Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.
Gereconstitueerde cytoskeletcomposieten zijn naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem voor het bestuderen van niet-evenwichtszachte materie. Het getrouw vastleggen van de dynamiek van deze 3D, dichte netwerken vereist optische doorsnede, wat vaak wordt geassocieerd met fluorescentie-confocale microscopen. Recente ontwikkelingen op het gebied van light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) hebben het echter bewezen als een kosteneffectief en soms superieur alternatief. Om LSFM toegankelijk te maken voor cytoskeletonderzoekers die minder bekend zijn met optica, presenteren we een stapsgewijze beginnershandleiding voor het bouwen van een veelzijdige light-sheet fluorescentiemicroscoop uit kant-en-klare componenten. Om monstermontage met traditionele objectglaasjes mogelijk te maken, volgt deze LSFM het single-objective light-sheet (SOLS)-ontwerp, dat gebruik maakt van een enkel objectief voor zowel de excitatie- als de emissieverzameling. We beschrijven de functie van elk onderdeel van de SOLS voldoende gedetailleerd om lezers in staat te stellen de instrumentatie aan te passen en te ontwerpen om aan hun specifieke behoeften te voldoen. Ten slotte demonstreren we het gebruik van dit op maat gemaakte SOLS-instrument door asters te visualiseren in kinesine-gedreven microtubuli-netwerken.
Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) vertegenwoordigt een familie van fluorescentiebeeldvormingstechnieken met hoge resolutie waarbij het excitatielicht wordt gevormd tot een vel 1,2, waaronder selectieve vlakverlichtingsmicroscopie (SPIM), geveegde confocaal uitgelijnde planaire excitatie (SCAPE) en schuine vlakmicroscopie (OPM)3,4,5,6,7 . In tegenstelling tot andere microscopiemodaliteiten zoals epifluorescentie, totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) of confocale microscopie, is fototoxiciteit minimaal bij LSFM en kunnen monsters over langere tijdschalen worden afgebeeld omdat alleen het vlak van het monster dat actief wordt afgebeeld wordt verlicht 8,9,10. Daarom zijn LSFM-technieken uiterst nuttig voor het afbeelden van 3D-monsters over langere perioden, met name zelfs die welke te dik zijn voor confocale microscopietechnieken. Om deze redenen is LSFM sinds de oorspronkelijke ontwikkeling in 2004 de beeldvormingstechniek bij uitstek geworden voor veel fysiologen, ontwikkelingsbiologen en neurowetenschappers voor de visualisatie van hele organismen zoals levende zebravissen en Drosophila-embryo’s 3,4,6,11 . In de afgelopen twee decennia zijn de voordelen van LSFM benut om structuur en dynamiek op steeds kleinere schalen te visualiseren, waaronder de weefselschaal11,12, cellulaire en subcellulaire schaal, zowel in vivo als in vitro 13,14,15,17.
Ondanks de meldingen van succesvolle use-cases in de literatuur, verhinderen de hoge kosten van commerciële LSFM-systemen (~0,25 miljoen USD op het moment van schrijven)18,19 het wijdverbreide gebruik van de techniek. Om doe-het-zelf-builds een haalbaar alternatief te maken voor onderzoekers, zijn er meerdere build-handleidingen gepubliceerd 8,13,20,21, waaronder de open-access-inspanning OpenSPIM 22. Tot op heden kunnen onderzoekers met minimale optische ervaring echter alleen eerdere LSFM-ontwerpen gebruiken, die niet compatibel zijn met traditionele op objectglaasjes gemonteerde monsters (Figuur 1A). Recente single-objective, light-sheet (SOLS) implementatie gebruikt een enkele doelstelling voor zowel de excitatie als de detectie (Figuur 1C), waardoor de beperking met betrekking tot compatibiliteit 5,6,8,13,20 wordt overwonnen. De kosten voor de veelzijdigheid van het SOLS-ontwerp zijn echter een aanzienlijke toename van de complexiteit van de constructie als gevolg van de vereiste van twee extra doelstellingen om het objectvlak op de camera door te geven, te de-kantelen en opnieuw af te beelden voor beeldvorming (Figuur 1D). Om de toegang tot de complexe opstellingen in SOLS-stijl te vergemakkelijken, presenteert dit artikel een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp, de bouw, het uitlijningsproces en het gebruik van een dia-compatibel SOLS-systeem, wat nuttig zou zijn voor onderzoekers met kennis van alleen een opticacursus op instapniveau.
Hoewel het protocol zelf beknopt is, moeten lezers tijdens de voorbereidingsstappen andere bronnen raadplegen om meer te weten te komen over bepaalde delen van het ontwerp of hardware-overwegingen. Als een lezer echter van plan is de specificaties van dit ontwerp te volgen, is het misschien niet nodig om te begrijpen hoe bepaalde optische componenten moeten worden geselecteerd.
Figuur 1: Kenmerken van verschillende LSFM-configuraties. (A) De opstelling met twee orthogonale objectieven die gebruikelijk zijn in vroege LSFM-ontwerpen. In deze configuratie wordt een capillair buisje of een cilinder met gel gebruikt om het monster te bevatten, wat niet compatibel is met traditionele technieken voor het monteren van objectglaasjes. (B) een schema van een SOLS-lichtplaatontwerp waarop het volgende is aangegeven: (C) het enige objectief dat wordt gebruikt voor zowel de excitatie als de emissieverzameling op het monstervlak (O1); hierdoor kan een traditionele slede bovenop worden gemonteerd, en (D) het relaisobjectiefsysteem in het SOLS-emissiepad. O2 vangt het emissielicht op en demagnifiert het beeld. O3 beeldt het vlak in de juiste kantelhoek af op de camerasensor. Afkortingen: LSFM = light-sheet fluorescentiemicroscopie; SOLS = lichtscherm met één objectief; O1-O3 = doelstellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Twee belangrijke details met betrekking tot dit protocol zijn de totale kosten van het systeem en de verwachte bouw- en uitlijntijd. Hoewel de exacte kosten variabel zijn, kunnen we gemakkelijk schatten dat de totale kosten van deze SOLS of een vergelijkbaar doe-het-zelfsysteem in het bereik van $ 85.000 USD zouden vallen. We merken op dat deze schatting rekening houdt met de verkoopprijs van alle componenten, dus deze totale prijs kan aanzienlijk worden verlaagd door gebruikte componenten in te kopen. Wat de bouwtijd betreft, zou het redelijk zijn om te verwachten dat een gebruiker met weinig optische ervaring dit hele SOLS-systeem binnen 1-2 maanden bouwt en uitlijnt, op voorwaarde dat alle componenten beschikbaar en klaar zijn. Ondanks de lengte en complexiteit van het protocol, zijn we van mening dat de hoeveelheid details in het geschreven manuscript, in combinatie met het videoprotocol, dit protocol eenvoudig en snel te volgen zou moeten maken.
Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. Ten eerste bepaalt de plaatsing van de galvo de plaatsing van veel lenzen, aangezien deze deel uitmaakt van drie afzonderlijke 4f-lensparen. Het is van cruciaal belang dat de galvo zowel geconjugeerd is met de achterste brandpuntsvlakken van O1 en O2 als correct is gecentreerd om kantel-invariant scannen te garanderen. Ten tweede is de beeldkwaliteit extreem gevoelig voor de uitlijning van O2 en O3 ten opzichte van elkaar. Hier moet ervoor worden gezorgd dat ten eerste de uitlijningshoek van O3 tot O2 overeenkomt met de kanteling van de excitatielichtplaat, waardoor een maximaal vlakke verlichting over het eveneens gekantelde gezichtsveld wordt geboden. Ten tweede moet O3 op de juiste axiale afstand worden geplaatst om een vlakke FoV met een zo groot mogelijk oppervlak te behouden. Ten derde moet O3 op de juiste laterale afstand van O2 worden geplaatst om het signaal dat door de O2-O3-interface gaat te maximaliseren.
In termen van de bruikbare FoV bereikte dit systeem een vlak, betrouwbaar veld met een consistente verlichting over een gebied van 80 μm x 80 μm. Dit gebied is kleiner dan de maximale gezichtsveldstraling die door de camera wordt geleverd, dus de bruikbare gezichtsveldaanval wordt aangegeven door het gele vak in afbeelding 13. In termen van het oplossend vermogen bereikte dit systeem een minimale oplosbare afstand van 432 nm langs de x-as en 421 nm langs de y-as, die werd gemeten door de gemiddelde sigma x en y van Gaussiaanse fits to point spread-functies (PSF’s) in de goede FoV te vinden en met twee te vermenigvuldigen. We merken op dat dit systeem niet is geoptimaliseerd in termen van de totale NA, wat betekent dat er ruimte is voor aanzienlijke verbetering als gebruikers een oplossend vermogen wensen dat hoger is dan wat dit systeem bereikte. Er zijn een groot aantal compatibele objectiefopties voor dit type SOLS-build, waarvan er vele zouden bijdragen aan een hogere systeemresolutie, maar met de nadelen van hogere kosten, een kleinere FoV of meer gecompliceerde uitlijningstechnieken op de relaisinterface 8,11,13,20. Afzonderlijk, als gebruikers een grotere FoV wensen, zou het opnemen van een tweede galvo om 2D-scannen mogelijk te maken dit doel bereiken, maar zou extra optica en besturingsmechanica in het ontwerp moeten worden geïntegreerd32. We hebben meer details gegeven over wijzigingen aan het systeem op onze websitepagina, naast links naar andere nuttige bronnen met betrekking tot het ontwerpproces23.
Naast het verbeteren van de specifieke componenten voor dit specifieke ontwerp, zou het zeer goed mogelijk zijn om andere microscopietechnieken of -modaliteiten met hoge resolutie aan deze build toe te voegen. Een van die verbeteringen zou zijn om verlichting met meerdere golflengten op te nemen, wat zou inhouden dat extra excitatielasers worden uitgelijnd met het oorspronkelijke excitatiepad8. Bovendien, omdat dit type SOLS-ontwerp het monster toegankelijk laat, is het toevoegen van extra functies aan de microscoop, inclusief maar beperkt tot optisch pincet, microfluïdica en reometrie, relatief eenvoudig 2,33.
Vergeleken met de talloze light-sheet-handleidingen die zijn gepubliceerd, biedt dit protocol instructies op een begripsniveau dat een gebruiker zonder noemenswaardige optische ervaring nuttig kan vinden. Door een gebruiksvriendelijke SOLS-build met traditionele mogelijkheden voor het monteren van monsterglaasjes toegankelijk te maken voor een groter publiek, hopen we een nog verdere uitbreiding van de toepassingen van SOLS-gebaseerd onderzoek mogelijk te maken op alle gebieden waarin het instrument is of zou kunnen worden gebruikt. Zelfs nu de toepassingen van SOLS-instrumenten snel groeien in aantal 2,34,35, zijn wij van mening dat veel voordelen en toepassingen van SOLS-type instrumenten nog steeds onontgonnen zijn en uiten we ons verheugd over de mogelijkheden voor dit type instrument in de toekomst.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) aan J.S. We zijn dankbaar voor de begeleiding van Dr. Bin Yang en Dr. Manish Kumar tijdens het afstemmingsproces. Wij danken Dr. Jenny Ross en K. Alice Lindsay voor de bereidingsinstructies voor de kinesinemotoren.
1" Plano-Concave Lens f = -50 mm | Thorlabs | LC1715-A-ML | For alignment laser Estimated Cost: $49.5 |
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3) | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42 |
1" Achromatic Doublet f = 125 mm | Thorlabs | AC254-125-A-ML | SL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | L3 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | TL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 45 mm | Thorlabs | AC254-045-A-ML | L1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 75 mm | Thorlabs | AC254-075-A-ML | SL1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Cylindrical Lens f = 100 mm | Thorlabs | LJ1567RM | CL3 Estimated Cost: $117.62 |
1" Cylindrical Lens f = 200 mm | Thorlabs | LJ1653RM | CL2 Estimated Cost: $111.22 |
1" Cylindrical Lens f = 50 mm | Thorlabs | LJ1695RM | CL1 Estimated Cost: $117.62 |
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter | Thorlabs | P30K | Estimated Cost: $77.08 |
1" Silver Mirror (x3) | Thorlabs | PF10-03-P01 | M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78 |
2" Elliptical Mirror | Thorlabs | PFE20-P01 | M3 Estimated Cost: $179.98 |
2" Post Holder (x11) | Thorlabs | PH2 | For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45 |
2" Posts (x47) | Thorlabs | TR2 | For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3 |
3" Posts (x4) | Thorlabs | TR3 | For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6 |
3" Post Holder (x4) | Thorlabs | PH3 | Estimated Cost: $38.48 |
30 to 60 mm Cage Adapter | Thorlabs | LCP33 | To mount O1 Estimated Cost: $45.42 |
30mm Cage Filter Wheel | Thorlabs | CFW6 | To mount ND filters Estimated Cost: $172.36 |
30mm Cage Plate (x6) | Thorlabs | CP33 | To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54 |
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3) | Thorlabs | KCB1 | To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95 |
4" Post Holder (x30) | Thorlabs | PH4 | Estimated Cost: $320.1 |
561 nm Laser and Power Supply | Opto Engine LLC | MGL-FN-561-100mW | Excitation laser Estimated Cost: $6000 |
60mm Cage Plate (x2) | Thorlabs | LCP01 | To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52 |
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB2 | To mount M3 Estimated Cost: $187.26 |
90° Flip Mount | Thorlabs | TRF90 | For alignment laser Estimated Cost: $95.5 |
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A9 | To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads | Thorlabs | SM1A10 | To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2) | Thorlabs | SM1A12 | To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads | Thorlabs | SM1A27 | To mount O3 Estimated Cost: $22.38 |
Alignment Disk | Thorlabs | SM1A7 | Estimated Cost: $20.45 |
Alignment Laser | BISKEE | https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98 |
|
Autoluorescent Plastic Slide, Red | Chroma | 92001 | Estimated Cost: $20 |
Beam Shutter | Thorlabs | SM1SH1 | To block laser light Estimated Cost: $65.8 |
Cage Rotation Mount (x3) | Thorlabs | CRM1T | To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15 |
Cage System Rods 1" (x8) | Thorlabs | ER1 | To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8 |
Cage System Rods 3" (x2) | Thorlabs | ER3 | To mount O3 Estimated Cost: $14.28 |
Cage System Rods 4" (x4) | Thorlabs | ER4 | To mount slit Estimated Cost: $30.76 |
Cage System Rods 8" (x2) | Thorlabs | ER8 | For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3 |
Cage System Rods 12" (x8) | Thorlabs | ER12 | For alignment cage Estimated Cost: $145.36 |
Camera | Andor | Zyla 4.2 sCMOS | Estimated Cost: ~$14,000 |
Clamping Fork (x35) | Thorlabs | CF125 | To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8 |
Cover Glass, 22 x 22 mm | Corning | 2850-22 | For slide samples Estimated Cost: $265 |
Dichroic | AVR | DI01-R405/488/561/635-25×36 | To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965 |
Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12 | To translate pinhole Estimated Cost: $90.55 |
Emission Filter | Thorlabs | FELHO600 | Estimated Cost: $140.99 |
Frosted Glass Alignment Disk (x2) | Thorlabs | DG10-1500-H1 | For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14 |
Function Generator | Hewlett-Packard | HP 33120A 15 MHz | To control galvo Estimated Cost: $900 |
Galvanometer – 1D Large Beam Diameter System | Thorlabs | GVS011 | Estimated Cost: $1715.78 |
Galvanometer Power Supply | Siglent | SPD3303C | Estimated Cost: $300 |
Gelrite | Research Products International | G35020-100.0 | Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25 |
FIJI Software | Open-source | Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free |
|
Hot Plate/ Stirrer | Corning | 6795-220 | For preparing sample solutions Estimated Cost: $550 |
K-Cube Brushed Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Drives Z825B Estimated Cost: $757.51 |
Kinematic Mount | Thorlabs | KM100S | To mount dichroic Estimated Cost: $92.01 |
Kinesis Software | Thorlabs | Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free |
|
Laser Light Blocker | Thorlabs | LB1 | For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65 |
Laser Mount | custom made | 3D printed Estimated Cost: N/A |
|
Laser Safety Screen (x2) | Thorlabs | TPS4 | For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02 |
Laser Scanning Tube Lens | Thorlabs | TTL200MP | TL1 Estimated Cost: $1491 |
Lens Mount (x10) | Thorlabs | LMR1 | To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7 |
Magnetic Ruler | Thorlabs | BHM4 | To check alignment Estimated Cost: $52.74 |
Micro-Manager Software | Open-source | Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free |
|
Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12550400 | For slide samples Estimated Cost: $123.9 |
Microscope Stage | ASI | FTP-2000 with custom parts | To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000 |
Mini Vortex Mixer | VWR | 10153-688 | For sample preparation Estimated Cost: $152.64 |
Motorized Actuator | Thorlabs | Z825B | To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07 |
Mounted Standard Iris (x2) | Thorlabs | ID20 | At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02 |
ND Filter Set | Thorlabs | NDK01 | To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73 |
Objective Lens 1 | Nikon | Plan Apo 60X/ 1.20 WI | O1 Estimated Cost: ~$15,000 |
Objective Lens 2 | Nikon | TU Plan Fluor 100X/0.90 | O2 Estimated Cost: ~$6,000 |
Objective Lens 3 | Mitutoyo | Plan Apo HR 50X/0.75 | O3 Estimated Cost: ~$6,800 |
OPM Deskewing Software | Open-source | For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free |
|
Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S121C | For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68 |
Positive Grid Distortion Target | Thorlabs | R1L3S3P | Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87 |
Power Meter Digital Console | Thorlabs | PM100D | For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48 |
Rhodamine 6G | Thermo Scientific | J62315.14 | For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7 |
Right-Angle Clamp for Posts | Thorlabs | RA90 | For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46 |
RMS-Threaded Cage Plate (x2) | Thorlabs | CP42 | For alignment laser Estimated Cost: $70.56 |
Shear Plate 2.5-5.0 mm | Thorlabs | SI050P | Estimated Cost: $182.85 |
Shear Plate 5.0-10.0 mm | Thorlabs | SI100P | Estimated Cost: $201.47 |
Shear Plate 10.0-25.4 mm | Thorlabs | SI254P | Estimated Cost: $236.42 |
Shear Plate Viewing Screen | Thorlabs | SIVS | Estimated Cost: $337.74 |
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate | Thorlabs | SI035 | For checking collimation Estimated Cost: $465.85 |
Slip-On Post Collar (x35) | Thorlabs | R2 | To maintain post height Estimated Cost: $208.25 |
Slit | Thorlabs | VA100 | Estimated Cost: $294.64 |
Slotted Lens Tube, 3" | Thorlabs | SM1L30C | For alignment laser Estimated Cost: $77.45 |
Square Mirror, 1 x 1" | https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76 |
||
Stackable Lens Tube 1/2" (x3) | Thorlabs | SM1L05 | To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86 |
Stackable Lens Tube 1" | Thorlabs | SM1L10 | To mount O3 Estimated Cost: $15.41 |
Stackable Lens Tube 2" (x2) | Thorlabs | SM1L20 | For camera path Estimated Cost: $35.7 |
Studded Pedestal Base Adapter (x37) | Thorlabs | BE1 | To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71 |
Translating Lens Mount (x3) | Thorlabs | LM1XY | To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441 |
Translation Stage with Standard Micrometer (x2) | Thorlabs | PT1/M | TS1-2 Estimated Cost: $647.54 |
Travel Manual Translation Stage | Thorlabs | CT1A | O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3 |
Tube Lens | Nikon | MXA20696 | TL3 Estimated Cost: $359 |
White Mounted LED | Thorlabs | MNWHL4 | Brightfield light source Estimated Cost: $171.28 |
TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98 | |||
The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones. | |||
OPTIONAL COMPONENTS | |||
Grasshopper3 USB3 | FLIR | GS3-U3-23S6C-C | For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089 |