皮膚生検からの患者由来足細胞の生成

プロトコルは、フリードリヒアレクサンダー大学エアランゲンニュルンベルク(251_18B)の倫理委員会によって承認され、すべての患者と発端者が書面による同意を与えました。すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。ここで使用するすべての培地および溶液の構成については 、表1を参照してください。 1.皮膚パンチ生検による皮膚線維芽細胞の増殖 皮膚パンチ生検を、10 mLの予熱した線維芽細胞培地を含む滅菌15 mLの円錐管に移します。 培地を取り出し、皮膚パンチ生検を滅菌済みの予熱した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)5 mLで3回洗浄します。滅菌鉗子による皮膚パンチ生検を10cmの細胞培養プレートに移し、滅菌メスで幅方向に3〜4個に切断し、表皮と真皮を残します。 各ピースを滅菌済みの35 mmプラスチック細胞培養皿に移し、培養皿に軽く押し付けます。生検片の周りの余分な培地を取り除きます。液体が蒸発し、生検が細胞培養プラスチックに付着するまで、5〜10分間乾燥させます。 生検の周りに1,000 μLのピペットで1 mLの線維芽細胞培地を滴下し、最終容量3 mLまで注意深く充填します。37°C、5%CO2 で7日間、皿に餌を与えたり動かしたりすることなく培養する。培地を新鮮で予熱した線維芽細胞培地に慎重に交換します。7日後、成長した紡錘状線維芽細胞は、位相差顕微鏡36を用いて皮膚生検の周囲をモニターすることができる。注意: 成長した線維芽細胞が皿の縁に到達したら、手順1.3から再度進んで線維芽細胞の別のバッチを生成します。 成長した線維芽細胞を拡張するには、2 mLの予熱した1x PBSで洗浄し、線維芽細胞を1 mLの1xトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で解離させ、37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。剥離した細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、2 mLの新鮮な予温した線維芽細胞培地で細胞培養皿を洗浄します。 洗浄媒体をチューブにプールして解離剤を中和し、遠心分離機を200 x gで20°Cで5分間行います。 上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの新鮮な予温した線維芽細胞培地で再懸濁します。トリパンブルーを使用してノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターで細胞をカウントし、新鮮な細胞培養フラスコに2.5 x 10 3〜5 x 103線維芽細胞を1cm2ずつシードします。 フラスコをインキュベーターに戻し、フラスコを各方向に3回動かして細胞を均等に分配します。翌日、培地を新鮮で温めた線維芽細胞培地と交換します。 週に2回培地を交換し、線維芽細胞が約80%のコンフルエントに達したら分割します。 2.凍結皮膚線維芽細胞 線維芽細胞を凍結するには、5 mLの予熱した1x PBSで洗浄します。PBSを吸引し、線維芽細胞を4 mLの1xトリプシン-EDTAで解離させます。フラスコをインキュベーターに戻し、5%CO2で37°Cで5〜7分間インキュベートします。位相差顕微鏡を使用して剥離を監視し、フラスコの側面を軽くたたいて細胞を剥離します。 剥離した細胞を15 mLコニカルチューブに移します。細胞培養フラスコを、5 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地で洗浄します。洗浄媒体をコニカルチューブにプールし、200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを2 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地で再懸濁します。細胞を数え、1 x 106 個の細胞を新しい円錐形のチューブに移します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、90%ウシ胎児血清および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる1mLの冷線維芽細胞凍結培地で細胞ペレットを再懸濁します。クライオバイアルに移し、冷凍容器に入れ、-80°Cで一晩凍結します。 長期保存の場合は、翌日クライオバイアルを液体窒素タンクに入れます。 3. 線維芽細胞のエピソームリプログラミングによるhiPS細胞生成 エピソームリプログラミングには、継代4から8までの1.5 x 106 線維芽細胞を使用します。この細胞数に達するには、約70%のコンフルエントで2〜3個の250 mLフラスコを使用します。 再プログラミングの前日に、線維芽細胞を1:2の比率に分割して増殖状態を確保します。したがって、培地を吸引し、フラスコあたり5 mLの予熱した1x PBSでフラスコを洗浄します。PBSを吸引し、線維芽細胞を4 mLの1xトリプシン-EDTAで解離させます。フラスコをインキュベーターに戻し、37°Cおよび5%CO2で5〜7分間インキュベートします。位相差顕微鏡を使用して剥離を監視し、フラスコの側面を軽くたたいて、プラスチック表面から細胞を剥離します。 剥離した細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、5 mLの新鮮な予温した線維芽細胞培地で細胞培養フラスコを洗浄します。洗浄媒体をコニカルチューブにプールし、200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを6 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地に再懸濁します。 フラスコあたり5 mLの新鮮な予熱された線維芽細胞培地を加えて、6つの新しい細胞培養フラスコを準備します。線維芽細胞懸濁液1 mLを各フラスコに加えます。フラスコをインキュベーターに戻し、フラスコを各方向に3回動かして細胞を均等に分配します。 エピソームリプログラミングの場合は、hiPS細胞培養に適した10 cm細胞培養プレート2枚を、プレートあたり4 mLのコールドコーティング溶液でコーティングします。プレートを37°Cで1時間インキュベートします。注:hiPS細胞を培養するには、異なる細胞培養プラスチックと追加の細胞外マトリックスコーティングが必要です(材料表を参照)。 線維芽細胞から培地を取り除き、フラスコあたり10 mLの予熱した1x PBSで洗浄します。PBSを吸引し、37°Cで5〜7分間インキュベートすることにより、フラスコあたり4 mLの1xトリプシン-EDTAで線維芽細胞を解離させます。 位相差顕微鏡を使用して剥離を監視し、必要に応じてフラスコの側面を軽くたたいて、プラスチック表面から細胞を剥離します。 剥離した細胞を50 mLコニカルチューブに移します。空のフラスコを6 mLの予熱した線維芽細胞培地で洗浄し、残りの細胞を回収し、円錐管にプールします。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを3 mLの新鮮な予熱した1x PBSに再懸濁します。 細胞を数え、1.5 x 106 線維芽細胞を新しい円錐管に移します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞ペレットを5 mLのエレクトロポレーション培地に再懸濁し、再度遠心分離します。その間に、コーティングした10 cm細胞培養プレートからコーティング溶液を吸引し、予熱した線維芽細胞培地7 mLを加えます。 遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを250 μL中の1.5 x 106細胞の濃度のエレクトロポレーション培地に再懸濁します。 250 μLの細胞懸濁液を、ギャップ距離4 mmのエレクトロポレーションキュベットに移します(材料の表を参照)。 各プラスミド(pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN)を総容量50 μLのエレクトロポレーション培地に4 μg添加して、プラスミドトランスフェクションミックスを調製します。キュベットに移し、軽くフリックして混ぜます。280 Vで1パルスでエレクトロポレーションします。 滅菌ハサミを使用してピペットチップを切断し、125 μLのエレクトロポレーション線維芽細胞を調製した10 cm細胞培養プレートのそれぞれに移します。プレートを全方向に3回攪拌して細胞を分配し、インキュベーターに戻します。37°Cで5%CO2 で一晩インキュベートします。 死細胞を除去するには、翌日、培地を7 mLの新鮮な予熱した線維芽細胞培地と交換します。 エレクトロポレーションの2日後に培地をhiPSC培地に変更し、その後20日間は1日おきに交換します。 4. 生成したヒジPS細胞の選定・増設・品質管理 エレクトロポレーション後のhiPSCコロニーの形成を観察するために、10倍または20倍の対物レンズを備えた位相差顕微鏡を使用して、少なくとも20日間細胞を毎日監視します。hiPSCコロニーのサイズが直径約300 μmで境界がはっきりしていて、hiPSCが高い核対体比を示す場合、hiPSCコロニーはピックによって選択することができます(図2B、C、および図3)。 ピッキングの前に、hiPSC培養に適した96ウェルプレートにウェルあたり100 μLのコーティング溶液をコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。 インキュベーション中に、細胞培養皿の底にある目的のコロニーをペンでマークします。96ウェルプレートの最終調製のために、コーティング溶液を取り出し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む100 μLの予熱したhiPS細胞培養液を各ウェルに加えます。 細胞を予温した1x PBSで洗浄し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む新鮮な予熱したhiPSc培養液を加えてから、死細胞を除去します。hiPSCコロニーをピックするには、ゲージ針を使用し、各コロニーにグリッドを描画してhiPSCコロニーを細かく分割します。 位相差顕微鏡を使用して、コロニーが正常に断片に分割されていることを確認します。それらを100 μLピペットで調製した96ウェルプレートに移します。細胞に触れずにピペットをコロニーの上に直立させて、コロニーの引っかき傷や損失を防ぎます。 96ウェルプレートを5%CO2 を含む37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を乱すことなく一晩付着させます。ピッキングがうまくいかない場合に備えて、線維芽細胞とhiPSCを混ぜた皿を保管してください。したがって、培地をhiPSc培地に変更してROCK阻害剤Y27632を除去し、プレートをインキュベーターに戻します。 翌日、96ウェルプレートの培地を200 μLの新鮮なhiPS細胞培養培地に交換し、1日おきに交換します。翌日、96ウェルプレートを監視し、正常にピックされたクローンでウェルにマークを付けます。注:ピックされたhiPSCクローンが最初の試行後に完全に選択されず、線維芽細胞がウェルで見つかった場合は、96ウェルからピッキングを繰り返すか、線維芽細胞をプレートからこすり落とします。 5. 選択されたhiPS細胞クローンの拡張 位相差顕微鏡を用いてhiPSCクローンをモニタリングする。選択したhiPS細胞が約70%のコンフルエント性に達すると、hiPSCクローンは増殖の準備が整います。 hiPSC培養に適した48ウェルプレートに、ウェルあたり250 μLのコーティング溶液を37°Cで1時間コーティングします。 コーティング溶液を、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む200 μLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養液と交換します。 96ウェルプレートからhiPS細胞を取り外すには、1,000 μLのピペットチップでプラスチック表面をこすります。剥離したhiPS細胞を96ウェルプレートから48ウェルプレートに移します。翌日、培地を新鮮な予熱したhiPS細胞培養培地に変更し、死細胞とROCK阻害剤Y27632を除去します。 hiPSCクローンが約70%のコンフルエンシーに達したら、hiPSCを24ウェルプレートに移します。そのため、hiPSC培養に適した24ウェルプレートに、1ウェルあたり400 μLのコーティング溶液を37°Cで1時間コーティングします。 コーティング溶液を、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む400 μLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養液と交換します。 48ウェルから培地を吸引し、500 μLの予熱した1x PBSで洗浄します。 PBSを10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む100 μLの酵素細胞剥離溶液に交換し、37°Cで4分間インキュベートします。1,000 μLのピペットを使用してプレートからhiPS細胞を洗い流します。解離した細胞を15 mLコニカルチューブに移します。空の48ウェルプレートを10 μM ROCK阻害剤Y27632を含むhiPSC培地で洗浄し、円錐管にプールします。 200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む1 mLのhiPS細胞培養液にhiPS細胞を再懸濁し、24ウェルプレートに移します。プレートを5%CO2 で37°Cのインキュベーターに入れ、プレートを全方向に3回撹拌して細胞を分配する。細胞を邪魔することなく一晩付着させます。 翌日、ROCK阻害剤Y27632を含まないhiPS細胞培地に培地交換します。注:hiPSCクローンが約70%のコンフルエントに達したら、手順5.4から5.7を繰り返し、12ウェルフォーマットに適した容量を増やして、hiPS細胞を12ウェルプレートに移します。12ウェルプレートからのhiPS細胞が約70%のコンフルエンシーに達したら、hiPSCクローンを6ウェルフォーマット用に容量を増やした6ウェルプレートに移します。 6. 選択したhiPS細胞クローンの凍結 選択したhiPSCクローンを凍結するには、6ウェルプレートから培地を吸引します。2 mLの1x PBSでウェルを洗浄します。10 μM Y27632を含む1 mLの酵素細胞剥離溶液でhiPS細胞を吸引し、解離します。プレートをインキュベーターに戻し、37°Cおよび5%CO2で4分間インキュベートします。 1,000 μLのピペットを使用してプレートからhiPS細胞を洗い流し、剥離した細胞を15 mLのコニカルチューブに移します。10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養液でプレートを洗浄します。コニカルチューブにプールし、200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養培地で細胞ペレットを再懸濁します。 細胞を数え、1 x 106 個の細胞を新しい円錐形のチューブに移します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを1 mLの冷無血清hiPSC凍結培地に再懸濁し、凍結容器を用いて-80°Cで一晩凍結した。 長期保存の場合は、翌日クライオバイアルを液体窒素タンクに入れます。 7. HiPS細胞の品質管理 ヒジPS細胞形態のキャラクタリゼーション20倍対物レンズの位相差顕微鏡を用いて特徴的なhiPSC形態を確認します。リプログラミング後、細胞形態は長い紡錘体状の線維芽細胞から小さな丸いhiPS細胞に変化し、明確な境界を持つコロニーで高い核対体比が成長します(図2C)。 hiPSCコロニーが密になりすぎて自発的な分化が起こる場合は、ピペットチップを使用して分化した部分をプレートからこすり落とします(図3)。hiPS細胞は増殖率が高いため、hiPSC培養物には、新鮮で予熱したhiPSC供給培地を毎日給餌してください。 免疫蛍光染色による多能性マーカーの特性評価生成されたhiPSCの多能性マーカーを免疫蛍光染色で確認するには、プラスチック製カバーガラスを24ウェルプレートに入れ、250 μLのコーティング溶液で37°C、5%CO2で1時間コーティングします。コーティング溶液を、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む1 mLの予熱したhiPS細胞培養液と交換します。 24ウェルあたり1.9 x 104 個の解離したhiPS細胞をシードします。hiPS細胞を37°C、5%CO2 で一晩、乱すことなく取り付けます。hiPS細胞の解離については、手順5.4から5.6を参照してください。翌日、ROCK阻害剤Y27632を含まないhiPS細胞培地と培地を交換します。 染色するには、予熱した1 mLの1x PBSで細胞を洗浄し、続いてhiPS細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。固定したhiPS細胞を1x PBSで洗浄し、ウェルあたり200 μLのプレインキュベーション溶液で室温で1時間、非特異的結合部位をブロックします。一次抗体Ki67(1:300)、OCT3/4(1:200)、SSEA4(1:100)を抗体希釈液で希釈します。 70%エタノールでプラスチックホイルをきれいにし、貯水池で満たされた染色室に入れます。30 μLの一次抗体希釈液の液滴をホイル上に置きます。固定サンプルを逆さまにして希釈液に入れ、4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、サンプルを1x PBSで5分間3回洗浄し、30 μLの二次抗体希釈液(1:1,000)をホイルのきれいな場所に置きます。カバースライドを逆さまにして希釈液に入れます。暗所で室温で1時間インキュベートします。 インキュベーション後、1x PBSで5分間3回洗浄します。DAPIを含む封入剤のスライドガラスにサンプルをマウントします。室温および暗所で一晩乾燥させ、共焦点顕微鏡を使用してサンプルを画像化します(図4)。 細菌とマイコプラズマ汚染の排除細菌汚染を排除するために、500 μLの解離したhiPS細胞を5 mLの予熱したルリア・ベルターニ(LB)培地に移します。hiPS細胞の解離については、手順5.4から5.6を参照してください。37°Cで一晩インキュベートします。 LB培地が濁っているように見える場合は、細菌汚染が発生している可能性があります。セルを破棄します。 マイコプラズマ汚染を排除するには、約90%のコンフルエントなhiPS細胞を含む6つのウェルから2日間交換されていない培地を収集します。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用して、マイコプラズマ汚染を検出します。この目的のために、多くの市販のマイコプラズマ検出キットが入手可能です。 8. ヒプ細胞から足細胞への分化 成長因子の調製と保管ストック濃度10 mM Y27632を調製するには、3.12 mLの滅菌水中で10 mgのY27632(分子量320.26 g / mol)を再構成します。100 μLアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:1,000に希釈して最終濃度10 μMにします。 30 mM CHIR99021のストック濃度を調製するには、358.2 μLの滅菌DMSOで5 mgのCHIR99021(分子量465.34 g / mol)を再構成します。50 μLのアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:10,000に希釈して最終濃度3 μMにします。 100 μg/mLのアクチビンAのストック濃度を調製するには、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む1x PBSの1 mL中に100 μgのアクチビンAを再構成します。100 μLのアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:2,000に希釈して、最終濃度50 ng/mLにします。 100 μg/mLのストック濃度の骨形態形成タンパク質7(BMP7)を調製するには、0.1%BSAを含む1 mLの滅菌水中で100 μgのBMP7を再構成します。100 μLのアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:2,000に希釈して、最終濃度50 ng/mLにします。 100 μg/mLの血管内皮増殖因子(VEGF)のストック濃度を調製するには、1 mLの滅菌水中で100 μgのVEGFを再構成します。100 μLアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:4,000に希釈して、最終濃度25 ng/mLにします。 10 mMのストック濃度のオールトランスレチノイン酸を調製するには、10 mgのオールトランスレチノイン酸を3.33 mLの滅菌DMSOで再構成します。100 μLアリコートを-20°Cで保存し、細胞培養培地で1:100に希釈して最終濃度0.5 μMにします。 中胚葉系譜を誘導するWNTシグナル伝達経路の活性化hiPSCをhiPS細胞由来ポドサイトへ分化させるには、hiPS細胞培養に適した細胞培養プレートまたはフラスコをコーティング溶液で37°C、5%CO2で1時間コーティングします。コーティング溶液の総容量は、6ウェル培養プレートあたり1 mL、または10 cm細胞培養プレートあたり4 mLです。 培地を吸引し、予熱した1x PBSでhiPS細胞を洗浄します。PBSを吸引し、10 μM Y27632を含む酵素細胞剥離溶液を、6ウェル培養プレートあたり1 mLまたは10 cm細胞培養プレートあたり4 mLの総容量で加えます。 プレートをインキュベーターに戻し、37°Cおよび5%CO2で4分間インキュベートします。1,000 μLのピペットを使用してプレートからhiPS細胞を洗い流します。剥離したセルを円錐管に移します。 10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む新鮮な予熱したhiPS細胞培養液でプレートを洗浄します。洗浄媒体をコニカルチューブにプールして、解離試薬を中和します。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの新鮮な予熱したhiPS細胞培養培地で細胞ペレットを再懸濁します。 細胞を数え、1 x 104 hiPSC / cm2をシードします。全方向に3回攪拌して細胞を分配する。hiPS細胞を5%CO2 で37°Cで一晩、乱すことなく取り付けます。 翌日、培地を、1x B27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng / mLアクチビンA、および10 μM ROCK阻害剤Y27632を含む2 mLの予熱した中胚葉分化培地と交換します。 ネフロン前駆細胞への分化2日後、中胚葉培地を、1xB27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng/mLアクチビンA、および50 ng/mL BMP7/6ウェル培養プレートまたは10 cm細胞培養プレートあたり6 mLを含む2 mLの予熱したネフロン前駆分化培地に変更します。次の14日間は、1日おきに培地を交換してください。注:ネフロン前駆細胞は増殖し、ネフロン前駆細胞増殖培地で分化の7日後に継代および凍結することができる。 ネフロン前駆細胞を分割するには、hiPS細胞培養に適した細胞培養プラスチックをコーティング溶液でコーティングし、37°Cで1時間コーティングします。 コーティング液をネフロン前駆細胞増殖培地と交換します。培地を吸引し、予熱した1x PBSで細胞を洗浄します。PBSを除去し、細胞を1xトリプシン-EDTAで解離させます。 37°C、5%CO2で5分間インキュベートします。位相差顕微鏡を用いて細胞の剥離をモニターする。必要に応じて、プラスチックの側面を軽くたたいて、セルを表面から切り離します。細胞をプレートから洗い流し、円錐形のチューブに移します。空のフラスコまたはプレートを、解離試薬と同じ量の予熱したネフロン前駆細胞増殖培地で洗浄する。 洗浄媒体を円錐形のチューブにプールします。200 x g で20°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、細胞ペレットを2 mLの新鮮な予熱したネフロン前駆細胞増殖培地で再懸濁します。さらなる分化のために細胞およびシード1.5 x 104 ネフロン前駆細胞をcm2 あたり1.5 x 10でカウントする。注:ネフロン前駆細胞を凍結するには、1 x 106 細胞を1 mLの冷無血清凍結保存培地に再懸濁し、クライオバイアルに移します。-80°Cの冷凍容器で一晩凍結し、液体窒素タンクに移して長期保存します。 プレートをインキュベーターに戻し、細胞を全方向に3回攪拌して均等に分配します。翌日、培地を新鮮で予熱したネフロン前駆分化培地に変更します。細胞がネフロン前駆分化培地で14日間分化するまで1日おきに培地を交換する。 iPS細胞由来ポドサイトへの終末分化培地を吸引し、6ウェル培養プレートあたり1xB27サプリメント、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、3 μM CHIR99021、50 ng/mLアクチビンA、50 ng/mL BMP7、25 ng/μL VEGF、および0.5 μMオールトランスレチノイン酸を含む2 mLの予温した足細胞分化培地を6ウェル培養プレートまたは6 mL/10 cm細胞培養プレートに追加します。プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに戻します。新鮮で予温した足細胞分化培地で4日間、1日おきに培地を交換します。 分化後の培養液にhiPSC-ポドサイトを保持するには、10%のウシ胎児血清、1%のペニシリン-ストレプトマイシン、および0.1%のインスリン-トランスフェリン-セレンを含むポドサイト維持培地を週に2回細胞に与えます。注:終末分化型hiPSC足細胞は増殖しなくなります。ただし、最大4週間細胞培養に保存することは可能です。 凍結ネフロン前駆細胞の融解と増殖hiPSC培養に適した新しい細胞培養用プラスチックフラスコに、37°Cおよび5%CO2で1時間のコーティング溶液をコーティングします。コーティング溶液を5mLのネフロン前駆細胞増殖培地と交換します。 予熱したネフロン前駆細胞増殖培地7 mLを含む15 mLのコニカルチューブを準備します。凍結細胞を37°Cの水浴中で約20秒間動かずに解凍します。細胞の半分が解凍され、氷が残っているときに、クライオバイアルを水浴から取り出します。 クライオバイアルに70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネットに入れます。解凍した細胞を予熱したネフロン前駆細胞拡張培地で円錐管に移します。1,000 μLのピペットを使用して、細胞をチューブの壁を非常にゆっくりと流れ落ちさせます。 空のクライオバイアルを1 mLのネフロン前駆細胞増殖培地で洗浄し、残りの細胞を回収し、円錐管にプールします。200 x g で20°Cで5分間遠心分離し、細胞ペレットを新鮮な予熱したネフロン前駆細胞増殖培地に再懸濁します。 解凍した細胞をコーティングされたフラスコに移し、翌日、培地を新鮮な予熱したネフロン前駆細胞増殖培地に変更します。さらに分化する前に、1日おきに培地を交換してネフロン前駆細胞増殖培地で細胞を増殖させ、ステップ8.3.5から進めます。 9. 免疫蛍光染色によるiPS細胞由来ポドサイトのキャラクタリゼーション 免疫蛍光染色により分化した足細胞にポドサイト特異的マーカーがあるかどうかを確認するには、プラスチック製のカバーガラスを24ウェルプレートに入れ、250 μLのコーティング溶液で37°C、5%CO2で1時間コーティングします。 コーティング溶液を、予熱したネフロン前駆細胞増殖培地1 mLと交換します。24ウェルプレートあたり2.5 x 104解離したネフロン前駆細胞をシードする。ネフロン前駆細胞の解離については、ステップ8.3.2〜8.3.4を参照してください。 細胞を37°C、5%CO2で一晩乱すことなく付着させます。翌日、予熱したネフロン前駆分化培地と培地を交換します。 細胞が分化するまで、1日おきに培地を交換して分化を終了し、ネフロン前駆細胞分化培地で合計14日間、さらに5日間ポドサイト分化培地で分化させる。 最終分化後、予温した1 mLの1x PBSで細胞を洗浄します。hiPSC足細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。固定した細胞を1x PBSで洗浄し、ウェルあたり200 μLのプレインキュベーション溶液で室温で1時間、非特異的結合部位をブロックします。 一次抗体シナプトポジン(1:200)、ポドシン(1:100)、およびネフリン(1:25)を抗体希釈液で希釈し、30 μLの一次抗体希釈液滴を、貯水槽を含む染色チャンバー内の清潔なプラスチックホイル上に置きます。 固定されたhiPSCポドサイトを逆さまにしたカバースライドを希釈液に入れます。4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、1x PBSで5分間3回洗います。二次抗体(1:1,000)を1x PBSで希釈し、30 μLの二次抗体希釈液滴をホイル上のきれいな場所に置きます。カバースライドを逆さまにして希釈液に入れます。 暗所で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、1x PBSで5分間3回洗浄します。DAPIを含む封入剤のスライドガラスにサンプルをマウントします。室温と暗所で一晩乾燥させます。共焦点顕微鏡を使用してサンプルを画像化します。