从皮肤活检中生成患者来源的足细胞

该方案得到了埃尔朗根-纽伦堡弗里德里希-亚历山大大学伦理委员会（251_18B）的批准，所有患者和先证者都给予了书面同意。所有实验均按照相关指南和规定进行。有关此处使用的所有介质和溶液的组成，请参见 表1。 1. 皮肤穿刺活检中真皮成纤维细胞的生长 将皮肤穿刺活检转移到带有 10 mL 预热成纤维细胞培养基的无菌 15 mL 锥形管中。 取出培养基，用 5 mL 无菌、预热的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗皮肤穿刺活检 3 次。用无菌镊子将皮肤穿刺活检转移到10cm细胞培养板上，并用无菌手术刀将其横向切成三到四块，留下表皮和真皮。 将每块转移到无菌的35 mm塑料细胞培养皿中，并将其轻轻按压到培养皿上。去除活检片周围的多余培养基。干燥5-10分钟，直到液体蒸发并将活检附着在细胞培养塑料上。 在活检周围用 1，000 μL 移液管滴加 1 mL 成纤维细胞培养基，并小心填充至最终体积为 3 mL。在37°C，5%CO2 下培养7天，不喂食和移动培养皿。小心地将培养基更换为新鲜的预热成纤维细胞培养基。7天后，可以使用相差显微镜36监测皮肤活检周围生长的纺锤形成纤维细胞。注意：当生长的成纤维细胞到达培养皿边缘时，再次从步骤1.3继续生成另一批成纤维细胞。 为了扩增生长的成纤维细胞，用2mL预热的1x PBS洗涤，用1mL的1x胰蛋白酶 – 乙二胺四乙酸（EDTA）解离成纤维细胞，并在37°C，5%CO2下孵育5分钟。将分离的细胞转移到 15 mL 锥形管中，并用 2 mL 新鲜的预热成纤维细胞培养基洗涤细胞培养皿。 将洗涤介质聚集在管中以中和解离剂，并在20°C下以200×g离心5分钟。 吸出上清液，并用 1 mL 新鲜的预热成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀。使用台盼蓝和新鲜细胞培养瓶中每cm 2的种子2.5 x 103至5 x 103个成纤维细胞，用Neubauer室或自动细胞计数器计数细胞。 将烧瓶放回培养箱中，并通过在每个方向上移动烧瓶三次来均匀分布细胞。第二天，用新鲜的、预热的成纤维细胞培养基替换培养基。 每周更换培养基两次，并在成纤维细胞达到约80%汇合时分开。 2. 冷冻真皮成纤维细胞 要冷冻成纤维细胞，请用 5 mL 预热的 1x PBS 洗涤它们。吸出 PBS 并用 4 mL 的 1x 胰蛋白酶-EDTA 解离成纤维细胞。将烧瓶放回培养箱中，并在37°C下以5%CO2孵育5-7分钟。使用相衬显微镜监测分离，并敲击烧瓶的侧面以分离细胞。 将分离的细胞转移到 15 mL 锥形管中。用 5 mL 新鲜的预热成纤维细胞培养基洗涤细胞培养瓶。将洗涤介质沉淀在锥形管中，并在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液，并用 2 mL 新鲜的预热成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀。计数细胞并将1 x 106 细胞转移到新的锥形管中。在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液并用 1 mL 由 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 组成的冷成纤维细胞冷冻培养基重悬细胞沉淀。转移到冷冻管中，放入冷冻容器中，在-80°C下冷冻过夜。 为了长期储存，第二天将冷冻管放入液氮罐中。 3. 成纤维细胞的游离体重编程以产生hiPSC 对于游离体重编程，从第 4 代到 8 使用 1.5 x 106 个成纤维细胞。要达到此细胞数，请使用两到三个浓度约为 70% 的 250 mL 烧瓶。 在重编程的前一天，以1：2的比例分裂成纤维细胞以确保其增殖状态。因此，吸出培养基并用每个烧瓶5mL预热的1x PBS洗涤烧瓶。吸出 PBS 并用 4 mL 的 1x 胰蛋白酶-EDTA 解离成纤维细胞。将烧瓶放回培养箱中，在37°C和5%CO2下孵育5-7分钟。使用相衬显微镜监测分离，并敲击烧瓶的侧面以将细胞从塑料表面上分离。 将分离的细胞转移到 50 mL 锥形管中，并用 5 mL 新鲜的预热成纤维细胞培养基洗涤细胞培养瓶。将洗涤介质沉淀在锥形管中，并在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 6 mL 新鲜、预热的成纤维细胞培养基中。 通过在每个烧瓶中加入 5 mL 新鲜、预热的成纤维细胞培养基来制备六个新的细胞培养瓶。向每个烧瓶中加入 1 mL 成纤维细胞悬液。将烧瓶放回培养箱中，并通过在每个方向上移动烧瓶三次来均匀分布细胞。 对于游离体重编程，用每块板 4 mL 的冷包被溶液包被两个适用于 hiPSC 培养的 10 cm 细胞培养板。将板在37°C孵育1小时。注意：要培养hiPSC，需要不同的细胞培养塑料和额外的细胞外基质包被（参见 材料表）。 从成纤维细胞中取出培养基，并用每个烧瓶中预热的1x PBS洗涤。吸出PBS并通过在37°C孵育5-7分钟，每个烧瓶中用4mL的1x胰蛋白酶-EDTA解离成纤维细胞。 使用相衬显微镜监测分离，如有必要，轻敲烧瓶的侧面以将细胞从塑料表面上分离。 将分离的细胞转移到 50 mL 锥形管中。用6mL预热的成纤维细胞培养基洗涤空烧瓶，以收集剩余的细胞并汇集在锥形管中。在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 3 mL 新鲜、预热的 1x PBS 中。 计数细胞并在新的锥形管中转移1.5 x 106 个成纤维细胞。在20°C下以200× g 离心5分钟。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于5 mL电穿孔培养基中，然后再次离心。同时，从包被的10cm细胞培养板中吸出包被溶液，并加入7mL预热的成纤维细胞培养基。 离心后，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于电穿孔培养基中，浓度为1.5 x 10 6个细胞在250μL中。 将250μL细胞悬 液转移到间隙距离为4mm的电穿孔比色皿中（参见 材料表）。 通过将 4 μg 每种质粒（pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN）添加到总体积为 50 μL 的电穿孔培养基中来制备质粒转染混合物。转移到比色皿中，轻轻轻弹混合。在 280 V 下用一个脉冲电穿孔。 使用无菌剪刀切割移液器吸头，并将 125 μL 电穿孔成纤维细胞转移到每个制备的 10 cm 细胞培养板上。通过向各个方向搅拌板三次来分配细胞，然后将它们放回培养箱中。在37°C下用5%CO2 孵育过夜，不受干扰。 要去除死细胞，第二天用 7 mL 新鲜的预热成纤维细胞培养基替换培养基。 电穿孔后 2 天将培养基更换为 hiPSC 培养基，并在接下来的 20 天内每隔一天更换一次。 4. 生成的hiPSC的选择、扩增和质量控制 使用具有10倍或20倍物镜的相差显微镜每天监测细胞至少20天，以观察电穿孔后hiPSC集落的形成。如果hiPSC集落的直径约为300μm，边界明显，并且hiPSC显示出高核体比，则hiPSC菌落可以通过挑选进行选择（图2B，C 和 图3）。 在挑选之前，用每孔100μL包被溶液包被适合hiPSC培养的96孔板，并在37°C下孵育1小时。 在孵育过程中，用笔在细胞培养皿底部标记感兴趣的菌落。对于 96 孔板的最终制备，除去包衣溶液并向每个孔中加入 100 μL 含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的预热 hiPSC 培养基。 用预热的 1x PBS 洗涤细胞，并加入含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的新鲜预热 hiPSC 培养基，然后挑选去除死细胞。要挑选hiPSC菌落，请使用量规针，并通过在每个菌落中绘制网格将hiPSC菌落分成小块。 使用相衬显微镜检查菌落是否成功分成碎片。用 100 μL 移液器将它们转移到准备好的 96 孔板中。将移液器直立在菌落上，不要接触细胞，以避免划伤和菌落丢失。 将96孔板置于37°C的培养箱中，5%CO2 ，让细胞附着过夜而不会受到干扰。将培养皿与成纤维细胞和hiPSC混合物一起保存，以防采摘不成功。因此，通过将培养基更换为 hiPSC 培养基来去除 ROCK 抑制剂 Y27632，并将板放回培养箱中。 第二天，将 96 孔板的培养基更换为 200 μL 新鲜的 hiPSC 培养基，并每隔一天更换一次。第二天监测96孔板，并用成功挑选的克隆标记孔。注意：如果在第一次尝试后未完全选择拾取的hiPSC克隆，并且可以在孔中找到成纤维细胞，请从96孔中重复拾取或从板上刮下成纤维细胞。 5. 扩增选定的 hiPSC 克隆 使用相衬显微镜监测hiPSC克隆。如果选定的 hiPSC 达到约 70% 的汇合度，则 hiPSC 克隆已准备好进行扩增。 在37°C下用每孔250μL包衣溶液涂覆适用于hiPSC培养的48孔板1小时。 用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的 200 μL 新鲜预热 hiPSC 培养基替换包衣溶液。 要将 hiPSC 从 96 孔板上分离，请用 1，000 μL 移液器吸头刮擦塑料表面。将分离的hiPSC从96孔板转移到48孔板。第二天将培养基更换为新鲜的预热hiPSC培养基，以去除死细胞和ROCK抑制剂Y27632。 如果 hiPSC 克隆达到约 70% 汇合度，则将 hiPSC 转移到 24 孔板中。因此，在37°C下用每孔400μL包衣溶液涂覆适用于hiPSC培养的24孔板1小时。 用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的 400 μL 新鲜预热的 hiPSC 培养基替换包衣溶液。 从 48 个孔中吸出培养基，并用 500 μL 预热的 1x PBS 洗涤。 用含有10μM ROCK抑制剂Y27632的100μL酶细胞分离溶液替换PBS，并在37°C下孵育4分钟。使用 1，000 μL 移液器冲洗板上的 hiPSC。将解离的细胞转移到 15 mL 锥形管中。用含有10μM ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基洗涤空的48孔板，并汇集在锥形管中。 在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液并将 hiPSC 重悬于 1 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的 hiPSC 培养基中，并转移到 24 孔板中。将板置于37°C的培养箱中，5%CO2 ，并通过向各个方向搅拌板三次来分配细胞。让细胞附着过夜而不会受到干扰。 第二天，将培养基更换为不含ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基。注意：如果hiPSC克隆达到约70%汇合度，则通过重复步骤5.4至5.7将hiPSC转移到12孔板中，并增加适合12孔格式的体积。如果来自 12 孔板的 hiPSC 达到约 70% 汇合度，则将 hiPSC 克隆转移到 6 孔板中，增加 6 孔格式的体积。 6. 冷冻选定的hiPSC克隆 要冷冻选定的hiPSC克隆，请从6孔板中吸出培养基。用 2 mL 的 1x PBS 洗涤孔。用含有 10 μM Y27632 的 1 mL 酶细胞分离溶液吸出并解离 hiPSC。将板放回培养箱中，在37°C和5%CO2下孵育4分钟。 使用 1，000 μL 移液器冲洗板上的 hiPSC，并将分离的细胞转移到 15 mL 锥形管中。用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的 2 mL 新鲜预热 hiPSC 培养基洗涤板。在锥形管中沉淀，并在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液，并用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的 2 mL 新鲜预热 hiPSC 培养基重悬细胞沉淀。 计数细胞并将1 x 106 细胞转移到新的锥形管中。在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于1mL冷的无血清hiPSC冷冻培养基中，并使用冷冻容器在-80°C冷冻过夜。 对于长期储存，第二天将冷冻管放入液氮罐中。 7. HiPSC质量控制 hiPSC形态学的表征使用具有20倍物镜的相衬显微镜检查特征hiPSC形态。重编程后，细胞形态从长而纺锤状成纤维细胞变为小的圆形hiPSC，呈现在具有不同边界的集落中生长的高细胞核体比（图2C）。 如果hiPSC菌落变得太致密并发生自发分化，请使用移液器吸头从板上刮下分化的部件（图3）。由于hiPSC具有高增殖率，因此每天用新鲜的预热hiPSC补料培养基喂养hiPSC培养物。 通过免疫荧光染色表征多能性标志物为了通过免疫荧光染色 检查 生成的hiPSC的多能性标志物，将塑料盖玻片置于24孔板中，并在37°C和5%CO2下涂覆250μL包衣溶液1小时。用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的预热 hiPSC 培养基替换包衣溶液。 每 24 孔接种 1.9 x 104 个解离的 hiPSC。让hiPSC在37°C和5%CO2 下附着过夜而不会受到干扰。请参阅步骤 5.4 至 5.6 了解 hiPSC 的解离。第二天用不含ROCK抑制剂Y27632的hiPSC培养基替换培养基。 为了染色，用 1 mL 预热的 1x PBS 洗涤细胞，随后在室温下用 4% 多聚甲醛固定 hiPSC 10 分钟。用 1x PBS 洗涤固定的 hiPSC，并在室温下每孔用 200 μL 预孵育溶液封闭非特异性结合位点 1 小时。在抗体稀释剂中稀释一抗Ki67（1：300），OCT3/4（1：200），SSEA4（1：100）。 用70%乙醇清洁塑料箔，并将其放入装有水箱的染色室中。将 30 μL 一抗稀释液的液滴放在箔纸上。将固定样品倒置在稀释液中，并在4°C下孵育过夜。 第二天，用 1x PBS 洗涤样品 3 次 5 分钟，并将 30 μL 二抗稀释液液滴 （1：1，000） 放在箔纸上的干净点上。将盖玻片倒置放入稀释液中。在室温下在黑暗中孵育1小时。 孵育后，用1x PBS洗涤3次5分钟。将样品安装在含有DAPI的安装介质中的载玻片上。在室温和黑暗中干燥过夜，并使用共聚焦显微镜对样品进行成像（图4）。 排除细菌和支原体污染为了排除细菌污染，将 500 μL 解离的 hiPSC 转移到 5 mL 预热的 Luria-Bertani （LB） 培养基中。请参阅步骤 5.4 至 5.6 了解 hiPSC 的解离。在37°C孵育过夜。 如果LB培养基看起来浑浊，则可能发生了细菌污染。丢弃单元格。 为了排除支原体污染，从具有约90%汇合hiPSC的6个孔中收集2天未更换的培养基。使用定量聚合酶链反应 （qPCR） 检测支原体污染。许多商用支原体检测试剂盒可用于此目的。 8. hiPSCs分化为足细胞 生长因子的制备和储存为了制备10mM Y27632的储备浓度，在3.12mL无菌水中复溶10mgY27632（分子量为320.26g / mol）。将100μL等分试样储存在-20°C，并在细胞培养基中以1：1，000稀释至终浓度10μM。 为了制备30mM CHIR99021的储备浓度，在358.2μL无菌DMSO中复溶5mg的CHIR99021（分子量为465.34g / mol）。将50μL等分试样储存在-20°C，并在细胞培养基中以1：10，000稀释至终浓度3μM。 为了制备浓度为 100 μg/mL 的活化素 A，在含有 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 1 mL 1x PBS 中复溶 100 μg 活化素 A。将 100 μL 等分试样储存在 -20 °C 下，并在细胞培养基中以 1：2，000 稀释，以达到 50 ng/mL 的终浓度。 为了制备 100 μg/mL 骨形态发生蛋白 7 （BMP7） 的储备浓度，请将 100 μg BMP7 复溶在含有 0.1% BSA 的 1 mL 无菌水中。将 100 μL 等分试样储存在 -20 °C 下，并在细胞培养基中以 1：2，000 稀释，以达到 50 ng/mL 的终浓度。 为了制备浓度为 100 μg/mL 的血管内皮生长因子 （VEGF），请在 1 mL 无菌水中复溶 100 μg VEGF。将 100 μL 等分试样储存在 -20 °C 下，并在细胞培养基中以 1：4，000 稀释，以达到 25 ng/mL 的终浓度。 要制备 10 mM 全反式维甲酸储备浓度，请在 3.33 mL 无菌 DMSO 中复溶 10 mg 全反式维甲酸。将100μL等分试样储存在-20°C，并在细胞培养基中以1：100稀释以达到0.5μM的终浓度。 激活WNT信号通路诱导中胚层谱系为了将hiPSC分化为hiPSC来源的足细胞，在37°C和5%CO2下用包衣溶液涂覆适用于hiPSC培养的细胞培养板或烧瓶1小时。包衣溶液的总体积为每6孔培养板1 mL或每10 cm细胞培养板4 mL。 吸出培养基并用预热的 1x PBS 洗涤 hiPSC。吸出PBS并加入含有10μM Y27632的酶细胞分离溶液，总体积为每6孔培养板1mL或每10cm细胞培养板4mL。 将板放回培养箱中，在37°C和5%CO2下孵育4分钟。使用 1，000 μL 移液器冲洗板上的 hiPSC。将分离的细胞转移到锥形管中。 用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的新鲜预热 hiPSC 培养基清洗板。将洗涤介质汇集在锥形管中以中和解离试剂。在20°C下以200× g 离心5分钟。 吸出上清液，并用含有 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的 2 mL 新鲜预热 hiPSC 培养基重悬细胞沉淀。 计数细胞并接种 1 x 104 hiPSC/cm2。通过向各个方向搅拌三次来分布细胞。让hiPSC在37°C下用5%CO2 附着过夜而不会受到干扰。 第二天，用含有 1x B27 补充剂、1% 青霉素-链霉素、3 μM CHIR99021、50 ng/mL 活化素 A 和 10 μM ROCK 抑制剂 Y27632 的预热中胚层分化培养基替换培养基。 分化为肾单位祖细胞2 天后，将中胚层培养基更换为 2 mL 预热肾单位祖细胞分化培养基，每 6 孔培养板含有 1x B27 补充剂、1% 青霉素-链霉素、3 μM CHIR99021、50 ng/mL 活化素 A 和 50 ng/mL BMP7 或每 10 cm 细胞培养板 6 mL。在接下来的 14 天内每隔一天更换培养基。注意：肾单位祖细胞增殖，可以在肾单位祖细胞扩增培养基中分化7天后传代和冷冻。 为了分裂肾单位祖细胞，在37°C下用包衣溶液涂覆适用于hiPSC培养的细胞培养塑料1小时。 用肾单位祖细胞膨胀培养基替换包衣溶液。吸出培养基并用预热的 1x PBS 洗涤细胞。取出PBS并用1x胰蛋白酶-EDTA解离细胞。 在37°C和5%CO2下孵育5分钟。使用相衬显微镜监测细胞的分离。如有必要，轻拍塑料的侧面以将细胞从表面上分离。冲洗板上的细胞并转移到锥形管中。用相同体积的预热肾单位祖细胞扩增培养基作为解离试剂洗涤空烧瓶或板。 将洗涤介质池化在锥形管中。在20°C下以200×g离心5分钟。 吸出上清液，并用 2 mL 新鲜的预热肾单位祖细胞扩增培养基重悬细胞沉淀。计数细胞并接种每cm2的1.5 x 104个肾单位祖细胞以进行进一步分化。注意：要冷冻肾单位祖细胞，请将 1 x 106 个细胞重悬于 1 mL 冷无血清冷冻保存培养基中并转移到冷冻管中。在-80°C的冷冻容器中冷冻过夜，然后转移到液氮罐中长期储存。 将板放回培养箱中，并通过向各个方向搅拌三次均匀分布细胞。第二天更换培养基，更换为新鲜的预热肾单位祖细胞分化培养基。每隔一天更换培养基，直到细胞在肾单位祖细胞分化培养基中分化14天。 终末分化为hiPSC来源的足细胞吸出培养基，每 6 孔培养板加入 2 mL 预热足细胞分化培养基，其中含有 1x B27 补充剂、1% 青霉素-链霉素、3 μM CHIR99021、50 ng/mL 活化素 A、50 ng/mL BMP7、25 ng/μL VEGF 和 0.5 μM 全反式维甲酸，每 6 cm 细胞培养板。将板放回37°C和5%CO2的培养箱中。每隔一天用新鲜的预热足细胞分化培养基更换培养基4天。 为了在分化后保持hiPSC-足细胞在培养物中，每周两次用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和0.1%胰岛素-转铁蛋白-硒的足细胞维持培养基喂养细胞。注意：终末分化的hiPSC-足细胞不再增殖。但是，可以在细胞培养中将其保存长达4周。 冷冻肾单位祖细胞的解冻和扩增在37°C和5%CO2下用包衣溶液涂覆适用于hiPSC培养的新细胞培养塑料烧瓶1小时。用 5 mL 肾单位祖细胞扩增培养基替换包衣溶液。 准备一个 15 mL 锥形管，其中包含 7 mL 预热的肾单位祖细胞扩增培养基。将冷冻细胞在37°C的水浴中解冻而不移动约20秒。当一半的细胞解冻时，将冷冻管从水浴中取出，并残留一些冰。 用70%乙醇喷洒冷冻管，并放入生物安全柜中。用预热的肾单位祖细胞扩增培养基将解冻的细胞转移到锥形管中。使用 1，000 μL 移液器，让细胞非常缓慢地沿着管壁流下。 用 1 mL 肾单位祖细胞扩增培养基清洗空的冷冻管，以收集剩余的细胞并汇集在锥形管中。在20°C下以200× g 离心5分钟，并将细胞沉淀重悬于新鲜的预热肾单位祖细胞扩增培养基中。 将解冻的细胞转移到包被的烧瓶中，并在第二天将培养基更换为新鲜的预热肾单位祖细胞扩增培养基。在进一步分化之前，通过每隔一天更换培养基，让细胞在肾单位祖细胞扩增培养基中增殖，并从步骤8.3.5进行。 9. 通过免疫荧光染色表征hiPSC来源的足细胞 为了通过免疫荧光染色检查分化的足细胞的足细胞特异性标志物，将塑料盖玻片置于24孔板中，并在37°C和5%CO 2下涂覆250μL包被溶液1小时。 用 1 mL 预热的肾单位祖细胞扩增培养基替换包衣溶液。每 24 孔板接种 2.5 x 104 个解离的肾单位祖细胞。参见步骤8.3.2至8.3.4了解肾单位祖细胞的解离。 让细胞在37°C和5%CO 2下附着过夜而不会受到干扰。第二天用预热的肾单位祖细胞分化培养基替换培养基。 通过每隔一天更换培养基来完成分化，直到细胞在肾单位祖细胞分化培养基中分化总共 14 天，在足细胞分化培养基中再分化 5 天。 最终分化后，用 1 mL 预热的 1x PBS 洗涤细胞。在室温下用4%多聚甲醛固定hiPSC – 足细胞10分钟。用 1x PBS 洗涤固定细胞，并在室温下每孔用 200 μL 预孵育溶液封闭非特异性结合位点 1 小时。 在抗体稀释剂中稀释一抗突触素 （1：200）、鬼臼素 （1：100） 和肾单位 （1：25），并将 30 μL 一抗稀释液滴放在含有储水器的染色室中的干净塑料箔纸上。 将带有固定的hiPSC-足细胞的盖玻片倒置在稀释液中。在4°C孵育过夜。 第二天，用 1x PBS 洗涤 3 次，持续 5 分钟。在 1x PBS 中稀释二抗 （1：1，000），并将 30 μL 二抗稀释液的液滴放在箔纸上的干净点上。将盖玻片倒置放入稀释液中。 在室温下在黑暗中孵育1小时。孵育后，用1x PBS洗涤3次5分钟。将样品安装在含有DAPI的封片介质中的载玻片上。在室温和黑暗中干燥过夜。使用共聚焦显微镜对样品进行成像。