In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine
Summary
Le bis-3-cloropepidine (B-CePs) sono sonde chimiche utili per identificare e caratterizzare le strutture G-quadruplex in modelli di DNA in vitro. Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP e per risolvere i prodotti di reazione mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide ad alta risoluzione.
Abstract
I G-quadruplex (G4) sono strutture di DNA biologicamente rilevanti e non canoniche che svolgono un ruolo importante nell’espressione genica e nelle malattie, rappresentando bersagli terapeutici significativi. Sono necessari metodi accessibili per la caratterizzazione in vitro del DNA all’interno di potenziali sequenze formanti G-quadruplex (PQS). I B-CeP sono una classe di agenti alchilanti che si sono dimostrati utili sonde chimiche per lo studio della struttura di ordine superiore degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un nuovo saggio di mappatura chimica che sfrutta la reattività specifica dei B-CeP con l’N7 delle guanine, seguita da una scissione diretta del filamento ai G alchilati.
Vale a dire, per distinguere le pieghe G4 dalle forme di DNA non ripiegate, usiamo B-CeP 1 per sondare l’aptamero legante la trombina (TBA), un DNA a 15 mer in grado di assumere la disposizione G4. La reazione delle guaine che rispondono a B-CeP con B-CeP 1 produce prodotti che possono essere risolti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) ad alta risoluzione a livello di singolo nucleotide localizzando i singoli addotti di alchilazione e la scissione del filamento di DNA sulle guanine alchilate. La mappatura mediante B-CeP è uno strumento semplice e potente per la caratterizzazione in vitro di sequenze di DNA formanti G-quadruplex, consentendo la localizzazione precisa delle guanine coinvolte nella formazione delle G-tetrade.
Introduction
Oltre alla tipica doppia elica di Watson-Crick, gli acidi nucleici possono adottare varie strutture secondarie, come la forma alternativa G-quadruplex (G4), a causa delle loro sequenze ricche di guanina. La struttura G4 si basa sulla formazione di tetrameri planari, chiamati G-tetrade, in cui quattro guanine interagiscono attraverso legami idrogeno di Hoogsteen. Le G-tetradi sono impilate e ulteriormente stabilizzate da cationi monovalenti coordinati al centro del nucleo guaninico (Figura 1)1.
Figura 1: Rappresentazione schematica di una struttura G-quadruplex. (A) Rappresentazione schematica di una G-tetrade. L’array planare è stabilizzato dall’appaiamento di basi di Hoogsteen e da un catione centrale (M+). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le sequenze con quattro o più cicli di almeno due nucleotidi guanina consecutivi sono potenziali sequenze formanti G-quadruplex (PQS) che possono ripiegarsi in strutture G-quadruplex. Le PQS sono localizzate in molti contesti cellulari diversi, come i telomeri, i promotori genici, il DNA ribosomiale e i siti di ricombinazione, e sono coinvolte nella regolazione di molti processi biologici2. Quindi, l’identificazione e la validazione sperimentale di G4 nel genoma umano, che attualmente viene eseguita principalmente attraverso strumenti computazionali, è una questione biologicamente rilevante3. Al fine di supportare le previsioni computazionali o rilevare strutture G4 non previste, viene mostrato un metodo accessibile basato sulla mappatura chimica per identificare la formazione di G4 in un modello di DNA, che consente l’identificazione precisa delle guanine che formano la struttura G-tetrade.
Il saggio di mappatura chimica riportato sfrutta la diversa reattività delle bis-3-cloropiperidine (B-CePs) con le guanine in seguito alla formazione di strutture G4. A causa della loro elevata reattività con i nucleofili 4,5,6,7,8,9, i B-CeP sono agenti alchilanti dell’acido nucleico con la capacità di reagire in modo molto efficiente con la posizione N7 dei nucleotidi guanina10. L’alchilazione è seguita dalla depurazione e dalla scissione del filamento nei costrutti di DNA a singolo e doppio filamento. Al contrario, le guaine coinvolte nella formazione delle G-tetradi nelle disposizioni G4 sono impermeabili all’alchilazione B-CeP, poiché la posizione N7 delle guanine è implicata nei legami idrogeno di Hoogsteen. Questa specifica reattività dei B-CeP permette non solo la rilevazione delle strutture G4, ma anche l’identificazione delle guanine che formano la/e tetrade/e, come si può dedurre dalla loro relativa protezione dall’alchilazione rispetto alle guanine nel DNA a singolo e doppio filamento.
Il protocollo di mappatura chimica è riportato qui utilizzando B-CeP 1 (Figura 2A) come sonda per la caratterizzazione dell’aptamero legante la trombina (TBA), un DNA a 15 meri in grado di assumere la disposizione G4 in presenza di cationi di potassio11,12. La disposizione G4 di TBA (G4-TBA) è direttamente confrontata con due controlli, vale a dire TBA nella forma a singolo filamento (ssTBA) e TBA ricotto alla sua sequenza complementare per formare il costrutto a doppio filamento (dsTBA) (Tabella 1). I prodotti delle reazioni di sondaggio vengono risolti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) ad alta risoluzione a livello di singolo nucleotide localizzando i singoli addotti di alchilazione e la scissione del filamento di DNA sulle guanine alchilate. La visualizzazione sul gel è resa possibile dalla coniugazione dell’oligonucleotide TBA con un fluoroforo alla sua estremità 3′ (Tabella 1). Questo protocollo mostra come ripiegare TBA nelle sue diverse conformazioni (G4 e controlli) e come eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP seguite da PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
I G-quadruplex sono strutture secondarie di acido nucleico che tipicamente si ripiegano all’interno di sequenze di DNA ricche di guanina e sono obiettivi di ricerca significativi a causa della loro associazione con il controllo genetico e le malattie. La mappatura chimica mediante B-CePs è un protocollo utile per la caratterizzazione del DNA G4s, che può essere utilizzato per identificare le basi guaninica coinvolte nella formazione delle G-tetrade in condizioni fisiologiche di sale.
La sond…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Farmaceutiche e Farmacologiche dell’Università di Padova (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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