ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי מאי-קולי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מפורטת לייצור חיידקים של חלבונים רקומביננטיים, כולל חלבונים המכילים בדרך כלל קשרים בלתי מסיסים או דיסולפידים, ארוזים בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות הקשורות לקרום. יש לכך פוטנציאל להיות מיושם בתחומים מגוונים של מחקר מדעי, כולל ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה.
Abstract
מערכת חדשנית זו, המשתמשת בתג פפטיד קצר, המייצא חלבונים רקומביננטיים מרובים בשלפוחיות הקשורות לממברנה מ- E. coli, מספקת פתרון יעיל למגוון בעיות הקשורות לביטוי חלבון רקומביננטי חיידקי. שלפוחיות רקומביננטיות אלה ממדירות חלבונים בתוך מיקרו-סביבה המאפשרת ייצור של חלבונים מאתגרים, רעילים, בלתי מסיסים או דיסולפידים המכילים חלבונים מחיידקים. תפוקת החלבון גדלה במידה ניכרת בהשוואה לביטוי חיידקי טיפוסי בהיעדר תג הפפטיד נוקלציית השלפוחית. שחרור חלבונים ארוזים בשלפוחית תומך בבידוד מתווך התרבית ומאפשר אחסון חלבון פעיל לטווח ארוך. טכנולוגיה זו מולידה תפוקות מוגברות של חלבונים פונקציונליים ארוזים בשלפוחית לעיבוד פשוט במורד הזרם עבור מגוון רחב של יישומים, החל מביוטכנולוגיה יישומית ועד מדע גילוי ורפואה. במאמר הנוכחי ובסרטון הנלווה אליו, מובא פרוטוקול מפורט של השיטה, המדגיש שלבים מרכזיים במתודולוגיה למקסום ייצור שלפוחית מלאה בחלבון רקומביננטי.
Introduction
חיידק הגראם-שלילי E. coli הוא מערכת אטרקטיבית לייצור חלבונים רקומביננטיים בקנה מידה תעשייתי ואקדמי כאחד. זה לא רק חסכוני ופשוט לתרבית בקבוצות לצפיפויות גבוהות, אלא הוקם ספקטרום רחב של ריאגנטים, זנים, כלים ומקדמים כדי לקדם את ייצור החלבונים הפונקציונליים ב- E. coli1. בנוסף, טכניקות ביולוגיה סינתטית מתגברות כיום על מכשולים הקשורים בדרך כלל ליישום שינויים לאחר תרגום וקיפול חלבונים מורכבים2. היכולת למקד את הפרשת החלבונים הרקומביננטיים לתרבית אטרקטיבית לשיפור היבול ולהוזלת עלויות הייצור. אריזה מבוקרת של חלבונים המוגדרים על-ידי המשתמש לתוך בועיות הממברנה מסייעת בפיתוח מוצרים וטכנולוגיות בתעשיות הביוטכנולוגיה היישומית והרפואה. עד כה, חסרו שיטות ישימות להפרשת חלבונים רקומביננטיים מ- E. coli 3.
איסטווד ועמיתיו פיתחו לאחרונה שיטה מבוססת תיוג פפטידי לייצור ובידוד שלפוחיות המכילות חלבון רקומביננטי מ- E. coli1. פפטיד נוקלטינג שלפוחית זה (VNp) מאפשר ייצור שלפוחיות קרום חיידקים חוץ-תאיות, שלתוכן ניתן לכוון את החלבון הרקומביננטי המועדף כדי לפשט את הטיהור והאחסון של חלבון המטרה, ומאפשר יבולים גבוהים משמעותית מהמותר בדרך כלל מרעידות תרביות בקבוקים. דווח על תפוקות של קרוב ל-3 גרם חלבון רקומביננטי לליטר תרבית בקבוקים, עם תפוקות גבוהות פי >פי 100 מאלה שהתקבלו עם חלבונים מקבילים חסרי תג VNp. שלפוחיות רקומביננטיות מועשרות בחלבון אלה ניתנות לטיהור וריכוז מהיר ממצע התרבית ומספקות סביבה יציבה לאחסון. טכנולוגיה זו מהווה פריצת דרך משמעותית בייצור חלבון רקומביננטי E. coli. השלפוחיות ממדירות חלבונים רעילים ובעלי קשר דיסולפיד בצורה מסיסים ופונקציונליים, ותומכות בטיהור פשוט, יעיל ומהיר של חלבונים פונקציונליים ארוזים בשלפוחית לאחסון לטווח ארוך או עיבוד ישיר1.
היתרונות העיקריים שטכנולוגיה זו מציגה על פני הטכניקות הנוכחיות הם: (1) הישימות למגוון גדלים (1 kDa עד >100 kDa) וסוגי חלבונים; (2) הקלה על היווצרות קשר דיסולפיד בין-חלבוני ותוך-חלבוני; (3) חל על קומפלקסים רב-חלבוניים; (4) ניתן לשימוש עם מגוון מקדמים וזני E. coli מעבדה סטנדרטיים; (5) הפקת יבולים של חלבונים מרעידות צלוחיות שבדרך כלל רואים רק בתרביות תסיסה; חלבונים מיוצאים ונארזים לבועיות הקשורות לממברנה אשר (6) מספקות סביבה יציבה לאחסון החלבון המסיס הפעיל; ו-(7) מפשט את העיבוד במורד הזרם ואת טיהור החלבונים. כלי חלבון רקומביננטי פשוט וחסכוני זה עשוי להשפיע לטובה על תעשיות הביוטכנולוגיה והרפואה, כמו גם על מדע הגילוי.
כאן, פרוטוקול מפורט, שפותח במשך מספר שנים, מתאר את התנאים האופטימליים לייצור שלפוחיות מלאות חלבון רקומביננטי מחיידקים עם טכנולוגיית VNp. תמונות לדוגמה של מערכת זו בפועל מוצגות, עם חלבון פלואורסצנטי מבוטא, המאפשר נוכחות של שלפוחיות בשלבים שונים של הייצור, טיהור וריכוז כדי להמחיש. לבסוף, ניתנת הדרכה כיצד להשתמש בהדמיה של תאים חיים כדי לאמת את הייצור של בועיות המכילות איחוי VNp מהחיידקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוייגת בפפטיד אמינו-טרמינלי לייצור חלבונים רקומביננטיים שתוארה לעיל היא תהליך פשוט, אשר מניב באופן עקבי כמויות גדולות של חלבון שניתן לבודד ביעילות ו / או לאחסן במשך חודשים.
חשוב להדגיש את השלבים המרכזיים בפרוטוקול הנדרשים לשימוש מיטבי במערכת זו. ראשית, תג VNp1 חייב להיות ממוקם במסוף N, ואחריו החלבון של עניין וכל תגים מתאימים. חשוב גם להימנע משימוש באנטיביוטיקה המכוונת לשכבת הפפטידוגליקן, כגון אמפיצילין.
במונחים של תנאי גידול, מדיה עשירה (למשל, מדיה LB או TB) ויחס שטח פנים:נפח גבוה נחוצים כדי למקסם את ייצור השלפוחית. הטמפרטורה האופטימלית לייצור שלפוחיות חוץ-תאיות היא 37 מעלות צלזיוס, אך יש לקחת בחשבון גם את התנאים הדרושים בדרך כלל לביטוי החלבון המעניין. לטמפרטורות אינדוקציה נמוכות יותר, יש להשתמש ב-VNp6. באופן מכריע, אינדוקציה של מקדם T7 חייבת להיות מושגת באמצעות לא יותר מ 20 מיקרוגרם / מ”ל (84 מיקרומטר) IPTG ברגע שהתאים מגיעים OD600 של 0.8-1.0. חלבונים המבוטאים באמצעות המערכת מגיעים לייצור שלפוחית מקסימלי תוך 4 שעות או לאחר אינדוקציה של לילה.
למרות הפשטות של פרוטוקול זה, הוא דורש אופטימיזציה. היתוך גרסאות VNp, טמפרטורות ביטוי ופרקי זמן אינדוקציה עשויים להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. יתר על כן, יש צורך לייעל את הטיהור ואת הריכוז הבא של שלפוחיות חוץ תאיות מן התקשורת. ההליך הנוכחי אינו ניתן להרחבה ויכול לגזול זמן. אלה המגבלות של מתודולוגיה זו.
לטכנולוגיית VNp יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות2. הוא מאפשר ייצוא שלפוחית של חלבונים מגוונים, כאשר הגודל המקסימלי שבא לידי ביטוי בהצלחה עד כה הוא 175 kDa עבור שלפוחיות שנותרו פנימיות ו 85 kDa עבור אלה המיוצאים. יתר על כן, טכנולוגיה זו יכולה להגדיל באופן משמעותי את התשואה של חלבונים רקומביננטיים עם מגוון תכונות ופעילויות פיזיקליות. ניתן לבודד בועיות מיוצאות המכילות את החלבון המעניין על ידי סינון פשוט מהמדיה שסולקה מראש ולאחר מכן ניתן לאחסן אותן, בתרבית סטרילית או בחיץ, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
היישומים עבור מערכת זו מגוונים, החל ממדע גילוי ועד ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה (למשל, באמצעות ייצור של טיפולים פונקציונליים)3. קלות הייצור, העיבוד במורד הזרם והתשואה הגבוהה הן כולן תכונות אטרקטיביות בתחומים אלה ובמיוחד בתעשייה.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למשתמשי טוויטר מגוונים שהעלו שאלות לגבי הפרוטוקול המוצג במאמר המתאר את טכנולוגיית VNp. איור 1A נוצר באמצעות סמלים מ-flaticon.com. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קנט ובמימון מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/T008/768/1 ו- BB/S005544/1).
Materials
| Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
| E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
| E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
| Filters for microscope | Chroma | ||
| FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
| ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
| Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
| LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
| Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
| Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
| MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
| Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
| Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
| Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |
References
- Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
- Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).
- Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
- Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
- Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).
- Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).
