איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר
Summary
שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ”א בתאי נבט נקביים של יונקים.
Abstract
הביציות הן בין התאים הגדולים ומאריכי החיים ביותר בגוף הנשי. הם נוצרים בשחלות במהלך ההתפתחות העוברית ונשארים נעצרים בשלב של מיוזה I. המצב השקט עשוי להימשך שנים עד שהביציות מקבלות גירוי לגדול ולקבל את היכולת לחדש את המיוזה. מצב מעצר ממושך זה הופך אותם לרגישים ביותר לצבירת עלבונות מזיקים לדנ”א, המשפיעים על השלמות הגנטית של הגמטות הנקביות, ולכן, על שלמותו הגנטית של העובר העתידי.
לפיכך, יש חשיבות מכרעת לפיתוח שיטה מדויקת לאיתור נזק לדנ”א, שהיא הצעד הראשון להקמת מנגנוני תגובה לנזקי דנ”א. מאמר זה מתאר פרוטוקול נפוץ לבדיקת נוכחות והתקדמות של נזק לדנ”א בביציות שנעצרו בשלב במהלך תקופה של 20 שעות. באופן ספציפי, אנו מנתחים שחלות עכברים, שולפים את קומפלקסי קומולוס-ביציות (COC), מסירים את תאי הקומולוס מה-COC, ומתרבתים את הביציות בתווך Μ2 המכיל 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין כדי לשמור על מצב המעצר. לאחר מכן, הביציות מטופלות בתרופה ציטוטוקסית, אנטי-ניאופלזמה, אטופוסיד, כדי לגרום לשברים דו-גדיליים (DSB).
על ידי שימוש באימונופלואורסנציה ובמיקרוסקופ קונפוקלי, אנו מזהים ומכמתים את רמות חלבון הליבה γH2AX, שהוא הצורה הזרחנית של ההיסטון H2AX. H2AX הופך לפוספורילציה באתרים של DSB לאחר נזק לדנ”א. חוסר היכולת לשחזר את שלמות הדנ”א בעקבות נזק לדנ”א בביציות עלול להוביל לאי פוריות, למומים מולדים ולשיעורים מוגברים של הפלות ספונטניות. לכן, הבנת מנגנוני התגובה לנזק לדנ”א, ובה בעת ביסוס שיטה שלמה לחקר מנגנונים אלה, חיוניים לחקר הביולוגיה של הרבייה.
Introduction
תהליך המיוזה בתאי נבט נקביים של יונקים מתחיל בשחלות לפני הלידה. המספר הכולל של הביציות נקבע בשחלות בעיקר במהלך embryogenesis. הביציות נכנסות למיוזה ונשארות עצורות בשלב I1. לאחר תחילת ההתבגרות המינית והייצור והפעולה האנדוקרינית של הורמון מגרה זקיק (FSH) והורמון luteinizing (LH), הביציות עשויות ליזום מחדש ולהשלים מיוזה2. אצל בני אדם, מעצר שלב יכול להימשך עד 50 שנה3. חלוקות התאים לאחר הכניסה למיוזה I אינן סימטריות, וכתוצאה מכך נוצר גוף קוטבי קטן וביצית השומרת על גודלה. לכן, רוב המרכיבים cytoplasmic מאוחסנים ooplasm במהלך embryogenesis מוקדם4. לאחר מכן, הביציות נכנסות למיוזה II, מבלי לשנות מחדש את הגרעין שלהן או לפרק את הכרומוזומים שלהן, ונשארות כלואות במטא-פאזה II עד להפריה5.
מאפיין ייחודי המבדיל בין ביציות לתאים סומטיים הוא מצב המעצר בשלב I, כאשר לביצית יש גרעין שלם (מעצר שלפוחית נבט [GV]), המכונה שלבGV 6. בהתבסס על ארגון הכרומטין, הביציות בשלב GV מסווגות לשתי קטגוריות: גרעין לא מוקף (NSN) וגרעין מוקף (SN)7,8. בביציות בשלב ה-GV של NSN, הכרומטין מתפשט בכל האזור הגרעיני, והשעתוק פעיל, ואילו בביציות SN, הכרומטין יוצר טבעת קומפקטית המקיפה את הגרעין, והשעתוק שקט9. שני סוגי הביציות בשלב GV מראים יכולת מיוטית; הן נכנסות למיוזה באותו קצב, אך הביציות של NSN מציגות יכולת התפתחותית נמוכה ואינן יכולות להתפתח מעבר לעובר בן שני התאים10.
המצב הממושך של מעצר שלב I מעלה את שכיחות הצטברות הנזק לדנ”א11. לכן, מנגנוני התגובה לנזק לדנ”א בביציות חיוניים כדי לאפשר ייצור של גמטות בעלות שלמות גנטית ולהבטיח שלעובר שנוצר יש תוכן כרומוזומלי פיזיולוגי.
היבט מרכזי של תגובת הנזק לדנ”א הוא תיקון דנ”א. המסלולים העיקריים לתיקון DSB בתאים אאוקריוטים כוללים הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), רקומבינציה הומולוגית (HR) וחלופה NHEJ 12,13,14,15. NHEJ הוא מנגנון מהיר יותר אך נוטה יותר לשגיאות, בעוד HR דורש יותר זמן כדי להשלים אבל יש נאמנות גבוהה16.
אין מספיק ידע על המנגנונים שבהם הביציות משתמשות לתיקון נזקי דנ”א. מחקרים הראו כי נזק לדנ”א הנגרם בביציות יונקים בוגרות לחלוטין על ידי שימוש בחומרים גנוטוקסיים, כגון אטופוסיד, דוקסורוביצין או UVB או קרינה מייננת, אינו משפיע על העיתוי וקצב היציאה משלב I מעצר17. ביציות יכולות לעבור פירוק GV (GVBD) גם בנוכחות רמות גבוהות של נזק. נזק זה יכול להיקבע על ידי תצפית של γH2AX. צורה זרחנית זו של H2AX (γΗ2ΑΧ) היא סמן DSB, הממוקם באתר של שברים ומתפקד כפיגום כדי לסייע בתיקון גורמים וחלבונים להצטבר בקצוות שבורים18.
היעדר מעצר מחזור התא בעקבות נזק לדנ”א נובע ממחסום נזק DNA לא מספיק המאפשר לביציות עם DNA לא מתוקן להיכנס מחדש למיוזה. בעקבות רמות גבוהות של נזק לדנ”א, מחסום יכול לשמור על מעצר שלב באמצעות הפעלת מסלול תלוי ATM/Chk1. תגובת הבידוק המוגבלת ל-DSB נובעת מההפעלה המוגבלת של כספומט17,19. בשלב M של מיוזה I, מחקרים הראו כי נזק לדנ”א עשוי להפעיל מחסום מיוזה I המושרה על ידי ציר (SAC), אשר מונע את ההפעלה של E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) ולכן, יציאה משלב M. יתר על כן, אבלציה של חלבוני SAC מתגברת על מצב של מעצר שלב M, ובכך מדגישה את חשיבותו של SAC בביסוס המיוזה I chekpoint20.
כפי שמחקרים קודמים מראים בבירור, DSBs אינם יכולים לגרום למחסום פאזה חזק בביציות עכבר. אם נזק כזה לא יתוקן, הוא עלול להוביל לעוברים הנושאים הפרעות כרומוזומליות. לכן, חשוב לחקור את תגובת הנזק לדנ”א בשלבים שונים של הגמטוגנזה הנשית כדי להבין טוב יותר את המסלולים הייחודיים שבהם הביציות משתמשות כדי להתמודד עם עלבונות גנטיים פוטנציאליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות השיטה המתוארת כאן, זיהינו DSB בביציות יונקים. שיטה זו מאפשרת איתור ולימוד של תהליך תיקון הדנ”א בביציות. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם לניתוח חלבונים אחרים המשתתפים בתהליכים פיזיולוגיים בביציות יונקים. חשוב לחקור כיצד הביציות מגיבות לנזק פוטנציאלי לדנ”א על מנת להבין טוב יותר את הגורם לתת-פוריות נשית בבני אדם.
חקר תגובת הנזק לדנ”א בביציות יונקים יכול להיות מאתגר בגלל הרגישות של הביציות. טיפול בביציות דורש טמפרטורות ספציפיות וריכוזי CO 2ו-O 2. יחד עם זאת, הביציות חייבות להיות מוגנות מפני אור. הטיפול צריך להיעשות על ידי שימוש בפיפטות זכוכית שאינן צרות, שכן הדבר עלול להזיק לביציות, אך גם לא לרוחב, שכן הדבר עלול לגרום לדילול המדיום ובכך להשפיע לרעה על הליך הקיבוע. בכל שלב של קיבוע, כמה טיפות של חוצצים משמשים כדי למזער את אפקט דילול. דרך חלופית לתצפית ב-DSB היא בדיקת השביט24. למרות שטכניקה זו רגישה יותר, היא מורכבת יותר. יחד עם זאת, באמצעות שימוש בניסוי השביט לא ניתן לזהות את אזור הדנ”א המדויק שבו מתרחש הנזק, ובתאים עם מולקולות רנ”א בשפע, כמו ביציות בשלב GV 25, הרקע יכול להיות מוגבר, מה שיוביל לאות נזק כוזבלדנ“א26.
על ידי שימוש בפרוטוקול immunofluorescence המתואר כאן, אנו יכולים לזהות DSB בדיוק ולהעריך את התקדמות התיקון בביציות בשלב GV, כפי שמצוין על ידי הפחתת פלואורסצנטיות γH2AX לאורך זמן. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי נוגדנים מסוימים עשויים להציג פיזור לא ספציפי ברחבי ooplasm, ובכך להוביל תמונות עם פלואורסצנטיות רקע גבוהה. מאגר PFA-Tx-100 משמש במקום PFA רציף ו- Tx-100, כפי שראינו כי הוא משפר את תהליך הקיבוע בכך שהוא מאפשר זיהוי של פחות רקע ופלואורסצנטיות לא ספציפית. מגבלה שנייה של שימוש ב- γH2AX לזיהוי DSB היא שלא ניתן להעריך נזק לאחר GVBD בגלל הזרחן הספונטני של γH2AX במיוזה23.
בפרוטוקול אימונופלואורסנציה זה, הביציות נשארות במאגר נוזלי ולא ניתן לאחסן אותן בתוך שקופיות. עובדה זו מקשה על שימור התאים הקבועים במשך ימים לאחר הוספת הנוגדן המשני. על מנת להשיג תמונות באיכות טובה ולא לאבד אות, עדיף לבצע את ההדמיה תוך מספר שעות לאחר הוספת הנוגדן המשני. כמו כן יש לציין כי סריקת הגרעינים דרך ציר Z עלולה לגרום לאות להיחלש עקב חשיפת יתר. מסיבה זו, עדיף להוריד את עוצמת הלייזר ולהגביר את מהירות הסריקה.
לבסוף, מגבלה נוספת של פרוטוקול האימונופלואורסנציה היא שניתן להשתמש בו רק עבור תאים קבועים / לא חיים. לכן, אנו יכולים להעריך רק את נוכחותם והיעדרם של גורמים בנקודות זמן ספציפיות מבלי לדעת אם יש תנודות בריכוזם או שינויים בהתנהגותם לאורך זמן. ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות דימות תאים חיים וסמנים מתויגים פלואורסצנטית.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על תמיכה בעבודה זו מהפרויקט “הקמת תשתיות ‘בניית יכולות’ במחקר ביו-רפואי (BIOMED-20)” (MIS 5047236), המיושם במסגרת הפעולה “חיזוק תשתית המחקר והחדשנות”, במימון התוכנית האופרטיבית “תחרותיות, יזמות וחדשנות” (NSRF 2014-2020), ובמימון משותף של יוון והאיחוד האירופי (הקרן האירופית לפיתוח אזורי).
Materials
| 3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
| 10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
| Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
| ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
| BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| BD Microlance 3 Needles 27 G – 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
| DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
| Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
| FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
| FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
| Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
| HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
| IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
| Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
| M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| NaN3 | Honeywell | 13412H | |
| NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
| Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
| Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
| pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
| QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
References
- Wang, X., Pepling, M. E. Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).
- Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes. Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).
- Adhikari, D., et al. Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan. Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).
- Sun, S. C., Kim, N. H. Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).
- Jones, K. T. Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression. Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).
- Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells. Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).
- Sun, X., et al. Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq. Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).
- Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).
- Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing. Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).
- Lieber, M. R. The mechanism of human nonhomologous DNA end joining. The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).
- Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
- Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
- Shibata, A., Jeggo, P. A. Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair. Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).
- Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer. Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).
- Marangos, P., Carroll, J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).
- Marangos, P., et al. DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age. Nature Communications. 6, 8706 (2015).
- Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration. Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).
- Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G. Molecular mechanisms of etoposide. EXCLI Journal. 14, 95-108 (1998).
- Mayer, A., et al. DNA damage response during mouse oocyte maturation. Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).
- Olive, P., Banáth, J. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).
- Wu, D., Dean, J. EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).
- Simon, L., Emery, B., Carrell, D., Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. DNA damage: COMET assay. Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. , 202-212 (2021).
