaşadığı koşullar altında yöntemi değerlendirmek için B. dorsalis tarafından doğal olarak istila edilen guava üzerinde sahada test edildi. Hem saha hem de laboratuvar denemelerinde, hamurun karıştırılması ve elenmesi, meyvenin kesilmesinden daha verimli (daha az zaman gerektiren) ve daha hassastı (daha fazla larva bulundu). Hamurun kahverengi şekerli su çözeltisinde yüzdürülmesi, daha önceki instar larvalarının tespit edilmesine yardımcı oldu. Önemli tefritid konakçılarının meyve posalarının karıştırılması ve elenmesi, acil durum programları sırasında larvaların tespit edilme olasılığını artırabilir.

Introduction

Tefritid meyve sinekleri, Anastrepha, Bactrocera ve Ceratitis cinsleri ile en büyük riski oluşturan en yıkıcı tarımsal zararlılar arasındadır1. Birçok alan, 1) tarihsel saldırılara ve ilgili sınırlama ve yok etme programlarına, 2) meyve sineği konakçı materyalinin giriş limanlarına yüksek varış oranına ve 3) üreme popülasyonlarının kurulması için elverişli iklim koşullarına dayanan egzotik meyve sineği oluşumu için yüksek risk altındadır. Kaliforniya eyaleti her yıl birden fazla saldırı ve tefritid tespiti yaşamaktadır2. Son yüzyılda dünya çapında tefritidlere karşı 200’den fazla saldırı ve eradikasyon programı olmuştur ve bu son yıllarda önemli ölçüde hızlanmıştır3. Bu programların büyük çoğunluğu istilacı meyve sineklerini yok etmede başarılı olsa da3,4, bu istilaların ekonomik ve çevresel yükü hala yüksek olmaya devam etmekte ve kuruluş olasılığı her zaman mevcuttur; Yakın tarihli bir felaket örneği, Afrika kıtasında Bactrocera dorsalis’in enfeksiyonudur5.

Acil meyve sineği programları sırasında, istilacı türlerin üreme popülasyonlarını tespit etmek ve kontrol etmek için uyumlu bir çaba sarf edilir. Örneğin, Florida eyaleti, toprak damlamaları uygulayarak (meyve taşıyan konakçı bitkilerin damlama çizgisi altında) ve çiftleşmiş dişilerin ve / veya larvaların bulunduğu alanların etrafındaki 200 m yarıçapında konakçı meyveleri çıkararak tefritid saldırılarına yanıt verir6. Bu eylemler ve taktikler, topraktaki larvaları ve pupaları öldürmeye ve bölgedeki meyvelerden yumurta ve larvaları çıkarmaya hizmet eder. Bazı eradikasyon programlarında, önemli miktarda konakçı meyve çıkarılır. 2015 yılında, Florida6’daki B. dorsalis eradikasyon programı sırasında 100.000 kg’dan fazla meyve imha edildi. Sadece karantinaya alınan bölgedeki yetiştiricilere ve ilgili endüstrilere yönelik ekonomik kayıpların 10,7 milyon doların üzerinde olduğu tahmin edilmektedir7.

Karantina bölgelerinde tefritid larvalarını bulmak için, küçük bir entomolog ekibi, dişi sinek tespit alanı etrafında 200 m’lik bir yarıçapta konakçı meyveleri toplar ve her meyveyi larva 6 için keser ve görsel olarakinceler. Sınırlı personel kaynakları ve yüzlerce olası ev sahibi ile, özellikle hem ticari üretim alanlarında hem de konut bahçelerinde bitki çeşitliliğinin yüksek olduğu alanlarda görev zorlaşmaktadır. Ek olarak, konakçı meyveleri keserken larvalar kaçırılabilir. Giriş limanlarında meyve kesimini değerlendiren bir çalışmada, meyve kesmenin, istila edilmiş meyveleri birkaç hafta boyunca tutmak ve pupa substratı8’de bulunan larva ve pupaları saymakla karşılaştırıldığında, A. suspensa’yı tespit etmede etkili olmadığı bulunmuştur.

Bir istilayı tespit etmek için meyve kesmeye alternatifler vardır 9,10,11,12,13. Örneğin, kahverengi bir şeker yüzdürme ve sıcak su yöntemi, hasat edilen kirazlarda batı kiraz meyve sineklerini tespit etmek için kullanılan kabul edilen prosedürlerdir 9,10. Kahverengi şeker yöntemi, ezilmiş meyvelerin şekerli su çözeltisine yerleştirilmesini ve tepeye doğru yüzen larvaların toplanmasını içerir. Kahverengi şeker yüzdürme yöntemi, özellikle karantina meyve sineği zararlılarını izlemek için paketleme evlerini gerektiren ihraç edilen kirazlar için düzenleyici kuralları karşılamak için geliştirilmiştir. Ayrıca, bitki sağlığını desteklemek için kahverengi şekerli su yüzdürme, tuzlu su yüzdürme veya kaynatma içeren onaylı bir ABD-Kanada yaban mersini sertifikasyon programı da vardır14. Şeker ve sıcak su yüzdürmesinin doğruluğunu test ederken, araştırmacılar kaç larva kaçırıldığını belirlemek için eleme yöntemini kullandılar 9,10,11,12,13. Bir çalışma, ezilmiş yaban mersini bir tuz çözeltisinde karıştırmanın ve çözeltiyi yeniden kullanılabilir bir kahve filtresinden filtrelemenin, Drosophila suzukii larvalarını tespit etmede, tuz ve şeker çözeltilerinin yüzeyini görsel olarak incelemekten dört kat daha iyi olduğunu göstermiştir14. Ek olarak, narenciye15’te A. suspensa larvalarının tespiti için gaz kromatografisi kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar saha araştırmalarında uygulanabilirlik açısından test edilmemiştir.

Amacımız, eleme ve şekerli su yüzdürme kullanarak sahada tefritid larvalarını bulmak için bir yöntem geliştirmek ve test etmekti. Bu yöntem, olgunlaşmamış meyve sineklerinin geleneksel meyve kesme yönteminden daha verimli bir şekilde tespit edilmesini sağlar ve meyve sineği eradikasyon programları sırasında üreme popülasyonlarının zamanında kontrolünü destekler.

Protocol

1. Meyve Seçimi İncelenecek alanda hangi meyvenin mevcut olduğunu belirleyin. Hedef tefritid türleri için bilinen konakçıların listesine göre konakçı meyveyi seçin. Mango, papaya ve guava gibi yumuşak etli, olgun meyveleri seçin. Tropikal badem gibi olgunlaşmamış veya sert etli meyveler, meyve kesimi gibi farklı bir yöntemle incelenmelidir. Hasar belirtileri, yumurtlama izleri ve yumuşak lekeleri olan ağaçlarda düşmüş, olgunlaşmış meyveleri veya olgun meyveleri seçin. Bir seferde yaklaşık 2 L meyve işleyin (örneğin; 5 guava veya 5 orta boy mango bu yöntem için yeterli numune oluşturur). Bir kerede işlenebilecek meyve sayısı, meyvelerin büyüklüğüne bağlıdır (Şekil 1A). 2. Küfür Meyveyi büyük parçalara ayırın ve 4 L’lik fermuarlı kilitli bir saklama torbasına yerleştirin (Şekil 1B). Su doğranmış meyveyi 25-50 mm kaplayana kadar torbaya su ekleyin (Şekil 1C). Tüm kağıt hamuru kabuğundan çıkana ve pürüzsüz bir kıvama gelene kadar (yani büyük parçalar yok) meyveyi elle hafifçe sıkın (Şekil 1D). 3. Geç instar koleksiyonu için eleme Elekler istifleniyor. Büyük miktarlarda meyveyi (aynı anda ~ 5 meyve) işlemek için büyük elekler (457 mm çapında) ve bireysel meyveler veya daha küçük numuneler (< 5 meyve) için daha küçük elekler (305 mm çapında) kullanın. Eleği büyük bir ağ (No. 8; 2,36 mm) elek ile küçük bir ağ (No. 20; 0,85 mm) elek üzerine yerleştirin. Erken instarların tespiti için, yığının altına üçüncü bir elek (No. 45; 0,35 mm) yerleştirin (Şekil 1E). Hamuru üst eleğe dökün (Şekil 1F). İnce hamur eleklerden geçene kadar bir musluktan, hortumdan veya bir şişeden su kullanarak hamuru elek yığını boyunca iyice yıkayın (Şekil 1G). Üst elekleri, kabuğu veya herhangi bir büyük meyve parçası ile tutulmuş olabilecek geç instar larvaları için görsel olarak tarayın (Şekil 1H). İkinci eleği geç instar larvaları için dikkatlice inceleyin. Çok miktarda ince kağıt hamuru ile ek durulama gerekli olabilir. Larva forseps ile eleklerden larvaları toplayın ve% 70 EtOH ile şişelere yerleştirin. 4. Erken instar koleksiyonu için şeker yüzdürme 453 g (1 kutu) koyu kahverengi şekeri 2 L musluk suyunda çözerek şeker çözeltisini önceden karıştırın, bu da 19 ° 10’luk bir Brix okuması sağlar. Hamuru daha ince örgü eleklerden (örneğin, No. 20 ve No. 45) eleğin kenarına kadar musluk suyuyla yıkayın, ardından malzemeyi plastik bir tencereye (11 L) taşıyın. Kahverengi şeker çözeltisini, hamuru 25-50 mm kaplayana kadar ekleyin ve 2 damla köpük önleyici ekleyin. Hamuru kahverengi şeker çözeltisinde yaklaşık 5 dakika bekletin. Larva forseps ile çözeltinin yüzeyine yüzen larvaları% 70 EtOH ile şişelere toplayın. 5. Larva kürasyonu Bir şişeyi daha sonra incelemek ve tanımlamak için toplama yeri, tarihi, meyve türü ve toplayıcı ile etiketleyin.

Representative Results

Erken ve geç instar Anastrepha suspensa tarladan toplanan meyvelerden ekstraksiyonBu deneyde, meyve kesme ve soyma, eleme ve yüzdürme (MSF) yöntemlerini, tespit edilen larvaların oranı ve bunları tespit etmek için gereken ortalama süre açısından karşılaştırdık. Anastrepha suspensa’nın larvaları ile oldukça istila edilmiş olan Guava, Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü, Tropikal Araştırma ve Eğitim Merkezi, Homestead, FL’de bulunan bir bitkiden toplandı. Meyveler rastgele 5’erli gruplara ayrıldı ve 2 larva ekstraksiyon yönteminden 1’ine atandı: 1) el kesimi veya 2) MSF yöntemi. Her bir ekstraksiyon yöntemini kullanarak çıplak gözle görülebilen tüm larvaları toplama zamanı kaydedildi. El kesme yöntemi, şu anda bir eradikasyon programında kullanılan yöntemi takip etti. 5 işçinin her birine (n = 5), meyveleri daha küçük parçalara ayırarak ve hamuru görsel olarak inceleyerek larvaların tüm aşamalarını aramak için 5 meyve atandı. Larvaların görsel incelemede kaçırılıp kaçırılmadığını belirlemek için, elle kesilmiş meyve parçaları diseksiyon mikroskobu (10x) kullanılarak yeniden incelendi. MSF yöntemi için, 5 meyve büyük parçalar halinde (50-80 cm) kesilir, fermuarlı kilitli torbalara yerleştirilir ve tüm hamur kabuğundan çıkana ve kağıt hamuru pürüzsüz bir kıvama gelene kadar (yani büyük parçalar olmadan) elle hafifçe sıkılırdı. Kabartılmış meyve, bir dizi büyük (45.7 cm) pirinç elek ile süzüldü. En büyük ağ (No. 8) üste istiflendi, bunu 20 numaralı bir numara ve 45 numaralı bir örgü elek izledi. Bu işleme atanan personel, bir lavabo musluğuna bağlı bir hortumdan su kullanarak hamuru ağdan yıkadı. Geç instar larvaları eleklerde belirgindi. Daha küçük instarlar kağıt hamuru ile karıştırıldı, bu da onları görmeyi ve çıkarmayı zorlaştırdı. Bu nedenle, eleklerden elde edilen kağıt hamuru / larva karışımı, 1 L kahverengi şekerli su çözeltisi içeren kovalara konur. Larvalar hemen yüzeye çıktı. Çözelti hafifçe karıştırıldı ve 5 dakika sonra larvalar kovalardan çıkarıldı ve sayıldı. Meyveyi işleme zamanı, larvaları şekerli su çözeltisinden çıkarmak, elemek ve çıkarmak için bir kombinasyondu. El kesimi veya eleme ve yüzdürme yöntemleri ile bulunan larva sayısına ilişkin veriler Kruskal-Wallis parametrik olmayan test kullanılarak analiz edilmiştir (p = 0.05)16. MSF yöntemi, elle kesmeye göre daha fazla sayıda larva (Şekil 2A) ve dakikada daha fazla larva (Şekil 2B) elde etti. Bu çalışmada farklı instarların tespiti nicelleştirilmemiş olsa da, tüm instarların (birinci, ikinci ve üçüncü) elekler kullanılarak bulunduğunu, ancak daha sonra instarların (ikinci ve üçüncü) el kesimi kullanılarak görüldüğünü gözlemledik. Daha önce kesilmiş ve görsel olarak incelenmiş örnekler diseksiyon mikroskop kapsamı ile yeniden incelendiğinde, meyveleri istila eden geç instar larvalarının% 40’ı kaçırıldı. Bununla birlikte, daha önceki instarlar öncelikle yeniden inceleme ile bulundu. Bu deney, MSF yönteminin kullanılmasının, istila edilmiş meyvelerde larva bulmak için daha etkili ve verimli olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, daha az sayıda larva ile istila edilmiş meyvelerin, istilacı türlerin çok nadir olacağı bir eradikasyon programında görülme olasılığı daha yüksektir. Bu nedenle, konakçı meyvenin bilinen, az sayıda larva ile istila edildiği bir laboratuvar çalışması yaptık. Düşük Bactrocera dorsalis istilasını simüle etmek için mango ve papaya’nın manuel istilasıBu deney, meyve kesme ve MSF yöntemlerini, tespit edilen larvaların oranı ve istila nispeten düşük olduğunda bunları tespit etmek için gereken süre açısından karşılaştırdı. Manuel istila, her yöntemin etkinliğini değerlendirmek için deneysel bir araç olarak kullanılmıştır, çünkü mevcut larvaların sayısı kesin olarak bilinmektedir. Meyve sineği larvaları içermeyen bireysel mango ve papaya meyvelerinde 5 delik açmak için bir mantar delici (1.0 cm çapında) kullanılmıştır. Tek bir geç saniye ila erken üçüncü instar B. dorsalis larvası, meyvenin bir alt kümesinin 5 deliğinin her birine yerleştirildi. Delikler, meyveden sıkılan parça kullanılarak kapatıldı ve kalan meyve, manuel istilayı görsel olarak simüle etmek için larva sokmadan kapatıldı. Meyveler larva gelişimine izin vermek için 48 saat boyunca 27 ° C’de tutuldu. Deney, Hawaii Adası, Hilo’daki ARS laboratuvarında (n = 5 işçi) ve Hawaii, Oahu Adası’ndaki APHIS-PPQ laboratuvarında (n = 4 işçi) gerçekleştirildi. Meyve kesimi için, her işçiye 5 mango (1 larva ile istila edilmiş ve 4 istila edilmemiş) ve 4 papaya (biri istila edilmiş ve 3 istila edilmemiş) verildi. Bir işçi her meyveyi ayrı ayrı daha küçük parçalara ayırdı ve olgunlaşmamış meyve sinekleri için hamuru sürekli olarak kontrol etti. Kağıt hamuru iyice incelendiğinde arama durduruldu. Bulunan toplam larva sayısı ve her işçinin tüm meyveleri keserek işlemek için harcadığı zaman kaydedildi (Şekil 3) ve (Şekil 4). Her işçi, daha önce tarif edildiği gibi 2 parça istila edilmiş, (meyve kesimi olmadan) karıştırma veya eleme için başka bir benzer meyve seti (5 mango ve 4 papaya) aldı. Kağıt hamuru üst elek içine döküldü ve protokolde tarif edildiği gibi çıkarılan bir musluk ve larvalardan su kullanılarak elek yığını boyunca yıkandı. Deney, yüzdürme adımının kaldırılmasının duyarlılığı kaybetmeden işlemin hızını artırıp artırmayacağını belirlemek için şeker yüzdürme ile ve şeker yüzdürme olmadan iki kez gerçekleştirildi (yani, larvaların tümü veya çoğu bulundu) (Şekil 3). Bulunan larva sayısı ve her işçinin meyveyi kesme, MSF veya MS yöntemiyle işlemek için harcadığı zaman kaydedildi. Hem mangolar hem de papayalar için, tam MSF yöntemi (yüzdürme dahil) daha fazla sayıda larva tespiti ile sonuçlandı ve meyve kesiminden daha hızlıydı (Tablo 1). Geleneksel meyve kesme yöntemini kullanan işçiler, mango ve papayalara yerleştirilen larvaların sırasıyla% 32 ve% 35’ini kaçırdılar (Tablo 1). MSF tekniğini kullanarak meyvelerin toplu olarak işlenmesi, tek tek mangoların kesilmesinden , papayaların kesilmesinden ise daha az zaman gerektiriyordu (Şekil 3). Meyve kesme yöntemine kıyasla papaya (Şekil 3C) ve mango (Şekil 3D) için MSF yöntemi kullanılarak dakikada daha fazla larva bulundu. Bulunan tüm larvalar canlıydı. Larva morfolojik tanımlaması sadece geç instarlar için mümkündür. Yukarıdaki deneyi tekrarladık, ancak larvaların geri kazanımının yüksek kalıp kalmadığını ve meyve işleme hızının artıp artmadığını belirlemek için yüzdürme prosedürünü atladık. MS yöntemi (yüzdürme ihmal edilmiş), papaya (Şekil 4A) ve mango (Şekil 4B) için kesme ve görsel muayeneye kıyasla daha fazla larva tespiti ile sonuçlanmıştır. Ek olarak, teknik papaya (Şekil 4C) ve mangoyu (Şekil 4D) kesmekten ve görsel olarak incelemekten daha hızlıydı. MSF yönteminden yüzdürme adımının kaldırılması, geç instar larvalarını bulma süresini papaya için , mangolar için oranında azaltmıştır (Tablo 2). Bulunan larvaların yüzdesi her iki yöntem için de yüksekti ve MS için sürekli olarak daha yüksekti (yüzdürme ihmal edildi). Papaya için larvaların sırasıyla ve ‘i MSF ve MS yöntemlerinden elde edildi (Tablo 1 ve Tablo 2). Mango için MSF ve MS yöntemlerinden sırasıyla ve oranında iyileşme sağlandı (Tablo 1 ve Tablo 2). Meyve kesme ve MSF yöntemlerinin saha karşılaştırmasıBu deneyin amacı, acil bir meyve sineği programını taklit ederek tarla koşullarında meyve kesme ve MSF yöntemlerini karşılaştırmaktı. Meyve işleme, iki larva ekstraksiyon yönteminin sahaya hazır olup olmadığını test etmek için laboratuvarın rahatlığı ve altyapısı olmadan gerçekleştirildi. Çalışmalar, Hilo yakınlarındaki USDA-ARS Tropikal Bitki Genetik Kaynakları ve Hastalık Araştırma Birimi Germplazması’nda bulunan bir guava bahçesinde gerçekleştirildi. İstila belirtileri gösteren toplam 40 guava toplandı ve 2 gruba ayrıldı. Toplam 20 guava kesme/görsel incelemeye tabi tutuldu ve ardından MSF (yüzdürme dahil) tarafından kesildi ve bu da kesme yönteminin MSF yöntemine kıyasla hassasiyetinin değerlendirilmesine olanak sağladı. Diseksiyon yukarıda açıklandığı gibi devam etti. Tespit edildiğinde, larvalar çıkarıldı ve sayıldı. Dört işçinin her biri 5 guavayı parçalara ayırdı ve her işçi için kesme ve inceleme için gereken süre kaydedildi. Kesim sonrası MSF yukarıdaki gibi gerçekleştirildi, ancak daha küçük larvaları toplamak için No. 8 ve No. 20 eleklere ek olarak üçüncü bir daha küçük örgülü elek (No. 40, 0.420 mm) kullanıldı. 20 guavadan oluşan ikinci set 2 fermuarlı kilitli torbaya (torba başına 10 meyve) yerleştirildi ve sadece MSF’ye tabi tutuldu (yani kesim yapılmadı), bu da meyve kesimi için gereken sürenin MSF ile karşılaştırılmasını sağladı. Yukarıdaki gibi, bu prosedürde üç elek kullanılmıştır. Bulunan larva sayısı ve meyvenin işlenmesi için toplam süre (meyvenin torbada 5 dakika boyunca mantarlanması ve tutulması / eleme / şeker çözeltisi içinde yüzme) kaydedildi. Laboratuvarda tespit edildiği gibi, meyve kesimi meyve istilasını hafife aldı ve MSF yöntemleri kullanılarak geri kazanılabilecek larvalardan – daha az larva tespit ederek oldukça değişkendi (Tablo 3). Dahası, az sayıda larva içeren örnekte MSF 0 daha fazla larva elde ederek daha yüksek tahlil hassasiyeti ve istila eden organizmayı tanımlamak için daha fazla şans sağladı. Meyveler MSF yöntemi kullanılarak kesime kıyasla çok daha hızlı işlendi; 5 meyvenin kesilmesi ve denetlenmesi, MSF aracılığıyla 10 meyvenin işlenmesiyle aynı süreyi gerektiriyordu. Şekil 1: Meyve sineği larva ekstraksiyon protokolünün adımları. (A) Bir kerede meyve hacmine göre yaklaşık 2 L işlem yapın (örneğin; 5 guava veya 5 orta boy mango bu yöntem için yeterli numune oluşturur). (B) Meyveyi büyük parçalara ayırın ve 4 L’lik fermuarlı kilitli bir saklama torbasına yerleştirin. (C) Su, doğranmış meyveyi 25-50 mm kaplayana kadar torbaya su ekleyin. (D) Tüm kağıt hamuru kabuğundan çıkana ve pürüzsüz bir kıvama gelene kadar (yani, büyük parçalar olmadan) meyveyi elle hafifçe sıkın. (E) Eleği büyük ağ (No. 8; 2,36 mm) elek ile üst üste yerleştirin ve ardından küçük ağ (No. 20; 0,85 mm) eleği yerleştirin. Erken instarlar için, yığının altına üçüncü bir elek (No. 45; 0,35 mm) yerleştirin. (F) Hamuru üst eleğin içine dökün. (G) İnce hamur ilk elekten geçene kadar hamuru bir musluktan, hortumdan veya bir şişeden su kullanarak elek yığını boyunca iyice yıkayın. (H) Üst elekleri, kabuğu veya herhangi bir büyük meyve parçası ile tutulmuş olabilecek geç instar larvaları için görsel olarak tarayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Resim 2: Tarlada toplanan meyvelerden erken ve geç instar Anastrepha suspensa ekstraksiyonu. Anastrepha suspensa larvalarının beş guava meyvesinden elde edilen ortalama sayısı ±(ortalama [SE]’nin standart hatası), kesilerek ve görsel olarak incelenerek (kesme: 70.4 ± 11.9) veya hamurun bir dizi üç elek ile yıkanması ve ardından hamurun şekerli su çözeltisine batırılması (MSF: 175.6 ± 21.91) (A). Kesilerek (1.21 ± 0.16) ve MSF (3.71 ± 0.50) işlenerek işlenen 5 guavadan dakikada toplanan ortalama larva sayısı (±SE) (B). Her yöntem 5 kez tekrarlandı ve çubukların üzerindeki yıldız işaretleri, Kruskal-Wallis testine dayanarak larva sayısı (χ 2 = 6.81, p < 0.01) ve işlenme süresi (χ2 = 6.80, p < 0.01) için önemli farklılıklar göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Düşük Bactrocera dorsalis istilasını simüle etmek için mango ve papaya’nın manuel istilasını kullanarak tam susturma-eleme-yüzdürme yönteminin doğrulanması. Papaya (kesim: 3.25 ± 0.51, MSF: 4.0 ± 0.4) (A) ve mango (kesim: 3.4 ± 0.51, MSF: 4.4 ± 0.4) (B) meyvelerinde bulunan ortalama Bactrocera dorsalis larva (±SE) sayısı ve papayadan (kesim: 0.21 ± 0.1, MSF: 0.4 ± 0.15) (C) ve mangodan (kesim: 0.14 ± 0.01, MSF: 0.21 ± 0.03) (D) bulunan ortalama larva (±SE) sayısı). Kesme veya MSF yöntemleri (yüzdürme dahil, n = 5) kullanılarak işlenen meyveler, 5 üçüncü instar larvası ile manuel olarak istila edildi. Çubukların üzerindeki yıldız işaretleri, Kruskal-Wallis testlerine dayanan meyve kesimine kıyasla papaya (χ 2 = 5.39, p = 0.02) ve mangoda (χ2 = 3.94, p = 0.05) bulunan larva sayısı için önemli farklılıklar göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Düşük Bactrocera dorsalis istilasını simüle etmek için mango ve papaya’nın manuel istilasını kullanarak susturma-eleme yönteminin (yüzdürme kaldırıldı) doğrulanması. Papaya (kesim: 1.25 ± 0.48, MS: 4.25 ± 0.48) (A) ve mango (kesme: 2.5 ± 0.5, MS: 4.75 ± 0.25) (B) meyvelerinde bulunan ortalama larva (±SE) sayısı ve papaya (kesim: 0.15 ± 0.05, MS: 0.76 ± 0.15) (C) ve mangoda (kesme: 0.16 ± 0.04, MS: 0.44 ± 0.04) (D) bulunan ortalama larva sayısı (±SE). Meyveler manuel olarak 5 üçüncü instar Bactrocera dorsalis larvası ile istila edildi ve kesilerek ve görsel olarak incelenerek (kesme) veya bir torbada susturularak işlendi ve eleklerle yıkandı (sadece yüzdürme ve eleme, n = 4). Çubukların üzerindeki yıldız işaretleri, Kruskal-Wallis testlerine dayanarak, papaya (χ 2 = 5.46, p = 0.02) ve mangoda (χ 2 = 5.25, p = 0.02) bulunan larva sayısı ve papaya (χ 2 = 5.39, p = 0.02) ve mango (χ 2 = 5.39, p = 0.02) işlenme süresi için önemli farklılıklar göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Meyve # İşlenmiş meyve #Larvae eklendi İşleme yöntemi #Larvae bulundu İşlem süresi (min)* % İyileşme Mango 25 25 Kesim 17 158 68% Mango 25 25 MSF 22 113 88% Papaya 16 20 Kesim 13 62 65% Papaya 16 20 MSF 16 40 80% *Toplam süre 5 işçinin toplamıdır. Tablo 1: Kesme ve görsel olarak inceleme (kesme) veya tam susturma, eleme ve yüzer (MSF) yöntemiyle meyveleri işleme süresi ve geri kazanılan larvaların sayısı. Test meyvesi, sıkılmış ve sadece meyveyle kaplanmış (5 mangodan 1’i, 4 papayadan 1’i) karıştırılmış 5 üçüncü instar larva ile manuel olarak istila edildi. Meyve # İşlenmiş meyve #Larvae eklendi İşleme yöntemi #Larvae bulundu İşlem süresi (min)* % İyileşme Mango 20 20 Kesim 10 66 50% Mango 20 20 MS 19 44 95% Papaya 16 20 Kesim 5 38 25% Papaya 16 20 MS 17 25 85% *Toplam süre 4 işçiden fazladır. Tablo 2: Geri kazanılan larva sayısı ve meyveleri sadece keserek veya susturarak ve eleyerek işleme süresi, yüzdürme ihmal edildi (MS). Test meyveleri, sıkılmış ve sadece meyvelerle kaplanmış (5 mangodan 1’i, 4 papayadan 1’i) karıştırılmış beş üçüncü instar larvası ile manuel olarak istila edildi. İşçi/yöntem #Fruit işlendi İşleme süresi (min) #Larvae kesim bulundu MSF’yi #Larvae buldunuz* Kesim yoluyla bulunan toplam sayı larvalarının% ‘si İşçi 1: kesme 5 18 33 14 70% İşçi 2: kesme 5 18 1 5 17% İşçi 3: kesme 5 26 9 11** 75% İşçi 4: kesme 5 20 24 İşçi 5: MSF 10 22 NA 22 NA İşçi 6: MSF 10 18 NA 37 NA * Hamurdan elde edilen kesim ve görsel muayene işlemleri MSF yöntemi kullanılarak tekrar işlenerek geç kaçırılan 2.-3. instar larva sayısı belirlendi ** MSF yöntemi kullanılarak işlenmeden önce havuzda toplanan 2 ve 3 numaralı işçilerin meyvelerinin hamuru Tablo 3: Tarlada toplanan guavada meyveyi keserek ve görsel olarak inceleyerek (keserek) veya meyveyi kasıp kavurarak, eleyerek ve yüzdürerek (MSF) bulunan larva sayısı.

Discussion

Amacımız, sahada tefritid larvalarını bulmak için etkili ve etkili bir yol geliştirmekti. Bir eradikasyon programı başlatmanın veya bir karantina alanı oluşturmanın motivasyonu, üreme popülasyonunu gösteren çiftleşmiş dişi (ler) in veya larva6’nın tespitidir. Mevcut meyve kesme ve görsel olarak arama yöntemi, larvaları bulmada verimsizdir, çünkü genellikle bireysel olarak incelenebilenden çok daha fazla konakçı meyve vardır. Ek olarak, tefrititlerin popülasyonları yeni bir istila alanında muhtemelen düşüktür, bu da büyük miktarda meyvede larva bulma şansını inanılmaz derecede zorlaştırır. Örneğin, Florida’daki 2015 Bactrocera dorsalis eradikasyon programında, 54 farklı konakçı tür tanımlanmış ve 4.000’den fazla meyve kesilmiştir. Bu eradikasyon programında, mangoda sadece birkaç larva bulundu ve başka hiçbir konakçının istila edilmediği bulundu6. MSF / MS yönteminin, meyve kesimine kıyasla toplu olarak çok miktarda posa (mango, guava ve papaya) içeren meyveleri işlerken A. suspensa ve B. dorsalis larvalarını tespit etmede hem daha hassas hem de daha hızlı olduğunu bulduk. Mantarlama ve eleme yöntemini kullanarak incelemenin mümkün olduğu daha büyük miktarda konakçı meyve, nadir bir larva tespitinin artmasıyla birleştiğinde, bir istilanın erken bulunma olasılığını artırabilir. Bir üreme popülasyonunun erken tespiti, yok olma olasılığını artırabilir ve programın maliyetlerini azaltabilir.

Deneylerimiz, meyveleri kesen ve görsel olarak inceleyen işçiler tarafından tespit edilen larva sayısının önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir. Meyve kesen işçiler, mango ve papayalara yerleştirilen B. dorsalis larvalarının sırasıyla% 50 ve% 75’ini kaçırdılar. Buna karşılık, larvaların sadece% 5 ve% 15’i, sırasıyla mango ve papaya meyvesinin işlenmesi için MS yöntemi kullanılarak kaçırıldı. Benzer şekilde, giriş limanlarında meyve kesimini değerlendiren bir çalışma, müfettişler tarafından bulunan istila edilmiş meyve ve larva sayısında önemli farklılıklar olduğunu göstermiştir8. Çalışma, deneyimli liman müfettişlerinin, meyve kesildiğinde ve görsel olarak incelendiğinde A. suspensa larvalarının% 64-99’unu ve% 16 -% 82’sini istila edilmiş meyvelerin% 16-82’sini kaçırdığını göstermiştir8. Sonuçlarımız, susturma ve eleme yönteminin, bir işçinin istila edilmiş bir meyveyi tespit etmeyi kaçırma olasılığını azaltabileceğini göstermektedir.

Şeker ve sıcak su yüzdürme, kiraz ve yaban mersini’nin meyve sineklerinden arındırılmasını sağlamak için bir sistem yaklaşım yönteminde kabul edilen protokollerdir14. Bir gönderinin bir alt kümesi çözeltiye ezilir, bunun üzerine bir müfettiş şeker çözeltisinin yüzeyini yumurta ve larvaların varlığı için görsel olarak tarar. Her ne kadar bireysel meyvelerin kesilmesine kıyasla daha fazla sayıda meyve işlenebilse de, bu teknikleri kullanarak larva bulma olasılığı hala müfettişin yeteneğinden, mevcut larvaların aşamasından ve sayısından ve meyve türünden etkilenir8. Diğer tefrititler gibi, B. dorsalis ve A. suspensa’nın meyve özünden çıktığını ve yüzeye yüzdüğünü bulduk. İlginçtir ki, acil durum ve eradikasyon programlarında hedef olan daha büyük geç instar larvaları ile morfolojik olarak tanımlanabildikleri için, şeker yüzdürme de dahil olmak üzere yöntemin doğruluğunu arttırmadığını bulduk. Aslında, yüzdürme yönteminin eklenmesi, işleme süresini papaya için% 90 ve mango için% 48 oranında arttırmıştır. Artan işlem süresi ve ek malzemeler (örneğin, su, kutular, şeker vb.), Sahada büyük instarlar ararken bu adımın eklenmesini operasyonel olarak desteklemez. Şeker yüzdürme yöntemi, amaç, giriş limanları ve paketleme evleri gibi erken instarlar da dahil olmak üzere tüm aşamaları tespit etmek olduğunda uygun olabilir. Şeker çözeltisinin ince bir elek ile filtrelenmesi, büyük olasılıkla yumurtaların ve erken larva instarlarının en doğru şekilde tespit edilmesini sağlayacaktır11,12.

MS ve MSF teknikleri, kolayca tomurcuklanabilen ve büyük miktarda posa içeren meyvelerle iyi çalışır. Tefritid larvaları meyve özüne girme eğilimindedir, bu da görsel algılamayı zorlaştırır. MS ve MSF yöntemlerinin kritik bir yönü larvaları pulpadan ayırmaktır. Eleme işlemi hamuru uzaklaştırır, böylece larvaları elek elekler üzerinde açığa çıkarır. Benzer şekilde, şekerli su yöntemi, larvaları yüzdürerek larvaları hamurdan ayırırken, kağıt hamuru tava dibine batar. MS veya MSF yöntemleri ile pulpadan ayrılan larvaların elek eleği veya su yüzeyinde hareket ettikleri kolayca gözlemlenir. Karıştırma, eleme ve isteğe bağlı olarak yüzen yöntem, önemli konakçı meyvelerde tefritid larvalarını tespit etme hızını ve doğruluğunu büyük ölçüde artırmış olsa da, işlem tüm meyveler için uygun olmayabilir. Örneğin, yeşil avokado gibi sert hamurlu konakçı meyveler veya büyük bir tohum / çukur ve tropikal badem gibi nispeten az miktarda posa içeren meyvelerin elle kesilmesi ve görsel muayene ile işlenmesi daha kolay olabilir.

MS ve MSF yöntemlerinin, nispeten az sayıda meyve (5-10) işlendiğinde daha hızlı olduğunu bulduk. Daha büyük miktarlarda meyve işlenirse, acil durum meyve sineği programlarının gerekli ve tipik bir örneği olabilecek fark muhtemelen daha büyük olacaktır. Şamandıra adımının kaldırılması, büyük tefritid larvalarını (>3 mm) bulma doğruluğundan ödün vermeden algılama hızını daha da artırdı. Bu tekniklerin, acil bir meyve sineği programı sırasında işçilerin yaşadığı koşulları simüle eden sahaya götürülebileceğini gösterdik. Çalışmalarımız, MS yöntemlerinin geç instar larvalarının daha zamanında saptanmasına ve daha sonra tefritid üreme popülasyonlarının yok edilmesine izin verebileceğini göstermektedir. MSF, şu anda eradikasyon programları tarafından hedeflenmeyen yumurtaları ve erken instarları tespit etmek için kullanılabilir.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Florida Üniversitesi’nde guavanın işlenmesinde yardım için Silvia Durand, Teri Allen, Jose Alegria ve Alejandra Canon’a, Hawaii’de yapay olarak istila edilmiş meyvenin değerlendirilmesinde yardımcı oldukları için Rick Kurashima, Jean Auth ve Bruce Inafuku’ya ve el yazmasının önceki sürümleri hakkında yararlı yorumlar için Michael Stulberg’e teşekkür ederiz. Bu proje kısmen USDA APHIS ve Florida Üniversitesi İşbirliği Anlaşması tarafından finanse edilmiş ve kısmen USDA-ARS (proje 2040-22430-027-00D) tarafından desteklenmiştir. Bu ön yayındaki bulgular ve sonuçlar USDA tarafından resmi olarak dağıtılmamıştır ve herhangi bir ajans kararını veya politikasını temsil edecek şekilde yorumlanmamalıdır. Bu yayında ticari isimlerden veya ticari ürünlerden bahsedilmesi yalnızca belirli bilgileri sağlamak içindir ve USDA tarafından tavsiye veya onay anlamına gelmez. USDA eşit fırsat sağlayıcı ve işverendir.

Materials

Anti foamer MicroLubrol ML200-50-4 MicroLubrol 2000 Fluid Pure Silicone Oil, https://www.microlubrol.com
Brown Sugar Dominos 1 lb Box  Dark Brown Sugar Crystals, https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar
Cutting Boards KitchenAid KE703NOSMGA KitchenAid Classic Nonslip Plastic Cutting Board, 12×18-Inch, https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11×14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&crid=UXMLNC72BL0
M&cv_ct_cx=cutting%2Bboards&keywords=cutting%2Bboards
&pd_rd_i=B091118V8T&pd_rd_r=
4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313
2f8e34&pd_rd_w=li862&pd_rd_wg
=KogbB&pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&pf_rd_r=9ATJD6W
QBF9DVRY889MP&qid=1673911
429&refresh=1&sprefix=cutting%2Bboards%2Caps%2C198&sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&th=1
Dish Pans Sterilite 06578012 White 12 qrt Dishpan, https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&keywords=
white+12+qt+dishpan+sterilite&qid=1673911729&s=home
-garden&sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&sr=1-1
EthOH Fisher Scientific BP8202500 Ethanol Solution 96%, Molecular Biology Grade, https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500
Glass Vials Fisher Scientific 0333921H Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials With Closures, https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H
Knives Zyliss 31380 5.25" Utility Knife, https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&keywords=
fruit%2Bcutting%2Bknives&qid=1673911609&s=
home-garden&sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&sr=1-7&th=1
No. 20 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4221 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 45 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4226 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
No. 8 Mesh sieves Hogentogler & Co. Inc. 4215 U.S. Standard Testing Sieves, https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp
Soft Forceps DR Instruments DRENTF01 DR Instruments Featherweight Entomology Forceps, https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q
Zipper Lock Storage Bags Ziploc 682254 Ziploc brand 2 gal Clear Freezer Bags, https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&keywords=
ziploc+freezer+bags+2+gallon&qid=1674504602&
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, I. M., Elson-Harris, M. M. . Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics. , (1992).
  2. Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466 (2013).
  3. Suckling, D. M., et al. Eradication of tephritid fruit fly pest populations: outcomes and prospects. Pest Management Science. 72 (3), 456-465 (2016).
  4. Mcinnis, D. O., et al. Can polyphagous invasive tephritid pest populations escape detection for years under favorable climatic and host conditions. American Entomologist. 63 (2), 89-99 (2017).
  5. Mutamiswa, R., Nyamukondiwa, C., Chikowore, G., Chidawanyika, F. Overview of oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) (Diptera: Tephritidae) in Africa: From invasion, bio-ecology to sustainable management. Crop Protection. 141, 105492 (2021).
  6. Steck, G., et al. Oriental fruit fly eradication in Florida 2015-2016: program implementation, unique aspects, and lessons learned. American Entomologist. 65 (2), 108-121 (2019).
  7. Alvarez, S., Evans, E., Hodges, A. W. Estimated costs and regional economic impacts of the oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis) outbreak in Miami-Dade County, Florida. University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , (2016).
  8. Gould, W. Probability of detecting Caribbean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation by fruit dissection. Florida Entomologist. 73 (3), 502-507 (1995).
  9. Yee, W. L. Detection of Rhagoletis indifferens (Diptera: Tephritidae) larvae using brown sugar flotation and hot water methods. Journal of Applied Entomology. 136 (7), 549-560 (2012).
  10. Yee, W. L. Comparison of the brown sugar, hot water, and salt methods for detecting western cherry fruit fly (Diptera: Tephritidae) larvae in sweet cherry. Florida Entomologist. 97 (2), 422-430 (2014).
  11. Van Timmeren, S., Diepenbrock, L. M., Bertone, M. A., Burrack, H. J., Isaacs, R. A filter method for improved monitoring of Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) larvae in fruit. Journal of Integrated Pest Management. 8 (1), 23 (2017).
  12. Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries. Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).
  13. Balagawi, S., et al. Evaluation of brown sugar flotation for detecting Queensland and Mediterranean fruit fly (Diptera: Tephritidae) infestation in Australian cherries. Crop Protection. 151, 105823 (2022).
  14. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). Directive D-02-04: The Blueberry Certification Program and domestic phytosanitary requirements to prevent the spread of blueberry maggot (Rhagoletis mendax) within Canada. 2 Revision 10. CFIA (Canadian Food Inspection Agency). , (2020).
  15. Kendra, P. E., et al. Gas chromatography for detection of citrus infestation by fruit fly larvae (Diptera: Tephritidae). Postharvest Biology and Technology. 59 (2), 143-149 (2011).
  16. SAS Institute Inc. SAS 9.4 Guide to Software Updates and Product Changes. SAS Institute Inc. , (2013).

Tags

Tephritid Fruit FliesFruit Pulp SievingLarval DetectionAnastrepha SuspensaGuavaMangoPapayaInfestationEradication ProgramMushingSievingBrown Sugar Water SolutionImmature Life StagesLabor-intensiveCutting FruitVisual InspectionExtraction TechniqueField-collectedLow Infestation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Roda, A. L., Steck, G., Fezza, T., Shelly, T., Duncan, R., Manoukis, N., Carvalho, L., Fox, A., Kendra, P., Carrillo, D. Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field. J. Vis. Exp. (197), e65501, doi:10.3791/65501 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image