Meting van O2-verbruik de Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie
Summary
Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster. Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.
Abstract
Coulometrische microrespirometrie is een eenvoudige, goedkope methode om hetO2-verbruik van kleine organismen te meten met behoud van een stabiele omgeving. Een coulometrische microrespirometer bestaat uit een luchtdichte kamer waarin O 2 wordt verbruikt en de door het organisme geproduceerde CO2 wordt verwijderd door een absorberend medium. De resulterende drukverlaging activeert de elektrolytische O2-productie en de hoeveelheid geproduceerdeO2 wordt gemeten door de hoeveelheid lading te registreren die wordt gebruikt om deze te genereren. In de huidige studie is de methode aangepast aan Drosophila melanogaster getest in kleine groepen, waarbij de gevoeligheid van het apparaat en de omgevingsomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor hoge stabiliteit. De hoeveelheid O2 die door wildtype vliegen in dit apparaat wordt geconsumeerd, komt overeen met die gemeten door eerdere studies. De massaspecifiekeO2-consumptie door vatmutanten, die kleiner zijn en waarvan bekend is dat ze minder actief zijn, verschilde niet van die van congene controles. De kleine omvang van de vatmutanten resulteerde echter in een aanzienlijke vermindering van hetO2-verbruik per vlieg. Daarom is de microrespirometer in staat om hetO2-verbruik de D. melanogaster te meten, bescheiden verschillen tussen genotypen te onderscheiden en een veelzijdig hulpmiddel toe te voegen voor het meten van stofwisselingssnelheden.
Introduction
Het vermogen om de stofwisseling te meten is cruciaal voor een volledig begrip van een organisme in zijn omgevingscontext. Het is bijvoorbeeld noodzakelijk om de stofwisseling te meten om de rol ervan in levensduur1, de rol van voeding in het metabolisme2 of de drempel voor hypoxische stress3 te begrijpen.
Er zijn twee algemene benaderingen voor het meten van de stofwisseling4. Directe calorimetrie meet het energieverbruik rechtstreeks door de warmteproductie te meten. Indirecte calorimetrie meet de energieproductie op andere manieren, vaak via respirometrische meting van het O2-verbruik (VO2), de CO2 -productie of beide. Hoewel directe calorimetrie is toegepast op kleine ectothermen, waaronder Drosophila melanogaster5, is respirometrie technisch eenvoudiger en wordt het vaker gebruikt.
Verschillende vormen van respirometrie zijn met succes gebruikt om de stofwisseling te meten bij wildtype en mutant D. melanogaster en hebben inzicht gegeven in de metabole effecten van temperatuur6, sociale omgeving 3, voeding 3,7 en neurologische ontwikkelingsstoornissen8. Deze vallen uiteen in twee klassen, die aanzienlijk variëren in kosten en complexiteit. Manometrie is de eenvoudigste en goedkoopste9,10, waarbij vliegen in een afgesloten kamer worden geplaatst die een CO2 -absorberend middel bevat en die via een dun capillair is verbonden met een vloeistofreservoir. Naarmate O 2 wordt verbruikt en CO2 wordt geabsorbeerd, neemt de druk in de kamer af en wordt vloeistof in het capillair gezogen. Het met vloeistof gevulde volume van het capillair is daarom evenredig met VO2. Meer uitgebreide versies, die de kracht compenseren die door de vloeistof in het capillair wordt uitgeoefend, zijn ook gebruikt op D. melanogaster1. Manometrie heeft het voordeel dat het eenvoudig en goedkoop is, maar omdat het gevoelig is voor druk, vereist het constante omgevingsomstandigheden. Verder, omdat verbruikt O 2 niet wordt vervangen, neemt de partiële druk van O2 (PO2) geleidelijk af in de kamers.
Respirometrie met behulp van gasanalyse wordt ook regelmatig gebruikt voor D. melanogaster. In dit geval worden met regelmatige tussenpozen gassen bemonsterd uit afgesloten kamers met vliegen en naar een infraroodanalysator 2,6,11 gestuurd. Dit type apparaat heeft als voordeel dat het in de handel verkrijgbaar is, minder gevoelig is voor omgevingsomstandigheden en dat gassen tijdens de bemonstering worden ververst, zodat PO2 stabiel blijft. De apparatuur kan echter duur en complex zijn om te bedienen.
Een recent ontwikkelde coulometrische microrespirometer12 biedt een goedkoop, gevoelig en stabiel alternatief voor bestaande systemen. In de praktijk wordt een organisme in een luchtdichte kamer geplaatst waar het O 2 verbruikt en de uitgeademde CO2 wordt verwijderd door een absorberend materiaal, wat resulteert in een netto afname van de kamerdruk. Wanneer de interne druk daalt tot een vooraf ingestelde drempel (AAN-drempel), wordt stroom door een elektrolytische O2-generator geleid, waardoor de druk wordt teruggevoerd naar een tweede drempel (UIT-drempel), waardoor de elektrolyse wordt gestopt. De ladingsoverdracht over de O 2-generator is recht evenredig met de hoeveelheid O 2 die nodig is om de kamer opnieuw onder druk te brengen en kan daarom worden gebruikt om de O2 te meten die door het organisme wordt verbruikt4. De methode is zeer gevoelig, meet V O2 nauwkeurig en de regelmatige vervanging van O2 kan PO2 uren of dagen op een bijna constant niveau houden.
De coulometrische microrespirometer die in dit onderzoek wordt gebruikt, maakt gebruik van een multimodale (druk, temperatuur en vochtigheid) elektronische sensor. De sensor wordt bediend door een microcontroller die kleine drukveranderingen detecteert en O2-generatie activeert wanneer een lagedrukdrempel12 wordt bereikt. Dit apparaat is samengesteld uit kant-en-klare onderdelen, kan worden gebruikt met een breed scala aan kamers en experimentele omgevingen, en is met succes gebruikt om de effecten van lichaamsgewicht en temperatuur op de kever Tenebrio molitor te onderzoeken. In de huidige studie is de microrespirometer aangepast om hetO2-verbruik te meten in D. melanogaster, dat ongeveer 1% van de massa van T. molitor heeft. De gevoeligheid van het apparaat is verhoogd door de drempel voor het activeren van O2-opwekking te verlagen, en de stabiliteit van het milieu is verbeterd door experimenten uit te voeren in een temperatuurgecontroleerd waterbad en door de luchtvochtigheid in de kamers op of in de buurt van 100% te houden.
Het CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) eiwit, onderdeel van de familie van membraan-geassocieerde guanylaatkinasen (MAGUK), is een moleculair steiger in verschillende multi-eiwitcomplexen, en mutaties in CASK zijn geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen bij mensen en bij D. melanogaster13,14. Een levensvatbare D. melanogaster-mutant, CASKΔ18, verstoort de activiteit van dopaminerge neuronen 15 en vermindert de activiteitsniveaus met meer dan 50% in vergelijking met congene controles14,16. Vanwege de verminderde activiteitsniveaus van CASK mutanten en de rol van catecholamines bij het reguleren van het metabolisme17 veronderstelden we dat hun standaard stofwisseling, en dus O2 consumptie, drastisch zou worden verminderd in vergelijking met controles.
O2 consumptie werd gemeten in CASKΔ18 en hun wildtype congeneren, w(ex33). Groepen vliegen werden in respirometriekamers geplaatst, het O 2-verbruik werd gemeten, het O2-verbruik werd berekend en uitgedrukt op zowel massaspecifieke basis als per vlieg. Het apparaat registreerde VO2 in wildtype vliegen, wat consistent was met eerdere studies, en het kon onderscheid maken tussen de O2-consumptie per vlieg van wildtype en CASK mutante vliegen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bovenstaande procedure demonstreert de meting van hetO2-verbruik de D. Melanogaster met behulp van een elektronische coulometrische microrespirometer. De resulterende gegevens voor de consumptie van O2 in wildtype D. melanogaster lagen binnen de marges die in de meeste eerdere publicaties met verschillende methoden zijn beschreven (tabel 1), hoewel iets lager dan die welke door anderen werden gerapporteerd 3,6.<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Dr. Linda Restifo van de Universiteit van Arizona voor het voorstellen om de O2-consumptie van CASK mutanten te testen en voor het sturen van CASK mutanten en hun congene controles. De publicatiekosten werden verstrekt door het Departmental Reinvestment Fund van de afdeling Biologie van het University of College Park. Ruimte en wat apparatuur werden geleverd door de universiteiten in Shady Grove.
Materials
| 19/22 Thermometer Adapter | Wilmad-Labglass | ML-280-702 | Sensor Plug |
| 2 ml Screwcap Tubes | Fisher | 3464 | O2 generator |
| 2-Pin Connector | Zyamy | 40PIN-RFB10 | O2 generator: cut to 2-pin |
| 4-Pin Female Connector | TE Connectivity | 215299-4 | Sensor Plug |
| 5 ml Polypropylene Tube | Falcon | 352063 | Cut to 5.5 cm and perforated |
| 50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint | Laboy | HMF050804 | Chamber |
| 6-Conductor Cable | Zenith | 6-Conductor 26 ga | Cable |
| 6-Pin Female Bulkhead Connector | Switchcraft | 17982-6SG-300 | Controller |
| 6-Pin Female Connector | Switchcraft | 18982-6SG-522 | Sensor plug |
| 6-Pin Male Connector | Switchcraft | 16982-6PG-522 | Cable |
| 800 ul centrifuge tube | Fisher | 05-408-120 | Soda Lime Cartridge |
| ABS Plastic Enclosure | Bud Industries | PS-11533-G | Controller |
| Arduino Nano Every | Arduino LLC | ABX00028 | Controller |
| BME 280 Sensor | DIYMall | FZ1639-BME280 | Sensor Plug |
| Circuit Board | Lheng | 5 X 7 cm | Controller |
| Copper Sulfate | BioPharm | BC2045 | O2 Generator |
| Computer | Azulle | Byte4 | Data Acquisition |
| Cotton Rolls | Kajukajudo | #2 | Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity |
| Environmental Chamber | Percival | I30 VLC8 | Fly Care |
| Epoxy | JB Weld | Plastic Bonder | Secure Electrodes in O2 Generator |
| Fly Food | Lab Express | Type R | Fly Care |
| Keck Clamps | uxcell | a20092300ux0418 | Secures glass joint of chamber to plug |
| Low-Viscosity Epoxy | Loctite | E-30CL | Sensor Plug |
| OLED Display | IZOKEE | IZKE31-IIC-WH-3 | Controller |
| Platinum Wire 24 ga | uGems | 14349 | O2 generator |
| Silicone grease | Dow-Corning | High Vacuum Grease | Seals chamber-plug connection |
| Soda Lime | Jorvet | JO553 | CO2 absorption |
| Toggle Switch | E-Switch | 100SP1T1B1M1QEH | Controller |
| USB Cable | Sabrent | CB-UM63 | Controller |
| USB Hub | Atolla | Hub 3.0 | Connect controllers to computer |
| Water bath | Amersham | 56-1165-33 | Temperature Control |
| Water Bath Tank | Glass Cages | 15-liter rimless acrylic | Bath for Respirometers |
References
- Arking, R., Buck, S., Wells, R. A., Pretzlaff, R. Metabolic rates in genetically based long lived strains of Drosophila. Experimental Gerontology. 23 (1), 59-76 (1988).
- Henry, Y., Overgaard, J., Colinet, H. Dietary nutrient balance shapes phenotypic traits of Drosophila melanogaster in interaction with gut microbiota. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 241, 110626 (2020).
- Burggren, W., Souder, B. M., Ho, D. H. Metabolic rate and hypoxia tolerance are affected by group interactions and sex in the fruit fly (Drosophila melanogaster): new data and a literature survey. Biology Open. 6, 471-480 (2017).
- Lighton, J. R. B. . Measuring Metabolic Rates. , (2019).
- Fiorino, A., et al. Parallelized, real-time, metabolic-rate measurements from individual Drosophila. Scientific Reports. 8 (1), 14452 (2018).
- Berrigan, D., Partridge, L. Influence of temperature and activity on the rate of adult Drosophila melanogaster. Comparative Biochemistry and Physiology. 118 (4), 1301-1307 (1997).
- Hulbert, A. J., et al. Metabolic rate is not reduced by dietary-restriction or by lowered insulin/IGF-1 signalling and is not correlated with individual lifespan in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 39 (8), 1137-1143 (2004).
- Botero, V., et al. Neurofibromin regulates metabolic rate via neuronal mechanisms in Drosophila. Nature Communications. 12 (1), 4285 (2021).
- Yatsenko, A. S., Marrone, A. K., Kucherenko, M. M., Shcherbata, H. R. Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry. Journal of Visualized Experiments. (88), 51681 (2014).
- Ross, R. E. Age-specific decrease in aerobic efficiency associated with increase in oxygen free radical production in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 46 (11), 1477-1480 (2000).
- Brown, E. B., Klok, J., Keene, A. C. Measuring metabolic rate in single flies during sleep and waking states via indirect calorimetry. Journal of Neuroscience Methods. 376, 109606 (2022).
- Sandstrom, D. J., Offord, B. W. Measurement of oxygen consumption in Tenebrio molitor using a sensitive, inexpensive, sensor-based coulometric microrespirometer. Journal of Experimental Biology. 225 (9), jeb243966 (2022).
- Becker, M., et al. Presynaptic dysfunction in CASK-related neurodevelopmental disorders. Translational Psychiatry. 10 (1), 312 (2020).
- Slawson, J. B., et al. Central Regulation of Locomotor Behavior of Drosophila melanogaster Depends on a CASK Isoform Containing CaMK-Like and L27 Domains. Génétique. 187 (1), 171-184 (2011).
- Slawson, J. B., et al. Regulation of dopamine release by CASK-Î2 modulates locomotor initiation in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. Journal of Neurogenetics. 35 (1), 1-22 (2021).
- Ueno, T., Tomita, J., Kume, S., Kume, K. Dopamine Modulates Metabolic Rate and Temperature Sensitivity in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 7 (2), e31513 (2012).
- Van Voorhies, W. A., Khazaeli, A. A., Curtsinger, J. W. Lack of correlation between body mass and metabolic rate in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 50 (5), 445-453 (2004).
- Norton, F. J. Permeation of gases through solids. Journal of Applied Physics. 28 (1), 34-39 (1957).
- Hoegh-Guldberg, O., Manahan, D. T. Coulometric measurement of oxygen-consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae. Journal of Experimental Biology. 198 (1), 19-30 (1995).
- Sohal, R. S., Agarwal, A., Agarwal, S., Orr, W. C. Simultaneous overexpression of copper- and zinc-containing superoxide dismutase and catalase retards age-related oxidative damage and increases metabolic potential in Drosophila melanogaster. Journal of Biological Chemistry. 270 (26), 15671-15674 (1995).
- Van Voorhies, W. A., Melvin, R. G., Ballard, J. W. O., Williams, J. B. Validation of manometric microrespirometers for measuring oxygen consumption in small arthropods. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1132-1137 (2008).
- Herreid, C. F., Full, R. J. Cockroaches on a treadmill: Aerobic running. Journal of Insect Physiology. 30 (5), 395-403 (1984).
