Rilevamento degli anticorpi IgG e IgM della rabbia utilizzando il test degli anticorpi fluorescenti indiretti della rabbia
Summary
Lo scopo di questo manoscritto è quello di esaminare l’uso del test degli anticorpi fluorescenti indiretti per la rabbia per la rilevazione di anticorpi IgG e IgM specifici per la rabbia.
Abstract
Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) per la rabbia è stato sviluppato per rilevare vari isotipi di anticorpi anti-rabbia specifici nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Questo test fornisce risultati rapidi e può essere utilizzato per rilevare gli anticorpi antirabbici in diversi scenari. Il test antirabbico IFA è particolarmente utile per la diagnosi rapida e precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria in un paziente che ha sviluppato la rabbia. Sebbene altri metodi per la diagnosi di rabbia ante mortem abbiano la precedenza, questo test può essere utilizzato per dimostrare la recente esposizione al virus della rabbia attraverso il rilevamento degli anticorpi. Il test IFA non fornisce un titolo anticorpale neutralizzante il virus (VNA), ma la risposta della profilassi pre-esposizione (PrEP) può essere valutata attraverso la presenza di anticorpi positivi o negativi. Questo test può essere utilizzato in varie situazioni e può fornire risultati per una serie di obiettivi diversi. In questo studio, abbiamo utilizzato diversi campioni di siero accoppiati di individui che hanno ricevuto la PrEP e abbiamo dimostrato la loro presenza di anticorpi antirabbici nel tempo utilizzando il test IFA.
Introduction
Il test degli anticorpi fluorescenti indiretti (IFA) della rabbia viene utilizzato per rilevare vari isotipi di anticorpi specifici per la rabbia nei sieri o nel liquido cerebrospinale. Fa parte di un arsenale di test disponibili per il monitoraggio di un paziente con rabbia ante mortem. È particolarmente utile per la diagnosi precoce degli anticorpi per valutare la risposta immunitaria di un paziente all’infezione da rabbia. Se utilizzato in combinazione con altri test, l’anamnesi e lo stato di vaccinazione del paziente, il test IFA può aiutare a determinare l’esposizione al virus della rabbia o a un vaccino1. Poiché il test IFA misura le IgM e/o le IgG, i valori dell’anticorpo specifico possono indicare un lasso di tempo approssimativo dall’esposizione all’antigene1. Questo test può essere utile nelle applicazioni elencate o in altre non ancora esplorate.
Sono disponibili diversi test sierologici per la rabbia. Il test rapido di inibizione della concentrazione fluorescente (RFFIT), il test di neutralizzazione del virus degli anticorpi fluorescenti (FAVN) o le modifiche di questi sono i metodi principali per misurare gli anticorpi neutralizzanti il virus della rabbia (RVNA)1. Tuttavia, questi test non differenziano gli anticorpi IgM e IgG. Quando la differenziazione dell’isotipo anticorpale è importante nel monitoraggio della risposta immunitaria della rabbia, vengono utilizzati i test IFA della rabbia e il test ELISA (Rabies Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), che però non misurano le RVNA. Sebbene i test IFA ed ELISA possano essere utilizzati per determinare la presenza di anticorpi specifici per la rabbia in un campione, ci sono alcune differenze nel modo in cui vengono eseguiti. Il test IFA utilizza un virus vivo in coltura cellulare come substrato dell’antigene, mentre un tipico test ELISA per il rilevamento della rabbia utilizza una o più proteine virali. In un ambiente di laboratorio in cui il virus della rabbia può essere coltivato, il test IFA può essere eseguito più facilmente invece di acquistare o coltivare singole proteine virali per l’ELISA. Lo scopo del test e le informazioni raccolte dai risultati di qualsiasi test sierologico della rabbia devono essere presi in considerazione quando si determina quale scegliere2.
Le IgM sono le prime a rispondere, aumentando fino a quando non si osserva il cambio di classe intorno al giorno 28, a quel punto le IgG diventano l’anticorpo circolante3 predominante. Pertanto, le IgM sarebbero previste solo per un periodo di tempo limitato dopo l’esposizione al virus della rabbia o la vaccinazione. L’analisi sia del siero che del liquido cerebrospinale (CSF) può indicare se l’esposizione è avvenuta attraverso la vaccinazione, in cui gli anticorpi sarebbero visibili solo nel siero, o da un’infezione virale, che potenzialmente mostrerebbe anticorpi nel CSF1.
È stato stabilito che gli anticorpi antirabbici persistono per diversi anni dopo la profilassi pre-esposizione (PrEP)4. Il test IFA può essere uno strumento utile per dimostrarlo in diversi momenti successivi alla vaccinazione o all’esposizione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test IFA sfrutta un complesso antigene-anticorpo, consentendo a un sito di marcatura di visualizzare gli anticorpi specifici per la rabbia. Le cellule di neuroblastoma o BHK vengono seminate su vetrini da microscopio rivestiti in PTFE a più pozzetti e inoculate con il ceppo di laboratorio CVS-11 del virus della rabbia. Una volta che il monostrato è confluente e le cellule raggiungono l’infettività desiderata di circa il 50%, i vetrini vengono conservati fino al momento dell’uso6.
<p clas…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Wadsworth Center del Dipartimento della Salute dello Stato di New York per aver sostenuto questo progetto.
Materials
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well Teflon coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500 or 6500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
