生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

1. バイオセンサープラスミドの作製、酵母ゲノムへの組み込み、ミトコンドリアへのmtHyPer7の標的化とミトコンドリア形態、細胞増殖速度、酸化ストレス感受性への影響の評価 注:バイオセンサーの構築と特性評価に使用されるバイオセンサープラスミドの構築、株、プラスミド、およびプライマーについては、それぞれ補足ファイル1、補足表S1、補足表S2、および補足表S3を参照してください。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、材料表を参照してください。 プライマーY290およびY291(図2)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、バイオセンサープラスミドからバイオセンサーコンストラクトを増幅します。 500 ng の Cas9/ガイド RNA プラスミド (YN2_1_LT58_X2site32) をステップ 1.1 の PCR 産物 50 μL (バイオセンサーコンストラクト) と混合します。 酢酸リチウム法35 を使用して混合物を出芽酵母に変換し、200 mg/mL G418 を含む YPD プレート上で形質転換体を選択します。 プライマーY292およびY293を用いたゲノムDNAのPCR増幅により、候補形質転換体をスクリーニングします。予想されるサイズ(正:3.5 kb、負:0.3 kb)のインサートを持つ形質転換体については、さらに検証するために挿入領域を配列決定します。 バイオセンサーが成長とミトコンドリア機能に及ぼす影響を評価します(図3)。バイオセンサーが細胞やミトコンドリアの機能に影響を及ぼしていると思われる場合は、プロモーター、統合部位、または親株を変更することで、その影響を最小限に抑えるようにしてください。前述のように、酸化ストレッサー(例えば、パラコート)の存在下および非存在下での成長率に対するバイオセンサー構築物の影響を決定する36。中対数期の細胞を、処理の有無にかかわらず、対応する培地 200 μL 中で 600 nm の光学密度(OD600)0.0035 に希釈し、96 ウェル平底プレートの各ウェルに入れます。プレートリーダーを使用して、培養物の光学濃度を20分ごとに72時間測定します。最大成長率(傾き)は、72時間のコース中の240分間隔でのODの最大変化として計算します。 蛍光顕微鏡で細胞を可視化し、前述のように明るさとミトコンドリアの形態を評価します37。細胞を中対数期まで増殖させ、ミトコンドリアを 250 nM MitoTracker Red で 30 分間染色し、2 回洗浄してからイメージングします。広視野蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡で0.3μm間隔で深さ6μmのZスタックを捕捉し、目視検査します。細長い管状構造を形成するミトコンドリアを探します。 図3:mtHyPer7はミトコンドリアを標的としており、ミトコンドリアの形態、細胞増殖、酸化ストレスに対する感受性に影響を与えません 。 (A)mtHyPer7を発現する生きた酵母細胞のミトコンドリア形態。左パネル:488 nm励起で可視化したmtHyPer7。中央のパネル:250 nM MitoTracker Redで標識したミトコンドリア。右パネル:マージされた画像。最大強度の予測が表示されます。セルのアウトラインは白で表示されます。スケールバー = 1 μm。 (B、C)YPD培地中の2.5 mMパラコートの存在下(+PQ)または非存在下で増殖させた野生型細胞およびmtHyPer7を発現する細胞の増殖曲線と最大増殖速度。(D、E)SC培地中の2.5 mMパラコートの存在下(+PQ)または非存在下で増殖した野生型およびmtHyPer7発現細胞の増殖曲線と最大増殖速度。すべての成長曲線は、3つの独立した反復の平均です。最大成長率は、平均±平均の標準誤差(SEM)として表されます。増殖曲線解析は、中対数期の細胞を 200 μL の対応する培地中で OD600 0.0035 に希釈し、96 ウェル平底プレートの各ウェルに注入して行いました。培養物のODは、プレートリーダーを用いて72時間、20分ごとに測定した。各菌株/条件を3重に播種し、平均成長率をプロットしました。最大成長率(傾き)は、72時間にわたる240分間隔のODの変化を使用して計算されました。略語:WT =野生型;PQ = パラコート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 2. 細胞培養とイメージングの準備(図4) 合成培地中の細胞をイメージングのために中対数相まで増殖させます。5 mLのミッドログ期培養では、4枚または5枚のスライドに十分な細胞と、合計>100個の芽細胞を分析できます。実験前日の朝、酵母細胞のコロニーを1つ入れた50mLの円錐底チューブに5 mLの合成完全(SC)培地を接種し、液体前培養を調製します。 前培養をオービタルシェーカーで200rpmおよび30°Cで6〜8時間インキュベートします。前培養のOD600 を測定し、中期に対数期にある必要があります:~0.5-1 × 107 cells/mL、OD600 ~0.1-0.3。 翌日のイメージングのために前培養を使用して中対数期の培養を調製します。一晩の成長(8〜16時間)後の中対数期の培養に必要な前培養の量を計算します。細胞をSC培地で増殖させる場合、倍加時間は~2時間です。したがって、5mLの一晩培養液を接種するための前培養液の容量(V)は、式(1)を用いて計算される:(1) 50 mLの円錐底チューブに5 mLのSC培地に、ステップ2.1.3で計算した前培養量を接種します。オービタルシェーカーで200rpm、30°Cで8〜16時間成長させます。 撮影当日は、ステップ2.1.4で生成した培養物が中対数期(OD600 ~0.1-0.3)であることを確認します。中対数期培養液1 mLから、6,000 × g で30秒間遠心分離することにより、細胞を濃縮します。上澄み液を除去し、チューブ内に10〜20μLの上清を残します。マイクロピペットを使用して残留培地と穏やかに混合することにより、細胞ペレットを再懸濁します。 送風機または糸くずの出ないティッシュを使用して、ガラス顕微鏡スライドからほこりを取り除き、1.8 μLの細胞懸濁液をスライドに加えます。セルを#1.5(厚さ170μm)のガラスカバーガラスで覆い、気泡が入らないようにカバーガラスを斜めにゆっくりと下げます。 すぐに画像化し、10分間のイメージング後にスライドを廃棄します。 図4:細胞増殖とイメージング。 mtHyPer7を発現する出芽酵母細胞は、中期対数期まで増殖します。Zシリーズの画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡で収集され、3D再構成および分析にかけられます。プロトコルのセクション 2-3 を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 3. 撮影条件の最適化と画像収集(図5) イメージングモードを選択します。後処理を伴わない光学セクショニングには、スピニングディスク共焦点装置が好ましい。ただし、信号が低い場合、またはこの機器が利用できない場合は、広視野イメージングを使用し、前述のように、広視野画像がデコンボリューションされて焦点の合っていないぼやけが除去されるようにします38。 光学系を選択します。100倍/1.45プランアポクロマートなどの高開口数油浸レンズを使用してください。 励起波長と発光波長を選択します。スピニングディスク共焦点イメージングには、405 nmおよび488 nmのレーザー励起と標準GFP発光フィルターを使用します。広視野イメージングには、発光ダイオード(LED)またはランプ励起を使用しますが、標準のGFPフィルターに発光を通す間、励起の変動を許容するフィルター設定を確認してください。注:これは、たとえば、GFPキューブから励起フィルターを取り外し、LEDまたはフィルターホイールを使用して励起を選択することで実現できます。 露光時間と照度を選択します。各蛍光チャンネルで容易に検出可能なシグナルと許容可能な分解能が得られるような取得条件を確立します。たとえば、sCMOSカメラを備えたスピニングディスク共焦点顕微鏡では、2 x 2ビニング、20〜40%のレーザー出力、および200〜600ミリ秒の露光を使用します。 イメージのヒストグラムを調べます。 12ビット画像(4,096のグレーレベル)では、ピクセル値の合計ダイナミックレンジが彩度なしで少なくとも数百のグレーレベルであることを確認してください(図5A)。さらに、範囲がノイズレベルよりも1桁高いことを確認してください。ノイズレベルは、手順4.1.3.1の説明に従って測定された、画像のセルフリー領域のピクセル値の標準偏差として計算します。 選択したイメージング条件下で、光退色またはイメージングによるミトコンドリアストレスをテストします。過度の光退色またはミトコンドリアH2O2の増加が観察される場合は、レーザー出力を下げ、露光またはビニングを増加させる。取得間の遅延のないタイムラプス一連の画像を収集し、イメージング条件がミトコンドリアのシグナル安定性と酸化ストレスに及ぼす影響を評価します。顕微鏡取得ソフトウェアまたはImageJを使用して、各蛍光チャンネル の平均ピクセル値 を測定し、シグナルの安定性(<5%変化; 図5B)。実験にタイムラプスイメージングを伴わない場合は、2〜3回のZスタックの繰り返し(25〜35回の露光)で蛍光が安定していることを確認してください。注:両方のチャンネルの蛍光の減少は、光退色を示している可能性があります。しかしながら、488nm励起チャネルの増加を伴う405nm励起蛍光の減少は、オルガネラにおけるミトコンドリアH2O2およびイメージング誘発酸化ストレスの増加を示し得る。 画像を取得します。Z スタックを収集する場合は、データセット内のすべての画像で Z 間隔が同じであることを確認し、セル全体を含めます。出芽酵母の場合、Z間隔0.5μm、総スタック深さ6μmで画像化します。透過光画像を取得して、細胞の境界を記録します。 ImageJ39のフィジーディストリビューションと統計ソフトウェアRを使用して、補足ファイル2および https://github.com/theresaswayne/biosensor で利用可能なスクリプトを介して、手動または半自動で画像を解析します(図6)。ソフトウェアの説明では、階層メニューコマンドは太字で「|」で示され、メニュー選択のシーケンスを示します。オプションとボタンは太字で示しています。 図5:イメージングの最適化 。 (A)正しい強度範囲の画像とヒストグラムの評価。スピニングディスク共焦点像の最大強度投影を示す。ヒストグラムは、画像のダイナミック レンジを示すために、線形の Y 軸 (黒) と対数スケールの Y 軸 (灰色) の両方で表示されます。左のパネル:低強度でダイナミックレンジのノイズの多い画像。センターパネル:許容可能なダイナミックレンジ(~1,000グレーレベル)と強度を持つ画像。右のパネル:コントラストが不適切に強調され、過度の彩度が生じている画像。スケールバー = 1 μm。 (B,C) mtHyPer7の光退色解析連続したZスタックを遅延なく収集し、Zスタックを合計し、ミトコンドリアの平均強度を測定し、最初の時点に正規化しました。最初の 3 つの時点 (27 回の露出) の結果が表示されます。(B)励起波長:405nm。(C)励起波長:488nm。示されている値は、3 つの独立した試行のそれぞれから得られた 3 つのセルの平均です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 4. スクリプトによる半自動解析 バイオセンサー解析スクリプト(例:biosensor.ijmまたはbiosensor-image-subtraction.ijm)を使用して、比率画像を生成および測定します。使用するスクリプトを選択します。各スクリプトを使用するためのプロトコルは似ています。相違点がある場合は、本文中に明記します。biosensor.ijm: このスクリプトでは、背景とノイズは、ユーザーが選択した画像領域、固定値、または減算なしで補正されます。背景とノイズの補正方法を個別に選択します。 biosensor-image-subtraction.ijm: このスクリプトでは、背景とノイズの両方が、空白の画像、画像内のユーザーが選択した領域、固定値、または補正なしのいずれかの同じユーザーが選択した方法で処理されます。 フィジーで、手順3.5で取得したマルチチャンネルZスタックイメージを開きます。目的のバイオセンサー解析スクリプトファイルを開きます。スクリプト エディタ(Script Editor)ウィンドウで実行(Run)をクリックして、スクリプトを実行します。 表示されるダイアログウィンドウで、必要な情報を入力します。比率計算用の分子と分母の チャンネル番号 を選択します。 mtHyPer7の場合、分子は 488 nmで励起されたチャネル、分母は 405 nmで励起されたチャネルです。透過光画像が存在する場合はチャネル 番号 を選択し、存在しない場合は 0 を選択します。 次の4つのオプションから目的の背景減算方法を選択します。背景が比較的均一な場合は、[ 画像領域の選択] を選択すると、画像の背景レベルを直接測定できます。背景が圃場によって大きく異なる場合は、biosensor-image-subtraction.ijmスクリプトを使用して、ブランク画像を選択します(補正のために ブランク 画像を収集するには、無細胞視野で同一の取得条件でマルチチャンネルZスタックをキャプチャするか、無細胞増殖培地で作成したスライドからキャプチャします)。 固定値では 、以前に測定されたバックグラウンド値を入力できます。 「なし」を選択すると 、バックグラウンドは補正されませんが、測定の精度が低下する可能性があります。 目的のノイズ減算方法を選択します。ノイズ値は、バックグラウンドを差し引いてマスクされたチャンネル画像の下限しきい値として使用され、検出器の読み出しにおけるランダムな変動の影響を低減します。[ 画像領域の選択 ]または [固定値 ]を選択すると、以前に測定されたノイズレベルを入力できますが、イメージング条件が一定に保たれていれば、ノイズレベルが一定であるため、通常はうまく機能します。または、「 なし 」を選択し、値 1 を下限しきい値として使用すると、測定値のばらつきが大きくなる可能性があります。 ミトコンドリアを正確かつ一貫して検出するためのしきい値アルゴリズムを選択します。 Otsu または MaxEntropy を推奨します。理想的には、実験のすべての画像に同じアルゴリズムを使用しますが、ミトコンドリアの正確な認識を確実にします。実験中に形態に変化がある場合は、別の閾値法を使用します。 セルごとの関心領域 (ROI) の数を選択します。たとえば、 母芽の差を測定する場合は、 2を選択します。 測定値と比率の画像を保存する出力フォルダーを選択します。 プロンプトに従って、背景とノイズを補正します。領域の選択(該当する場合):背景またはノイズの測定に 画像領域を選択 を選択した場合は、プロンプトに従って、 長方形ROIツールを使用して背景領域(細胞または蛍光アーチファクトの外側)を描画します。領域を描画したら、[ OK] をクリックします。 固定値入力(該当する場合):バックグラウンドまたはノイズ測定に 固定値 を選択した場合は、プロンプトに従って、各蛍光チャンネルの バックグラウンド 値または ノイズ値 を入力します。 空白の参照画像(該当する場合):biosensor-image-subtraction.ijmスクリプトで、背景またはノイズの補正に空白の画像を選択した場合は、プロンプトに従って 空白 の 画像ファイルを選択します。 測定のためにROIをマークします。中期対数期の培養では、分析を出芽細胞に限定します。明視野イメージに基づいて、個々の細胞または細胞内領域に対応する ROI を描画します。ROI内の閾値ミトコンドリアのみが測定されるため、ROIは細胞の輪郭と正確に一致する必要はありません。または、以前に保存したROIセットを開きます:ROIマネージャーで 詳細をクリックし、ROIファイルを選択します。 各 ROI の作成後に T キーを押して、選択した ROI を ROI マネージャーに追加します。ROIマネージャーで、[ すべて表示] をオンにして、マークされたセルを文書化します。追加された各領域は、ROIマネージャーリストに番号付きの項目として表示されます。1つの細胞(母細胞とつぼみなど)を複数のROIで解析する場合は、解析した細胞ごとに同じ順序でROIをマークします。 必要なすべての ROI が ROI マネージャーに追加されたら、[セルをマーク] ダイアログ ウィンドウで [OK] をクリックします。 測定表の形式を選択します。表示される [MultiMeasure] ダイアログ ウィンドウで、[Measure all slices] をオンにします。[スライスごとに 1 行] オプションをオンにして、目的の形式のテーブルを生成します。process_multiROI_tablesを使用します。[スライスごとに 1 行] オプションで作成されたテーブルを処理する R スクリプト。[結果の追加] はオンにしないでください。この手順を3回繰り返します(分子[488]、分母[405]、および比率[488/405]画像の測定用)。 スクリプトは、手順4.1.2.6で選択したフォルダーに出力ファイルを保存します。 各領域またはセルの加重平均比の計算前のステップで得られた結果を使用して、式(2)を使用して各領域またはセルの加重平均比を計算します。「ピクセル単位」または「領域単位」の比率を計算します(詳細については、説明を参照してください)。(2)注:面積密度と積分密度(IntDen)の値には、閾値ミトコンドリア内のピクセルのみが含まれます。この計算は、process_multiROI_tablesを使用して自動化できます。R スクリプトと R 統計ソフトウェア。 カラー化された比率画像を生成します。色相 (色) の変化は強度の変化よりも人間の目には明白であるため、比率値をカラー スケールに変換して視覚的に解釈しやすくします。colorize_ratio_image.ijmスクリプトは、マスクされた比率の画像を色付けします。フィジーで、手順4.1.6で生成した比率Zスタックイメージを開きます。colorize_ratio_image.ijm スクリプト ファイルを開きます。スクリプト エディタ(Script Editor)ウィンドウで実行(Run)をクリックして、スクリプトを実行します。 表示されるダイアログウィンドウで、必要な情報を入力します。カラー化方法: 「 変調なし 」オプションでは、すべてのミトコンドリアピクセルが同じ明るさで表示されます。ただし、一部の画像では、暗いピクセルと明るいピクセルの両方が比率画像に寄与するため、ノイズが多く見える場合があります。この影響を軽減するには、「 強度変調 」オプションを使用します。 最小値と最大表示値: これらの値は、色付けされる比率値の範囲を制御します。実験で観測された平均の最小値と最大値に近い値を選択します(手順4.2.1で計算した加重平均比に基づく)。実験では、必ず同一の撮影条件ですべての画像を取得し、同じ最小値と最大値を持つすべての画像を表示してください。 投影モード:Zスタックは、ミトコンドリア集団全体を示す投影として表示されます。投影は、色付けの前に作成されます。最大強度投影(最大比と強度値を保持)には最大( Max )を、平均強度投影(平均)には平均( Average )を選択します。 出力フォルダ:カラー化された画像を保存するフォルダを選択します。 [ 変調なし ] オプションを選択した場合は、配色 (ルックアップ テーブル;LUT)が表示されます。Fiji に組み込まれている Fire または Rainbow RGB LUT、または ImageJ の .lut 形式の任意の LUT を使用します (LUT ファイルからインポート)。 Rainbow Smooth40 LUTを推奨します( 補足ファイル2 とGitHubに含まれています)。 スクリプトは、手順4.3.1.4で選択したフォルダーに出力ファイルを保存します。これらには、カラー化比画像(Color_RGB.tif)と、比値と画像色との対応を示すキャリブレーションバー付きカラー化比画像(Color_with_bar.tif)が含まれる。 5. 手動分析 注: このアプローチでは時間がかかりますが、前処理としきい値の設定に柔軟性を持たせることができます。 背景を修正します。フィジーでオプションを設定します。[ 分析] |測定値を設定します。表示されるダイアログ ウィンドウで、[Area]、[ Mean]、[StdDev]、[IntDen]、および [表示ラベル] のチェックボックスをオンにします。小数点以下の桁数を 3 に設定します。 [ 編集] |オプション |入力/出力。表示されるダイアログウィンドウで、[ 行番号 を保存]と [列ヘッダーを保存]のチェックボックスをオンにします。 比計算の感度を上げるには、各蛍光チャンネルからバックグラウンドを差し引きます。背景が比較的均一な場合は、画像内の無細胞領域の平均強度を測定し、画像全体からこの値を減算します(手順5.1.2.1)。または、フィールド全体で背景が大きく異なる場合は、空白の画像を使用して修正します(手順5.1.2.2)。ユーザーが選択した領域を差し引くには、[画像] |カラー |チャンネルを分割し、後で必要になるため、すべてのチャンネル画像を開いたままにしておきます。蛍光チャンネルごとに、背景(セルの外側)にROIを描画し、[分析]をクリックします。計測、またはスタックの場合は、[イメージ |スタック |[スタックを測定]をクリックします。結果表に表示されるROIの平均値を確認します。[編集] |[なし] を選択し、次に [プロセス] |数学 |引き算。表示されるダイアログウィンドウで、測定された平均バックグラウンド値を最も近い整数に丸めて入力します。注: 丸めにより、後の二項演算でのエラーが防止されます。 データファイルから空白の画像を差し引くには、完全に無細胞の視野から、または無細胞増殖培地で調製したスライドから空白の画像を収集します。 [プロセス] |画像計算機。表示されるダイアログ ウィンドウで、操作を [減算] に設定し、Image1 と Image2 をそれぞれセル イメージと空白イメージに設定します。[ Create New Window and 32-bit Result] にチェックを入れます。 分析をミトコンドリアに限定するには、セグメンテーションを実行します。各チャネルはバイオセンサーの状態に応じて強度が変化する可能性があるため、2つのチャネルの合計を使用して、ミトコンドリアの面積を一貫して定義します。合計画像を作成するには、[ プロセス] |画像計算機。表示されるダイアログウィンドウで、操作を 「追加」に設定し、Image1 と Image2 を任意の順序で背景を差し引いた 2 つの蛍光チャンネルに設定します。[ 新しいウィンドウの作成 ] と [32 ビットの結果 ] をオンにして、合計画像が表示されるのを待ちます。 合計画像上のミトコンドリアを定義するしきい値を設定します。画像をクリック |調整 |しきい値。表示される [Threshold ] ウィンドウで、[ Dark Background ] と [Stack Histogram] をオンにします。[ メソッド ] を目的のアルゴリズム ( Otsu や MaxEntropy など) に設定します。再現性を高めるために自動しきい値を使用しますが、適切な自動メソッドがない場合は、しきい値を手動で調整します。注:理想的には、実験のすべての画像に同じアルゴリズムを使用する必要がありますが、実験中の形態の変化により、条件によっては異なるしきい値処理方法が必要になる場合があります。 しきい値が満足のいく場合は、「 適用」をクリックします。表示されるダイアログウィンドウで、「 マスクに変換」を選択します。表示されるダイアログウィンドウで、[ 黒い背景 ]をオンにし、他のチェックボックスはオフのままにします。セグメンテーション精度を評価するために、結果のマスク イメージを保存します。 マスク値を 0 と 255 から 0 と 1 にそれぞれ変換するには、[ プロセス |数学 |除算します。値を 255 に設定し、プロンプトが表示されたら、すべての画像を処理するオプションを選択します。 バックグラウンド減算蛍光チャンネルにマスクを適用するには、[ Process |画像計算機。表示されるダイアログウィンドウで、操作を [乗算]に設定します。Image1 と Image2 をそれぞれ分子チャネルとマスクに設定します。[ 新しいウィンドウの作成 ] と [32 ビットの結果] をオンにします。分母チャネルでマスク乗算を繰り返します。 背景ピクセルを NaN (“not a number”) に設定して、比率計算用にマスクされた各チャネルを準備します。マスクされた分子チャネルを選択し、[ 画像 |調整 |しきい値。 [しきい値 ] ウィンドウで [設定] をクリックし、表示されるダイアログ ウィンドウで、 最小 値を 計算されたノイズ レベル または 1 に設定し、 最大値はそのままにします。 「しきい値」ウィンドウで、「適用」をクリックします。次のダイアログボックスで、[Set to NaN] を選択します。マスクされた分母チャネルに対して繰り返します。 比率イメージを生成します。[プロセス] |画像計算機。表示されるダイアログウィンドウで、操作を分割に設定します。Image1 と Image2 をそれぞれ、背景から減算されたマスクされた分子と分母のチャネルに設定します。mtHyPer7の場合、分子は488 nmで励起された酸化型、分母は405 nmで励起された還元型です。したがって、比率が高いほど、H2O2が高いことを示します。 [ Create New Window and 32-bit Result] にチェックを入れます。解析のために比率画像を保存します。 関心のある領域をマークして定量化します。各細胞または細胞内領域が選択され、ROI マネージャーに ROI として格納されます。ROIは、マスクされたミトコンドリア領域のみが測定されるため、細胞の輪郭と完全に一致する必要はありません。透過光画像を使用してバイアスを防止し、個々の細胞(または細胞内領域)に対応するROIを作成します。中対数期の培養では、細胞分裂に活発に関与している芽を持つ酵母細胞に分析を限定します。各 ROI を作成した後 に T キーを押して、ROI マネージャーに追加します。[ すべて表示 ] をオンにして、マークされたセルを文書化します。 上記で作成した比率の画像をクリックし、ROI Managerで[その他…] |マルチメジャー。表示されるダイアログウィンドウで、[すべてのスライスを測定]をオンにします。[結果の追加] はオンにしないでください。[スライスごとに 1 行] オプションをオンにして、目的の形式のテーブルを生成します。process_multiROI_tables。R スクリプトは、R 統計ソフトウェアの [スライスごとに 1 行] オプションで作成されたテーブルを処理します。 結果を保存します。[ 結果 ] ウィンドウをクリックし、[ ファイル] |結果テーブルを .csv または .xls 形式で保存します。ファイル名をイメージ名と一致するように設定します。 ROI を保存します。ROI マネージャーで、まず ROI が選択されていないことを確認します: [ 選択解除]、[ その他] |保存します。保存したROIを元の画像とともにフィジーで開き、測定値と画像を相互参照します。 前の手順で得られた結果と式 (3) を使用して、セルまたは領域ごとの加重平均比を計算します。「ピクセル単位」または「領域単位」の比率を計算します(詳細については、説明を参照してください)。(3)注:面積と積分密度の値には、閾値ミトコンドリア内のピクセルのみが含まれます。この計算は、process_multiROI_tablesを使用して自動化できます。R 統計ソフトウェアの R スクリプト。 カラー化された比率画像を生成します。注:カラー化された画像は、すべてのミトコンドリアピクセルが同じ明るさで表示される非変調、または元の画像のピクセル強度を使用してカラー化された画像の強度を設定する強度変調にすることができます。変調されていないカラー化された画像を生成するには:上記で生成した比率画像を開きます。画像をクリック |「複製 」をクリックして画像のコピーを生成し、元の画像を閉じます。 画像が Z スタックの場合は、スライスを 1 つ選択するか、Z 投影を生成してすべてのミトコンドリアを表示します。最大強度 (各 XY ピクセル座標の最大比率と強度値を保持) または平均強度投影法を使用します。 画像をクリック |ルックアップテーブルを選択し、LUTを目的の配色(例:Rainbow RGBまたはFire[ImageJでデフォルトで利用可能])に設定します。または、[ファイル] |LUT をインポートし、Rainbow Smooth40 (補足ファイル 2 と GitHub に含まれています) など、ImageJ の .lut 形式で任意の LUT を選択します。LUT の 0 値に暗い色が割り当てられていることを確認します。 表示のコントラストを設定するには、[ 画像] |調整 |明るさ/コントラスト。 「明るさ/コントラスト」ウィンドウで「 設定」をクリックし、表示されるダイアログ・ウィンドウで、「 最小 値」と 「最大 値」の表示値に必要な値を入力します。観察される色差を最大化するには、すべてのイメージで取得された最小値と最大値をほぼ設定します。実験のすべての画像を同じコントラスト レベルに設定します。注: [適用] をクリックすると、ピクセル値が変更され、次の手順で正確なキャリブレーション バーが生成されなくなるため、クリックしないでください。 カラーキャリブレーションバーを追加するには、[ 分析] |ツール |キャリブレーションバー。 表示されるダイアログウィンドウで、[ オーバーレイ ]オプションをオンにして、必要に応じて[ 画像|オーバーレイ |オーバーレイを削除します。 必要に応じて、[ 分析] |ツール |縮尺記号。表示されるダイアログウィンドウで、バーのサイズ、位置、色を設定します。[ オーバーレイ ]オプションをオンにすると、使用するLUTに関係なくバーの色が維持されます。 公開用のRGB画像を生成するには、[ 画像] |オーバーレイ |平坦化します。結果の画像を保存します。注:この画像は、プレゼンテーションまたは公開のみを目的としています。強度値は変化するため、測定できません。また、バーは画像上で永続的に焼き付けられます。 強度変調画像を作成するには:画像をクリック |「複製 」をクリックして画像のコピーを生成し、元の画像を閉じます。 画像が Z スタックの場合は、スライスを 1 つ選択するか、Z 投影を生成してすべてのミトコンドリアを表示します。 比率画像の表示コントラストを設定するには、[ 画像 |調整 |[明るさ/コントラスト] をクリックし、[明るさ/コントラスト] ウィンドウで [設定] をクリックします。表示されるダイアログ ウィンドウで、[ 最小 値] と [ 最大 値] の表示値に必要な値を入力します。観察される色差を最大化するには、これらをすべての画像で得られた最小値と最大値に近似値に設定し、実験のすべての画像を同じコントラスト レベルに設定します。[ 適用 ] をクリックして、ピクセル値を再スケールします。 キャリブレーション バーを作成するには、この拡張画像を複製し、[ 分析] |ツール |キャリブレーションバー。画像とオーバーレイをRGB形式に変換するには、[ 画像|オーバーレイ |平坦化します。必要に応じて、このバーをステップ5.6.2.12で取得した強度変調RGB画像に貼り付けて、プレゼンテーションまたは公開します。 [ ファイル] |新規 |画像….開いたダイアログウィンドウで、パラメータを次のように設定 します。 タイプ:RGB; 塗りつぶし:黒; 幅 と 高さ: 9画像の幅と高さ); スライス:1。 新しいスタックをHSB(色相、彩度、明るさ)画像スタックに変換するには、[ 画像 |種類 |HSB スタック。 コントラストを調整した比率の画像をクリックして、[編集] |[すべて] を選択し、次に [編集] |[コピー] をクリックします。次に、HSB スタックをクリックし、最初のスライス (色相) を選択して、[編集] |貼り付けて比率値を転送します。 HSB スタックのスライス 2 (彩度) を選択します。前景色を白に設定するには、[編集] |オプション |色。[編集] |[すべて] を選択し、次に [編集] |[塗りつぶし] をクリックし、開いたダイアログ ウィンドウで [いいえ] を選択して、現在のスライスのみを白で塗りつぶします。 生データ画像を開き、[ 画像] |カラー |チャンネルを分割します。 Image Calculator を使用して 2 つの比率チャネルの平均を生成し、[プロセス] |画像計算機。表示されるダイアログ ウィンドウで、操作を [平均] に設定し、Image1 と Image2 をそれぞれ分子と分母の画像に設定します。[新しいウィンドウの作成] をオンにします。 上記で作成した平均画像をクリックして、[編集] |[すべて] を選択し、次に [編集] |[コピー] をクリックします。次に、HSB スタックをクリックし、3 番目のスライス (値) を選択して、[編集] |強度値を転送するには貼り付けます。 HSBスタックをRGB色空間に変換するには、[ 画像] |種類 |RGBカラー。結果の画像を保存します。 図6:画像解析とプレゼンテーションの概略図。回転する円盤の共焦点画像は、最初に背景が減算されます。ミトコンドリアは閾値によってセグメント化され、スライスごとにマスクに変換されます。これらのマスクは両方のチャンネルに適用され、マスクされた画像は比率画像の計算に使用されます。ROIは、細胞または細胞内領域におけるmtHyPer7比を測定するために描画されます。また、データ表示のためにカラー化された比率画像を生成することもできます。スケールバー = 1 μm。略語:ROI = 関心領域。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。