Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Victoria Rose; Janina M&#252;ller-Deile

doi:10.3791/65364

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Biologie

Generierung von patienteneigenen Podozyten aus Hautbiopsien

Published: May 26, 2023

doi:

10.3791/65364

Victoria Rose¹, Janina Müller-Deile^1,2

¹Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen,Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, ²Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD),University Hospital Erlangen

Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein zweistufiges Protokoll zur Erzeugung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten durch episomale Reprogrammierung in human-induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) und anschließende Differenzierung in Podozyten.

Abstract

Podozyten sind Epithelzellen, die auf der Harnseite der glomerulären Filtrationsbarriere sitzen und zur selektiven Filterfunktion des Glomerulus beitragen. Mutationen in Podozyten-spezifischen Genen können eine fokale segmentale Glomerulosklerose (FSGS) verursachen, und Podozyten sind auch bei vielen anderen primären und sekundären Nephropathien betroffen. Aufgrund ihrer differenzierten Natur sind primäre Zellkulturmodelle für Podozyten begrenzt. Daher werden üblicherweise bedingt immortalisierte Zellen verwendet. Diese bedingt immortalisierten Podozyten (ciPodocytes) weisen jedoch einige Einschränkungen auf: Die Zellen können sich in Kultur dedifferenzieren, insbesondere wenn sie eine Konfluenz erreichen, und mehrere Podozyten-spezifische Marker werden entweder nur geringfügig oder gar nicht exprimiert. Dies stellt den Einsatz von ciPodozyten und ihre Anwendbarkeit für physiologische, pathophysiologische und klinische Reichweiten in Frage. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung von humanen Podozyten – einschließlich patientenspezifischer Podozyten – aus einer Hautstanzbiopsie durch episomale Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in hiPS-Zellen und anschließender Differenzierung in Podozyten. Diese Podozyten ähneln in vivo Podozyten viel besser in Bezug auf morphologische Merkmale, wie die Entwicklung von Fußfortsätzen und die Expression des Podozyten-spezifischen Markers. Schließlich, aber wichtig, behalten diese Zellen die Mutationen der Patienten bei, was zu einem verbesserten Ex-vivo-Modell führt, um Podozytenerkrankungen und potenzielle therapeutische Substanzen in einem individualisierten Ansatz zu untersuchen.

Introduction

Podozyten sind spezialisierte, postmitotische Nierenepithelzellen, die zusammen mit der glomerulären Basalmembran (GBM), glomerulären Endothelzellen und Glykokalyx die glomeruläre Filtrationsbarriere der Niere bilden. Phänotypisch bestehen Podozyten aus einem Zellkörper und primären, Mikrotubuli-getriebenen Membranfortsätzen sowie sekundären Fortsätzen, die als Fußfortsätze bezeichnet^werden ^1,2. Die glomeruläre Filtrationsbarriere, die Urin aus dem Blut filtert, besteht aus gefenstertem Endothel, GBM und einer speziellen Art von interzellulärer Verbindung, die benachbarte Podozytenfußfortsätze verbindet, die als Schlitzdiaphragma von Podoctyes³ bezeichnet werden. Unter gesunden Bedingungen werden Proteine, die größer als Albumin sind, aufgrund ihrer Größe und Ladung von der Filtrationsbarriere zurückgehalten⁴.

Es ist bekannt, dass Mutationen in zytoskelett- oder podozytenspezifischen Genen sowie zirkulierende Faktoren, die die Podozyten-Signalwege beeinflussen, eine Podozyten-Effazion, -Ablösung oder -Apoptose induzieren, was zu Proteinurie und glomerulärer Sklerose führt. Insbesondere die Umlagerung des Zytoskeletts, Veränderungen der Podozytenpolarität oder die Schädigung von Fußfortsätzen mit einem damit verbundenen Verlust von Spaltverbindungen sind von zentraler Bedeutung⁵. Aufgrund ihres terminalen differenzierten Zustands können Podozyten nach der Ablösung des GBM kaum noch ersetzt werden. Wenn Podozyten jedoch an das GBM gebunden sind, können sie sich immer noch von der Auslöschung erholen und die interdigitierenden Fußfortsätze reformieren ^6,7,8. Ein besseres Verständnis der Ereignisse, die zu Podozytenschäden bei verschiedenen glomerulären Erkrankungen führen, könnte neue therapeutische Angriffspunkte liefern, die bei der Entwicklung von Behandlungen für diese Krankheiten helfen werden. Die Podozytenschädigung ist ein Kennzeichen verschiedener glomerulärer Erkrankungen, einschließlich der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS), der diabetischen Nephropathie, der Minimal-Change-Krankheit und der membranösen Glomerulonephropathie, die zuverlässige Podozyten-Ex-vivo-Modelle erfordern, um die pathologischen Mechanismen und potenziellen Behandlungsansätze für diese Erkrankungen zu untersuchen ^9,10. Podozyten können ex vivo durch klassische primäre Zellkultur untersucht werden, basierend auf der Isolierung von Glomeruli durch differentielle Siebung¹¹. Aufgrund des terminalen differenzierten Zustands mit begrenzter Proliferationskapazität verwenden die meisten Forscher jedoch Maus- oder humane ciPodozyten-Zelllinien, die temperaturempfindliche Varianten des SV40-Antigens large T exprimieren. Alternativ werden ciPodozyten aus transgenen Mäusen isoliert, die das SV40-Tag-immortalisierende Gen ^1,12 tragen.

CiPodozyten vermehren sich bei 33 °C, treten aber bei 37 °C in Wachstumsstopp ein und beginnen sich zu differenzieren^13,14. Es ist zu beachten, dass experimentelle Daten, die mit diesen Zellen gewonnen wurden, mit einer gewissen Vorsicht interpretiert werden sollten, da die Zellen durch eine unnatürliche Geninsertion erzeugt werden¹⁵. Da diese Zellen ein immortalisierendes Gen beherbergen, ist die zelluläre Physiologie aufgrund der fortschreitenden Proliferation verändert¹². Die mit diesem Ansatz erzeugten Podozytenzelllinien wurden kürzlich in Frage gestellt, da ciPodozyten von Mäusen, Menschen und Ratten weniger als 5 % Synaptopodin und Nephrin auf Proteinebene sowie NPHS1 und NPHS2 auf mRNA-Ebene im Vergleich zur glomerulären Expression^{exprimieren 16}. Darüber hinaus exprimieren die meisten Podozytenzelllinien kein Nephrin^17,18. Chittiprol et al. beschrieben auch einen signifikanten Unterschied in der Zellmotilität und der Reaktion auf Puromycin und Doxorubicin in ciPodozyten¹⁶. Podozyten können im Urin nach Ablösung vom GBM bei verschiedenen glomerulären Erkrankungen gefunden werden 19,20,21,22. Lebensfähige Podozyten im Urin können ex vivo für bis zu 2-3 Wochen kultiviert werden, aber die meisten Zellen durchlaufen eine Apoptose^23,24. Interessanterweise finden sich Podozyten nicht nur im Urin von Patienten mit glomerulärer Erkrankung, sondern auch im Urin gesunder Probanden, höchstwahrscheinlich wenn sie wieder seneszent sind und ein begrenztes Replikationspotenzial in Kultur^{haben 24}. Darüber hinaus ist die Anzahl der aus dem Urin stammenden Podozyten begrenzt, und die Zellen dedifferenzieren sich in der Kultur, zeigen weniger Fußfortsätze, verändern die Morphologie und haben vor allem eine begrenzte Proliferationskapazität. Die Expression von Podozyten-spezifischen Genen fehlt, verschwindet innerhalb weniger Wochen oder variiert zwischen diesen Zellklonen. Einige Zellen, die positiv für den Podozyten-spezifischen Marker waren, koexprimierten den Marker von tubulären Epithelzellen oder Myofibroblasten und Mesangialzellen, was auf eine Dedifferenzierung und/oder Transdifferenzierung der kultivierten Urinpodozyten hindeutet^24,25.

Kürzlich wurde die Erzeugung von ciPodocyte-Zelllinien beschrieben, die aus dem Urin von Patienten und gesunden Probanden durch Transduktion mit einem thermosensitiven SV40 large T-Antigen und hTERT gewonnen wurden²⁶. Die mRNA-Expression von Synaptopodin, Nestin und CD2-assoziiertem Protein wurde nachgewiesen, aber Podocin-mRNA fehlte in allen Klonen. Zusätzlich zu den Problemen mit den Podozyten im Urin enthalten diese Zellen auch das eingefügte immortalisierende Gen, was zu den oben diskutierten Nachteilen führt.

Im Gegensatz dazu haben humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) eine enorme Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und sich unter geeigneten Bedingungen in mehrere Zelltypen zu differenzieren. Es wurde bereits gezeigt, dass hiPS-Zellen als nahezu unbegrenzte Quelle von Podozyten dienen können^27,28.

In dieser Arbeit wird ein zweistufiges Protokoll zur Generierung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten von Hautstanzbiopsien mit anschließender episomaler Reprogrammierung in hiPS-Zellen und einer abschließenden Differenzierung in hiPSC-abgeleitete Podozyten beschrieben (Abbildung 1).

Abbildung 1: Protokoll zur Generierung patientenspezifischer hiPSC-abgeleiteter Podozyten. Grafische Übersicht über das Protokoll zur Generierung patientenspezifischer Podozyten aus dermalen Fibroblasten einer Hautbiopsie durch Reprogrammierung in hiPS-Zellen und Differenzierung in Podozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

In einem ersten Schritt wurden somatische dermale Fibroblasten aus einer Hautstanzbiopsie herausgewachsen und mittels einer integrationsfreien Methode durch Elektroporation mit Plasmiden, die die Transkriptionsfaktoren OCT3/4, KLF4, SOX2 und c-MYC exprimieren, zu hiPSCs reprogrammiert 29,30,31. Entstehende hiPSC-Kolonien wurden anschließend selektiert und erweitert. Die Differenzierung begann mit der Induktion der mesodermalen Linie durch Aktivierung des WNT-Signalwegs, gefolgt von der Bildung von Nephron-Vorläuferzellen, die noch in der Lage waren, sich zu vermehren. Schließlich wurden die Zellen in Podozyten differenziert. In diesem Verfahren modifizierten und kombinierten wir bereits veröffentlichte Protokolle zur episomalen Reprogrammierung zur Erzeugung von hiPS-Zellen von Bang et ^al.32 und Okita et al.33 sowie ein Protokoll zur Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten von Musah et al.28,34,35.

Tatsächlich wiesen die mit unserem Protokoll erzeugten Podozyten einen Phänotyp auf, der den Podozyten in vivo näher kam, was die Entwicklung eines ausgeprägten Netzwerks von primären und sekundären Fußfortsätzen und die Expression von Podozyten-spezifischen Markern wie Synaptopodin, Podocin und Nephrin betrifft. Durch die Verwendung von aus hiPS-Zellen gewonnenen Podozyten bleibt der genetische Hintergrund des Patienten während der Reprogrammierung und Differenzierung erhalten. Dies ermöglicht eine patientenspezifische Podozyten-Krankheitsmodellierung und die Entdeckung potenzieller therapeutischer Substanzen ex vivo in einer nahezu unbegrenzten Zellzahl. Darüber hinaus ist dieses Protokoll minimalinvasiv, kosteneffizient, ethisch vertretbar und kann neue Wege für die Arzneimittelentwicklung eröffnen.

Protocol

Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (251_18B) genehmigt und alle Patienten und Probanden gaben ihre schriftliche Zustimmung. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Für die Zusammensetzung aller hier verwendeten Medien und Lösungen siehe Tabelle 1. 1. Auswachsen von dermalen Fibroblasten aus einer Hautstanzbiopsie Die Hautstanzbiopsie wird in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml vorgewärmtem Fibroblastenmedium übertragen. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Hautstanzbiopsie dreimal mit 5 mL steriler, vorgewärmter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Übertragen Sie die Hautstanzbiopsie mit einer sterilen Pinzette auf eine 10 cm große Zellkulturplatte und schneiden Sie sie mit einem sterilen Skalpell der Breite nach in drei oder vier Stücke, wobei die Epidermis und die Dermis übrig bleiben. Übertragen Sie jedes Stück in eine sterile 35-mm-Zellkulturschale aus Kunststoff und drücken Sie es vorsichtig auf die Kulturschale. Entfernen Sie überschüssiges Medium um die Biopsiestücke herum. 5-10 Minuten trocknen lassen, bis die Flüssigkeit verdunstet ist und die Biopsie auf dem Zellkulturkunststoff befestigt ist. Geben Sie 1 ml Fibroblastenmedium mit einer 1.000-μl-Pipette um die Biopsie herum tropfenweise hinzu und füllen Sie vorsichtig bis zu einem Endvolumen von 3 ml auf. Kultivieren Sie 7 Tage lang bei 37 °C, 5% CO2 für 7 Tage, ohne zu füttern und das Gericht zu bewegen. Wechseln Sie das Medium vorsichtig zu einem frischen, vorgewärmten Fibroblastenmedium. Nach 7 Tagen können herausgewachsene spindelartige Fibroblasten um die Hautbiopsie herum mit einem Phasenkontrastmikroskop überwacht werden36.Anmerkungen: Wenn herausgewachsene Fibroblasten den Rand der Schale erreichen, fahren Sie erneut mit Schritt 1.3 fort, um eine weitere Charge von Fibroblasten zu erzeugen. Zur Expansion der herausgewachsenen Fibroblasten mit 2 mL vorgewärmtem 1x PBS waschen, die Fibroblasten mit 1 mL 1x Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) dissoziieren und 5 min bei 37 °C, 5%CO2 inkubieren. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen und waschen Sie die Zellkulturschale mit 2 ml frischem, vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Das Waschmedium wird im Röhrchen gesammelt, um das Dissoziationsmittel zu neutralisieren, und bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml frischem, vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer oder einem automatisierten Zellzähler unter Verwendung von Trypanblau und säen Sie 2,5 x 10 3 bis 5 x 103 Fibroblasten procm2 in frische Zellkulturflaschen. Stellen Sie die Kolben wieder in den Inkubator und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig, indem Sie die Kolben dreimal in jede Richtung bewegen. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch frisches, vorgewärmtes Fibroblastenmedium. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche und teilen Sie es, wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben. 2. Einfrieren von dermalen Fibroblasten Um die Fibroblasten einzufrieren, waschen Sie sie mit 5 ml vorgewärmtem 1x PBS. Das PBS wird abgesaugt und die Fibroblasten mit 4 mL 1x Trypsin-EDTA dissoziiert. Stellen Sie den Kolben wieder in den Inkubator und inkubieren Sie ihn 5-7 Minuten lang bei 37 °C bei 5% CO2. Überwachen Sie die Ablösung mit einem Phasenkontrastmikroskop und klopfen Sie gegen die Seite des Kolbens, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie den Zellkulturkolben mit 5 ml frischem, vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Das Waschmedium im konischen Röhrchen sammeln und bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 ml frischem, vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie 1 x 106 Zellen in ein neues konisches Röhrchen. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 ml kaltem Fibroblasten-Gefriermedium, das zu 90 % aus fötalem Kälberserum und zu 10 % aus Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht. In ein Kryogefäß umfüllen, in einen Gefrierbehälter geben und über Nacht bei -80 °C einfrieren. Für die Langzeitlagerung legen Sie das Kryomaterial am nächsten Tag in einen Flüssigstickstofftank. 3. Episomale Reprogrammierung von Fibroblasten zur Erzeugung von hiPS-Zellen Für die episomale Reprogrammierung werden 1,5 x 106 Fibroblasten aus Passage 4 bis 8 verwendet. Um diese Zellzahl zu erreichen, verwenden Sie zwei bis drei 250-ml-Kolben mit einer Konfluenz von etwa 70 %. Am Tag vor der Reprogrammierung werden die Fibroblasten im Verhältnis 1:2 gespalten, um ihren proliferativen Zustand sicherzustellen. Saugen Sie daher das Medium ab und waschen Sie die Kolben mit 5 mL vorgewärmtem 1x PBS pro Kolben. Das PBS wird abgesaugt und die Fibroblasten mit 4 mL 1x Trypsin-EDTA dissoziiert. Stellen Sie die Kolben wieder in den Inkubator und inkubieren Sie sie 5-7 Minuten lang bei 37 °C und 5% CO2. Überwachen Sie die Ablösung mit einem Phasenkontrastmikroskop und klopfen Sie gegen die Seite des Kolbens, um die Zellen von der Kunststoffoberfläche zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und waschen Sie die Zellkulturflaschen mit 5 ml frischem, vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Das Waschmedium im konischen Röhrchen sammeln und bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 6 ml frischem, vorgewärmtem Fibroblastenmedium. Bereiten Sie sechs neue Zellkulturflaschen vor, indem Sie 5 ml frisches, vorgewärmtes Fibroblastenmedium pro Flasche hinzufügen. Geben Sie 1 ml Fibroblastenzellsuspension in jeden Kolben. Stellen Sie die Kolben wieder in den Inkubator und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig, indem Sie die Kolben dreimal in jede Richtung bewegen. Für die episomale Reprogrammierung werden zwei 10-cm-Zellkulturplatten, die für die hiPSC-Kultur geeignet sind, mit 4 ml kalter Beschichtungslösung pro Platte beschichtet. Die Platten 1 h bei 37 °C inkubieren.HINWEIS: Für die Kultivierung von hiPSCs sind verschiedene Zellkulturkunststoffe und eine zusätzliche Beschichtung der extrazellulären Matrix erforderlich (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie die Medien aus den Fibroblasten und waschen Sie sie mit 10 ml vorgewärmtem 1x PBS pro Kolben. Das PBS wird abgesaugt und die Fibroblasten mit 4 mL 1x Trypsin-EDTA pro Kolben dissoziiert, indem 5-7 min bei 37 °C inkubiert werden. Überwachen Sie die Ablösung mit einem Phasenkontrastmikroskop und klopfen Sie bei Bedarf gegen die Seite des Kolbens, um die Zellen von der Kunststoffoberfläche zu lösen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Waschen Sie die leeren Kolben mit 6 ml vorgewärmtem Fibroblastenmedium, um die verbleibenden Zellen aufzufangen und sich im konischen Röhrchen zu sammeln. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml frischem, vorgewärmtem 1x PBS. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie 1,5 x 106 Fibroblasten in ein neues konisches Röhrchen. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml Elektroporationsmedium und zentrifugieren Sie erneut. In der Zwischenzeit wird die Beschichtungslösung von den beschichteten 10-cm-Zellkulturplatten abgesaugt und 7 ml vorgewärmtes Fibroblastenmedium hinzugefügt. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Zellpellet in Elektroporationsmedium mit einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen in 250 μL resuspendiert. Die 250 μL Zellsuspension wird in eine Elektroporationsküvette mit einem Spaltabstand von 4 mm überführt (siehe Materialtabelle). Stellen Sie eine Plasmid-Transfektionsmischung her, indem Sie 4 μg jedes Plasmids (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) zu einem Gesamtvolumen von 50 μl Elektroporationsmedium hinzufügen. In die Küvette geben und durch leichtes Schnippen mischen. Elektroporat mit einem Impuls bei 280 V. Schneiden Sie mit einer sterilen Schere eine Pipettenspitze ab und übertragen Sie 125 μL der elektroporierten Fibroblasten auf jede der vorbereiteten 10 cm Zellkulturplatten. Verteilen Sie die Zellen, indem Sie die Platten dreimal in alle Richtungen bewegen, und legen Sie sie wieder in den Inkubator. Über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2 ungestört inkubieren. Um abgestorbene Zellen zu entfernen, ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch 7 ml frisches, vorgewärmtes Fibroblastenmedium. Wechseln Sie das Medium 2 Tage nach der Elektroporation in hiPSC-Nährmedium und ersetzen Sie es in den nächsten 20 Tagen jeden zweiten Tag. 4. Selektion, Expansion und Qualitätskontrolle der erzeugten hiPSCs Überwachen Sie die Zellen täglich für mindestens 20 Tage mit einem Phasenkontrastmikroskop mit einem 10- oder 20-fachen Objektiv, um die Bildung von hiPSC-Kolonien nach der Elektroporation zu beobachten. Wenn hiPSC-Kolonien einen Durchmesser von etwa 300 μm mit ausgeprägten Rändern haben und die hiPSCs ein hohes Zellkern-zu-Körper-Verhältnis aufweisen, sind die hiPSC-Kolonien bereit für die Selektion durch Picking (Abbildung 2B, C und Abbildung 3). Vor der Ernte wird eine für die hiPSC-Kultur geeignete 96-Well-Platte mit 100 μl Beschichtungslösung pro Well beschichtet und 1 h bei 37 °C inkubiert. Markieren Sie während der Inkubation mit einem Stift die interessierenden Kolonien am Boden der Zellkulturschale. Für die endgültige Präparation der 96-Well-Platte wird die Beschichtungslösung entfernt und 100 μl vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 in jede Vertiefung gegeben. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem 1x PBS und fügen Sie frisches, vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium hinzu, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält, bevor Sie abgestorbene Zellen entfernen. Um hiPSC-Kolonien zu pflücken, verwenden Sie eine Messnadel und teilen Sie die hiPSC-Kolonien in kleine Stücke, indem Sie ein Gitter in jede Kolonie zeichnen. Überprüfen Sie mit einem Phasenkontrastmikroskop, ob die Kolonien erfolgreich in Stücke geteilt wurden. Übertragen Sie sie mit einer 100-μl-Pipette auf die vorbereitete 96-Well-Platte. Halten Sie die Pipette aufrecht über die Kolonie, ohne die Zellen zu berühren, um Kratzer und den Verlust der Kolonie zu vermeiden. Legen Sie die 96-Well-Platte bei 37 °C mit 5% CO2 in den Inkubator und lassen Sie die Zellen über Nacht ungestört ansetzen. Bewahren Sie das Geschirr mit der Mischung aus Fibroblasten und hiPSC auf, falls die Ernte nicht erfolgreich ist. Entfernen Sie daher den ROCK-Inhibitor Y27632, indem Sie das Medium auf hiPSC-Nährmedium umstellen und die Platten wieder in den Inkubator legen. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium der 96-Well-Platte auf 200 μl frisches hiPSC-Nährmedium und wechseln Sie es jeden zweiten Tag. Überwachen Sie die 96-Well-Platte am nächsten Tag und markieren Sie die Wells mit erfolgreich gepflückten Klonen.HINWEIS: Wenn die ausgewählten hiPSC-Klone nach dem ersten Versuch nicht vollständig selektiert sind und die Fibroblasten in der Vertiefung zu finden sind, wiederholen Sie die Entnahme aus der 96er-Vertiefung oder kratzen Sie die Fibroblasten von der Platte. 5. Erweiterung ausgewählter hiPSC-Klone Überwachen Sie die hiPSC-Klone mit einem Phasenkontrastmikroskop. Wenn die ausgewählten hiPS-Zellen eine Konfluenz von etwa 70% erreichen, sind die hiPSC-Klone bereit für die Expansion. Beschichten Sie eine 48-Well-Platte, die für die hiPSC-Kultur geeignet ist, mit 250 μl Beschichtungslösung pro Well für 1 h bei 37 °C. Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch 200 μl frisches, vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632. Um die hiPSCs von der 96-Well-Platte zu lösen, kratzen Sie die Kunststoffoberfläche mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze ab. Übertragen Sie die abgelösten hiPSCs von der 96-Well-Platte auf eine 48-Well-Platte. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag zu frischem, vorgewärmtem hiPSC-Nährmedium, um abgestorbene Zellen und den ROCK-Inhibitor Y27632 zu entfernen. Wenn die hiPSC-Klone eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen, übertragen Sie die hiPSCs in eine 24-Well-Platte. Beschichten Sie daher eine für die hiPSC-Kultur geeignete 24-Well-Platte mit 400 μL Beschichtungslösung pro Well für 1 h bei 37 °C. Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch 400 μl frisches, vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632. Saugen Sie das Medium aus den 48 Vertiefungen ab und waschen Sie es mit 500 μL vorgewärmtem 1x PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 100 μl enzymatische Zellablöselösung, die 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält, und inkubieren Sie es 4 Minuten lang bei 37 °C. Spülen Sie die hiPSCs mit einer 1.000-μl-Pipette von der Platte. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die leere 48-Well-Platte mit hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält, und sammeln Sie sich im konischen Röhrchen. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die hiPSCs in 1 ml hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält, und überführen Sie ihn auf eine 24-Well-Platte. Legen Sie die Platte bei 37 °C bei 5 % CO2 in den Inkubator und verteilen Sie die Zellen durch dreimaliges Rühren der Platte in alle Richtungen. Lassen Sie die Zellen über Nacht ungestört anheften. Am nächsten Tag wird das Medium auf hiPSC-Nährmedium ohne ROCK-Inhibitor Y27632 umgestellt.HINWEIS: Wenn hiPSC-Klone eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen, übertragen Sie die hiPSCs auf eine 12-Well-Platte, indem Sie die Schritte 5.4 bis 5.7 mit erhöhtem Volumen, das für ein 12-Well-Format geeignet ist, wiederholen. Wenn die hiPSCs aus der 12-Well-Platte eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen, übertragen Sie die hiPSC-Klone auf eine 6-Well-Platte mit erhöhtem Volumen für ein 6-Well-Format. 6. Einfrieren ausgewählter hiPSC-Klone Um ausgewählte hiPSC-Klone einzufrieren, saugen Sie das Medium von einer 6-Well-Platte ab. Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS. Die hiPS-Zellen werden mit 1 ml enzymatischer Zellablösung, die 10 μM Y27632 enthält, abgesaugt und dissoziiert. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator und inkubieren Sie sie 4 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2. Spülen Sie die hiPSCs mit einer 1.000-μl-Pipette von der Platte ab und übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit 2 ml frischem, vorgewärmtem hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält. Im konischen Röhrchen ansammeln und bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 ml frischem, vorgewärmtem hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie 1 x 106 Zellen in ein neues konisches Röhrchen. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml kaltem, serumfreiem hiPSC-Gefriermedium und frieren Sie es in einem Kryopapier unter Verwendung eines Gefrierbehälters über Nacht bei -80 °C ein. Für die Langzeitlagerung legen Sie das Kryoial am nächsten Tag in einen Flüssigstickstofftank. 7. HiPSC-Qualitätskontrolle Charakterisierung der hiPSC-MorphologieÜberprüfen Sie die charakteristische hiPSC-Morphologie mit einem Phasenkontrastmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Nach der Reprogrammierung ändert sich die Zellmorphologie von langen, spindelartigen Fibroblasten zu kleinen, runden hiPSCs, die ein hohes Zellkern-zu-Körper-Verhältnis aufweisen, das in Kolonien mit ausgeprägten Rändern wächst (Abbildung 2C). Wenn die hiPSC-Kolonien zu dicht wachsen und es zu einer spontanen Differenzierung kommt, kratzen Sie die differenzierten Teile mit einer Pipettenspitze von der Platte ab (Abbildung 3). Da hiPS-Zellen eine hohe Proliferationsrate haben, füttern Sie die hiPSC-Kulturen täglich mit frischem, vorgewärmtem hiPSC-Nährmedium. Charakterisierung von Pluripotenzmarkern durch ImmunfluoreszenzfärbungUm die erzeugten hiPSCs mittels Immunfluoreszenzfärbung auf Pluripotenzmarker zu überprüfen, legen Sie Kunststoffdeckgläser in eine 24-Well-Platte und beschichten Sie sie 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit 250 μl Beschichtungslösung. Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch 1 ml vorgewärmtes hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält. Seed 1,9 x 104 dissoziierte hiPSCs pro 24-Well. Lassen Sie die hiPSCs über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 ungestört anlagern. Siehe Schritte 5.4 bis 5.6 zur Dissoziation der hiPS-Zellen. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch hiPSC-Nährmedium ohne ROCK-Inhibitor Y27632. Zur Färbung waschen Sie die Zellen mit 1 mL vorgewärmtem 1x PBS und fixieren anschließend die hiPSCs mit 4% Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die fixierten hiPSCs mit 1x PBS und blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 200 μL Vorinkubationslösung pro Well für 1 h bei Raumtemperatur. Primäre Antikörper Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) in Antikörperverdünnungsmittel verdünnen. Reinigen Sie eine Plastikfolie mit 70% Ethanol und legen Sie sie in eine Färbekammer, die mit einem Wasserreservoir gefüllt ist. Tröpfchen mit 30 μl primären Antikörperverdünnungen auf die Folie geben. Die fixierten Proben werden verkehrt herum in die Verdünnung gelegt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Proben am nächsten Tag dreimal mit 1x PBS für 5 min und geben Sie 30 μL Tröpfchen sekundärer Antikörperverdünnungen (1:1.000) auf saubere Stellen auf der Folie. Legen Sie die Deckschienen verkehrt herum in die Verdünnung. 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation dreimal mit 1x PBS für 5 min waschen. Montieren Sie die Proben auf Objektträger in das Eindeckmedium, das DAPI enthält. Lassen Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur und im Dunkeln trocknen und bilden Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop ab (Abbildung 4). Ausschluss von Bakterien- und MykoplasmenkontaminationUm eine Kontamination mit Bakterien auszuschließen, werden 500 μl dissoziierte hiPSCs auf 5 ml vorgewärmtes Luria-Bertani (LB)-Medium übertragen. Siehe Schritte 5.4 bis 5.6 zur Dissoziation der hiPS-Zellen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Wenn das LB-Medium trüb erscheint, liegt wahrscheinlich eine Kontamination mit Bakterien vor. Verwerfen Sie die Zellen. Um eine Mykoplasmenkontamination auszuschließen, wird Medium, das 2 Tage lang nicht ausgetauscht wurde, aus 6 Vertiefungen mit etwa 90 % konfluenten hiPS-Zellen entnommen. Verwenden Sie die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), um eine Mykoplasmenkontamination nachzuweisen. Zu diesem Zweck gibt es viele kommerzielle Mykoplasmen-Nachweiskits. 8. Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten Aufbereitung und Lagerung von WachstumsfaktorenZur Herstellung einer Stammkonzentration von 10 mM Y27632 werden 10 mg Y27632 (Molekulargewicht von 320,26 g/mol) in 3,12 ml sterilem Wasser rekonstituiert. 100 μL Aliquots bei -20 °C lagern und 1:1.000 in Zellkulturmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erreichen. Zur Herstellung einer Stammkonzentration von 30 mM CHIR99021 werden 5 mg CHIR99021 (Molekulargewicht von 465,34 g/mol) in 358,2 μl sterilem DMSO rekonstituiert. 50 μL Aliquots bei -20 °C lagern und 1:10.000 in Zellkulturmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 3 μM zu erreichen. Um eine Stammkonzentration von 100 μg/ml Activin A herzustellen, rekonstituieren Sie 100 μg Activin A in 1 ml 1x PBS, das 0,1 % Kälberserumalbumin (BSA) enthält. 100 μL Aliquots bei -20 °C lagern und 1:2.000 in Zellkulturmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 50 ng/ml zu erreichen. Zur Herstellung einer Stammkonzentration von 100 μg/ml knochenmorphogenem Protein 7 (BMP7) werden 100 μg BMP7 in 1 ml sterilem Wasser mit 0,1 % BSA rekonstituiert. 100 μL Aliquots bei -20 °C lagern und 1:2.000 in Zellkulturmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 50 ng/ml zu erreichen. Um eine Stammkonzentration von 100 μg/ml vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF) herzustellen, rekonstituieren Sie 100 μg VEGF in 1 ml sterilem Wasser. 100 μL Aliquots bei -20 °C lagern und 1:4.000 in Zellkulturmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 25 ng/ml zu erreichen. Zur Herstellung einer Stammkonzentration von 10 mM all-trans-Retinsäure werden 10 mg all-trans-Retinsäure in 3,33 ml sterilem DMSO rekonstituiert. 100 μL Aliquots bei -20 °C lagern und 1:100 in Zellkulturmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 0,5 μM zu erreichen. Aktivierung des WNT-Signalwegs zur Induktion der Mesoderm-AbstammungZur Differenzierung von hiPS-Zellen in hiPSC-abgeleitete Podozyten werden Zellkulturplatten oder -kolben, die für die hiPSC-Kultur geeignet sind, 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 mit Beschichtungslösung bestreichen. Das Gesamtvolumen der Beschichtungslösung beträgt 1 ml pro 6-Well-Kulturplatte oder 4 ml pro 10-cm-Zellkulturplatte. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie die hiPSCs mit vorgewärmtem 1x PBS. Das PBS wird abgesaugt und eine enzymatische Zellablösungslösung mit 10 μM Y27632 mit einem Gesamtvolumen von 1 ml pro 6-Well-Kulturplatte oder 4 ml pro 10 cm Zellkulturplatte hinzugefügt. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator und inkubieren Sie sie 4 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2. Spülen Sie die hiPSCs mit einer 1.000-μl-Pipette von der Platte. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in ein konisches Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit frischem, vorgewärmtem hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält. Sammeln Sie das Waschmedium im konischen Rohr, um das Dissoziationsreagenz zu neutralisieren. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 ml frischem, vorgewärmtem hiPSC-Nährmedium, das 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält. Zählen Sie die Zellen und säen Sie 1 x 104 hiPSCs/cm2. Verteilen Sie die Zellen, indem Sie dreimal in alle Richtungen rühren. Lassen Sie die hiPSCs über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2 ungestört anlagern. Am nächsten Tag wird das Medium durch 2 ml vorgewärmtes Mesodermdifferenzierungsmedium ersetzt, das 1x B27-Supplement, 1 % Penicillin-Streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml Activin A und 10 μM ROCK-Inhibitor Y27632 enthält. Differenzierung in Nephron-VorläuferzellenWechseln Sie nach 2 Tagen das Mesodermmedium auf 2 ml vorgewärmtes Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium, das 1x B27-Supplement, 1 % Penicillin-Streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml Activin A und 50 ng/ml BMP7 pro 6-Well-Kulturplatte oder 6 ml pro 10-cm-Zellkulturplatte enthält. Wechseln Sie das Medium in den nächsten 14 Tagen jeden zweiten Tag.HINWEIS: Nephron-Vorläuferzellen vermehren sich und können nach 7 Tagen Differenzierung in Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium durchgelassen und eingefroren werden. Um die Nephron-Vorläuferzellen zu teilen, werden die für die hiPSC-Kultur geeigneten Zellkulturkunststoffe für 1 h bei 37 °C mit Beschichtungslösung beschichtet. Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium. Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem 1x PBS. Entfernen Sie das PBS und dissoziieren Sie die Zellen mit 1x Trypsin-EDTA. 5 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. Überwachen Sie die Ablösung der Zellen mit einem Phasenkontrastmikroskop. Klopfen Sie bei Bedarf gegen die Seite des Kunststoffs, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen. Spülen Sie die Zellen von der Platte ab und geben Sie sie in ein konisches Röhrchen. Waschen Sie den leeren Kolben oder die leere Platte mit dem gleichen Volumen des vorgewärmten Nephron-Vorläufer-Expansionsmediums wie das Dissoziationsreagenz. Sammeln Sie das Waschmedium im konischen Rohr. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet mit 2 ml frischem, vorgewärmtem Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium. Zählen Sie die Zellen und säen Sie 1,5 x 104 Nephron-Vorläuferzellen procm2 zur weiteren Differenzierung.Anmerkungen: Um die Nephron-Vorläuferzellen einzufrieren, resuspendieren Sie 1 x 106 Zellen in 1 ml kaltem, serumfreiem Kryokonservierungsmedium und übertragen Sie sie in ein Kryoprotein. In einem Gefrierbehälter bei -80 °C über Nacht einfrieren und zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank umfüllen. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig durch dreimaliges Rühren in alle Richtungen. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag zu einem frischen, vorgewärmten Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen 14 Tage lang im Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium differenziert sind. Terminale Differenzierung in hiPSC-abgeleitete PodozytenSaugen Sie das Medium an und fügen Sie 2 ml vorgewärmtes Podozytendifferenzierungsmedium hinzu, das 1x B27-Ergänzung, 1 % Penicillin-Streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml Activin A, 50 ng/ml BMP7, 25 ng/μl VEGF und 0,5 μM all-trans-Retinsäure pro 6-Well-Kulturplatte oder 6 ml pro 10-cm-Zellkulturplatte enthält. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium 4 Tage lang jeden zweiten Tag mit frischem, vorgewärmtem Podozyten-Differenzierungsmedium. Um die hiPSC-Podozyten nach der Differenzierung in Kultur zu halten, werden die Zellen zweimal wöchentlich mit Podozyten-Erhaltungsmedium gefüttert, das 10 % fetales Kälberserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,1 % Insulin-Transferrin-Selen enthält.HINWEIS: Terminale differenzierte hiPSC-Podozyten proliferieren nicht mehr. Es ist jedoch möglich, sie bis zu 4 Wochen in Zellkultur zu halten. Auftauen und Expansion von gefrorenen Nephron-VorläuferzellenBeschichten Sie einen neuen Zellkultur-Kunststoffkolben, der für die hiPSC-Kultur geeignet ist, 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit Beschichtungslösung. Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch 5 ml Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium. Bereiten Sie ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 7 ml vorgewärmtem Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium vor. Tauen Sie die gefrorenen Zellen bei 37 °C im Wasserbad ohne Bewegung für ca. 20 s auf. Nehmen Sie das Kryoöl aus dem Wasserbad, wenn die Hälfte der Zellen aufgetaut ist und etwas Eis übrig ist. Besprühen Sie das Kryomaterial mit 70%igem Ethanol und stellen Sie es in eine Biosicherheitswerkbank. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen mit dem vorgewärmten Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium in das konische Röhrchen. Verwenden Sie eine 1.000-μl-Pipette und lassen Sie die Zellen sehr langsam an der Wand des Röhrchens herunterlaufen. Waschen Sie das leere Kryovolumen mit 1 ml Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und sich im konischen Röhrchen zu sammeln. Bei 200 x g für 5 min bei 20 °C zentrifugieren und das Zellpellet in frischem, vorgewärmtem Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium resuspendieren. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in den beschichteten Kolben und wechseln Sie das Medium am nächsten Tag zu einem frischen, vorgewärmten Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium. Vor der weiteren Differenzierung lassen Sie die Zellen im Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium proliferieren, indem Sie das Medium jeden zweiten Tag wechseln, und fahren Sie mit Schritt 8.3.5 fort. 9. Charakterisierung von hiPSC-abgeleiteten Podozyten durch Immunfluoreszenzfärbung Um die differenzierten Podozyten mittels Immunfluoreszenzfärbung auf den Podozyten-spezifischen Marker zu überprüfen, legen Sie Kunststoffdeckgläser in eine 24-Well-Platte und beschichten Sie sie 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 mit 250 μl Beschichtungslösung. Ersetzen Sie die Beschichtungslösung durch 1 ml vorgewärmtes Nephron-Vorläufer-Expansionsmedium. Samen: 2,5 x 104 dissoziierte Nephron-Vorläuferzellen pro 24-Well-Platte. Siehe Schritte 8.3.2 bis 8.3.4 zur Dissoziation von Nephron-Vorläuferzellen. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 ungestört anlagern. Ersetzen Sie das Medium am nächsten Tag durch vorgewärmtes Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium. Beenden Sie die Differenzierung, indem Sie das Medium jeden zweiten Tag wechseln, bis die Zellen insgesamt 14 Tage im Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium und weitere 5 Tage im Podozyten-Differenzierungsmedium differenziert sind. Nach der endgültigen Differenzierung waschen Sie die Zellen mit 1 ml vorgewärmtem 1x PBS. Die hiPSC-Podozyten werden mit 4%igem Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Waschen Sie die fixierten Zellen mit 1x PBS und blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen mit 200 μL Vorinkubationslösung pro Well für 1 h bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie die primären Antikörper Synaptopodin (1:200), Podocin (1:100) und Nephrin (1:25) in Antikörperverdünnungsmittel und geben Sie Tröpfchen mit 30 μl primärer Antikörperverdünnung auf eine saubere Plastikfolie in eine Färbekammer, die ein Wasserreservoir enthält. Deckobjektträger mit fixierten hiPSC-Podozyten verkehrt herum in die Verdünnung legen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Am nächsten Tag dreimal mit 1x PBS für 5 min waschen. Verdünnen Sie die Sekundärantikörper (1:1.000) in 1x PBS und geben Sie Tröpfchen mit 30 μL Sekundärantikörperverdünnung auf saubere Stellen auf der Folie. Legen Sie die Deckschienen verkehrt herum in die Verdünnung. 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nach der Inkubation dreimal mit 1x PBS für 5 min waschen. Montieren Sie die Proben auf Objektträger in einem Eindeckmedium, das DAPI enthält. Über Nacht bei Raumtemperatur und im Dunkeln trocknen lassen. Bildgeben Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop ab.

Representative Results

Mit diesem Schritt-für-Schritt-Protokoll, das episomale Reprogrammierung und Differenzierung kombiniert, ist es möglich, Podozyten zu erzeugen, die die Mutation eines Patienten in einem Podozyten-relevanten Gen tragen. Dies ermöglicht die Analyse krankheitsspezifischer Podozytenveränderungen ex vivo. Der genetische Hintergrund des Patienten bleibt während des Protokolls in allen verschiedenen Zellstadien erhalten. Darüber hinaus kann die Begrenzung der unzureichenden Zellzahl von terminal differenzierten, nicht-proliferierenden Podozyten durch die Verwendung von hiPSC-abgeleiteten Podozyten überwunden werden. Obwohl es mehrere Monate dauert, bis aus herausgewachsenen dermalen Fibroblasten durch Reprogrammierung in hiPS-Zellen und anschließende Differenzierung in Podozyten hiPS-Podozyten erzeugt werden, ist es möglich, Zellen in drei verschiedenen Schritten des Protokolls einzufrieren (Abbildung 2). Das Einfrieren von Fibroblasten, hiPS-Zellen und Nephron-Vorläuferzellen ist nach Differenzierung in Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium für 7 Tage möglich. Daher ist die Generierung von funktionierenden Zellbanken und groß angelegten Experimenten möglich. Abbildung 2: Einzelne Schritte des Protokolls durch ein Phasenkontrastmikroskop. (A) Ausgewachsene dermale Fibroblasten. (B) hiPSC-Koloniebildung nach Reprogrammierung. (C) Ausgewählte hiPSC-Kultur. (D) Mesodermzellen nach 2 Tagen Differenzierung. (E) Nephron-Vorläuferzellen nach 14-tägiger Differenzierung in Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium. (F) Terminale differenzierte hiPSC-abgeleitete Podozyten. Maßstabsbalken stellen 300 μm (A,B,D-F) und 150 μm (C) dar. Die Schneeflocke hebt mögliche Gefrierschritte hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Da die generierten hiPSC-abgeleiteten Podozyten ein langes Protokoll mit drastischen Veränderungen in Bezug auf Zelltyp und Morphologie durchlaufen, ist eine Zellcharakterisierung obligatorisch. Die Zellmorphologie, wie Größe und Form der Zelle, sowie das Wachstumsverhalten können mit einem Phasenkontrastmikroskop überwacht werden. Fibroblasten weisen einen langen, spindelförmigen Phänotyp mit einer Größe von 150 μm bis 300 μm auf (Abbildung 2A). Nach der Reprogrammierung entstehen Kolonien mit 50 μm kleinen hiPSCs. Diese Kolonien weisen ausgeprägte Ränder und hiPS-Zellen auf, die sich durch ein hohes Zellkern-zu-Körper-Verhältnis und eine erhöhte Proliferationsrate auszeichnen (Abbildung 2C). Da es sich bei Podozyten um terminal differenzierte Zellen handelt, nimmt die Proliferationsrate mit fortschreitender Differenzierung ab, und die Zellmorphologie ändert sich zu 300 μm großen sternförmigen Podozyten mit prominenten Fußfortsätzen (Abbildung 2F). Die Konfluenz ist ein kritischer Punkt der hiPSC-Kultur, und eine spontane Differenzierung kann auftreten, wenn die Kolonien zu dicht wachsen (Abbildung 3). Diese Kolonien müssen vor dem Durchgang entfernt werden, indem die betroffenen Teile der Kulturschale abgekratzt werden. Abbildung 3: Beispiele für hiPS-Zellen unterschiedlicher Qualität. Phasenkontrastbilder von erfolgreich (A) reprogrammierten hiPSC-Kolonien und (B) selektierten hiPS-Kolonien, sowie (C) spontaner Differenzierung, (D,E) Nicht-hiPSC-Kolonien und (F) einer zu dichten hiPSC-Kultur. Maßstabsbalken stellen 300 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Die verschiedenen Zelltypen dieses Protokolls müssen hinsichtlich der Expression eines bestimmten Markers validiert werden. Nach der Reprogrammierung erlangen hiPSCs ihre Pluripotenzkapazität zurück und exprimieren Proliferations- und Pluripotenzmarker wie SSEA4, OCT3/4 und Ki67 (Abbildung 4)38,39,40. Es ist bekannt, dass die Reprogrammierung sowie die langwierige Kultur von hiPS-Zellen und Differenzierung zu einem abnormen Karyotyp führen bzw. Mutationen induzieren können41. Daher sollte der genetische Hintergrund der kultivierten Zellen über die Zeit und an verschiedenen Passagen durch g-Banding und Sequenzierung des gesamten Exoms überwacht werden. Abbildung 4: Charakterisierung der erzeugten hiPS-Zellen mittels Immunfluoreszenzfärbung. Charakterisierung der generierten hiPSCs durch Färbung für (A) den proliferativen Marker Ki67, sowie die Pluripotenzmarker (B) OCT3/4 und (C) SSEA4. Maßstabsbalken stellen 100 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Morphologisch erscheinen hiPSC-abgeleitete Podozyten sternförmig und weisen im Vergleich zu ciPodozyten ein ausgeprägtes Netzwerk langer primärer und sekundärer Fußfortsätze auf (Abbildung 5). Von HiPSC abgeleitete Podozyten exprimieren Podozyten-spezifische Markerproteine wie Synaptopodin, Nephrin und Podocin (Abbildung 6A-C)42. Abbildung 5: Morphologie von hiPSC-abgeleiteten Podozyten im Vergleich zu ciPodozyten. Vergleich von (A,B) hiPSC-abgeleiteten Podozyten eines gesunden Spenders mit (C,D) ciPodozyten hinsichtlich Zellmorphologie und Filopodien unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskops (A,C) und eines Rasterelektronenmikroskops (B,D). Maßstabsbalken stellen 150 μm (A,C) und 20 μm (B,D) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Daher ermöglicht der Vergleich von hiPSC-abgeleiteten Podozyten nicht nur von gesunden Spendern, sondern auch von Patienten mit Mutationen in Podozyten-spezifischen Genen eine individualisierte Charakterisierung der Mutation des Patienten ex vivo. Abbildung 6: Charakterisierung eines Podozyten-spezifischen Markers in hiPSC-abgeleiteten Podozyten und ciPodozyten. Vergleich von (A-C) hiPSC-abgeleiteten Podozyten eines gesunden Spenders mit (D-F) ciPodozyten hinsichtlich der Podozyten-spezifischen Markerproteine Synaptopodin (A,D), Nephrin (B,E) und Podocin (C,F). Maßstabsbalken stellen 50 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Tabelle 1. Zusammensetzung aller in der Studie verwendeten Zellkulturmedien und -lösungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Dieses auf Zellkulturen basierende Protokoll kombiniert die episomale Reprogrammierung von humanen dermalen Fibroblasten in patientenspezifische hiPS-Zellen und die anschließende Differenzierung in aus hiPS-Zellen stammende Podozyten. Dies ermöglicht es uns, mutationsbedingte Veränderungen von Podozyten von Patienten mit genetischer glomerulärer Erkrankung in Bezug auf Podozytenschäden zu untersuchen. Das Protokoll zur Reprogrammierung dermaler Fibroblasten mit einer integrationsfreien Methode durch Elektroporation wurde aus den veröffentlichten Arbeiten von Bang et al.32 und Okita et ^al.33 adaptiert. Das Protokoll zur Unterscheidung von Podozyten und hiPS-Zellen ist an das veröffentlichte Protokoll von Musah et al.28,34,35 angepasst. Es liegen bereits Publikationen vor, die die Entstehung von Podozyten aus hiPSCs beschreiben 27,34,35. Das hier vorgestellte Protokoll ist jedoch optimiert und kostengünstiger hinsichtlich der Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten. Im Vergleich zum veröffentlichten Protokoll von Musah et al. testeten wir dieses Protokoll an verschiedenen Beschichtungsreagenzien, wie Vitronektin, Lamininseide-511 und solubilisierter Basalmembranmatrix. Die Konzentrationen von Vitronektin und Lamininseide-511 konnten auf 2,5 μg/ml statt 5 μg/ml 28,34,35 gesenkt werden. Darüber hinaus war es möglich, die Konzentrationen von BMP7 und Activin A, zwei sehr teuren Wachstumsfaktoren, um 50% von 100 ng/ml auf 50 ng/ml zu senken.

Dies ermöglicht eine kostengünstigere Differenzierung. Nephron-Vorläuferzellen von Tag 7 vermehrten sich noch, und die Möglichkeit des Einfrierens wurde bereits zuvor gezeigt. Wir expandierten diese Zellen nach dem Auftauen und vor der endgültigen Differenzierung in einem Basismedium, das Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und B27 enthielt, über mehrere Tage, wodurch die Kosten noch weiter gesenkt wurden. Zusätzlich zu den Differenzierungsschritten beschreibt dieses Protokoll das Auswachsen von Fibroblasten aus Hautbiopsien mit anschließender Generierung patientenspezifischer hiPS-Zellen durch episomale Reprogrammierung. Die Kombination dieser beiden Methoden ermöglicht die Generierung patientenspezifischer Podozyten. Daher wird hier ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung patientenspezifischer hiPSC-abgeleiteter Podozyten bereitgestellt, das bisher nicht so detailliert beschrieben wurde.

Da das Gesamtprotokoll mehrere verschiedene Zelltypen umfasst, ist es wichtig, die generierten Zelltypen in verschiedenen Schritten zu charakterisieren. Die Zellen befinden sich über einen längeren Zeitraum in Kultur, daher sollte die Qualitätskontrolle an verschiedenen Stellen durchgeführt werden. Bei der Arbeit mit hiPS-Zellen ist eine tägliche Fütterung sowie eine Überwachung des Zellverhaltens und der Morphologie erforderlich. Die Sterilität der Differenzierungsmedien muss durch eine Filtersterilisation durch einen 0,2 μm Filter sichergestellt werden. Das gesamte Protokoll, von der Hautbiopsie bis zu den aus hiPS-Zellen gewonnenen Podozyten, dauert mehrere Monate, aber es ist möglich, die Zellen in verschiedenen Phasen des Prozesses einzufrieren. Fibroblasten, ausgewählte hiPSC-Klone und proliferative Nephron-Vorläuferzellen können nach 7 Tagen in Nephron-Vorläufer-Differenzierungsmedium eingefroren und eine funktionierende Zellbank generiert werden.

Obwohl aus hiPSC stammende gesunde Podozyten ein ausgeprägtes Netzwerk von primären und sekundären Fußfortsätzen entwickeln (Abbildung 5A,B) und typische Podozyten-spezifische Marker exprimieren (Abbildung 6A-C), sind charakteristische Spaltmembranen, wie sie in vivo zu sehen sind, in klassischen zweidimensionalen Zellkulturmodellen nur schwer nachzuahmen. Darüber hinaus ist eine Interzellkommunikation mit anderen glomerulären Zelltypen in dieser Monokultur nicht möglich.

Aufgrund ihres terminalen differenzierten Zustands und ihrer mangelnden Proliferationskapazität ist es schwierig, Podozyten ex vivo zu untersuchen. Mit Hilfe der bedingten Immortalisierung primärer Podozyten ist es möglich, diese Einschränkung durch das Einsetzen eines thermosensitiven Schalters zu überwinden, was zu einem Zellkulturmodell führt, in dem sich die Zellen bei 33 °C vermehren und bei 37 °C differenzieren^13,14. Obwohl diese ciPodozyten ein hohes Potenzial für die Podozytenforschung haben, gibt es Einschränkungen, wie z. B. das Fehlen einer Markerexpression, eine dedifferenzierte Morphologie und das Versagen bei der Bildung von Fußfortsätzen^15,16.

Die Differenzierung von Podozyten aus patienteneigenen somatischen Zellen ermöglicht die Generierung und den Vergleich von erkrankten Podozyten mit gesunden Kontrollzellen ex vivo. Dies ermöglicht es uns, Podozytenschäden aufgrund von Mutationen in Podozyten-spezifischen Genen zu untersuchen. Darüber hinaus hat die Arbeit mit hiPS-Zellen das Potenzial, dreidimensionale Zellkultur-Krankheitsmodelle bzw. Organoide zu erstellen^43,44. Die Kokultur von hiPSC-abgeleiteten Podozyten mit anderen glomerulären Zellen, wie glomerulären Endothelzellen oder Mesangialzellen, könnte zu neuen Erkenntnissen über die Kommunikation zwischen Zellen in der Gesundheit und bei glomerulären Erkrankungen führen.

Darüber hinaus kann die Charakterisierung und Behandlung der patientenspezifischen Podozyten ex vivo in der Hochdurchsatzanalytik durchgeführt werden. Der individualisierte Ansatz eröffnet die Möglichkeit, neuartige therapeutische Targets für spezifische Mutationen zu untersuchen und in Zukunft individualisierte Medizin zu betreiben.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde gefördert durch das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg mit dem Förderkennzeichen M4-IZKF-F009 an Janina Müller-Deile und vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) unter dem Projektnamen STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, Förderkennzeichen 01GM2202D an Janina Müller-Deile. Wir danken Annalena Kraus für die Unterstützung bei der Aufnahme von REM-Aufnahmen.

Materials

0.2 µm sterile filter	Rotilab	P668.1	for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid	Stem Cell Technologies	72262	supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free	Gibco	17504044	supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk	biogems	RL511S	additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)	Roth	8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL	Greiner bio-one	82050-856	cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg)	Sigma-Aldrich	252917-06-9	supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix	Corning	354277	additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283	to count cells
countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen		to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white	Sarstedt	72380	cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Roth	A994.1	for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x)	Gibco	11320074	basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax	Gibco	10565018	basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AMF5000	phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS)	PAN Biotech	P301902	serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile	Fisherbrand	FB104	cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI	Invitrogen	00-4959-52	mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm)	BD Microlance3	300700	for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein	78001.1	Stem cell technologies	supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7)	Peprotech	120-03P	supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein	Thermo Scientific	PHC9394	supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x)	Gibco	41400045	supplement for podocyte maintenance medium
LB medium	Roth	X964.1	for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit	Sigma Aldrich	MP0035-1KT	commercial mycoplasma detection kit
microscope slides	Diagonal GmbH & Co.KG	21,102
microtube 1.5 mL	Sarstedt	72706400
mTeSR1 Complete Kit	Stem Cell Technologies	85850	basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty	Roth	AC96.1	to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum	abcam	ab 7481	for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates	Thermo Scientific	142485	cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates	Thermo Scientific	152640	cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates	Thermo Scientific	140685	cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm	Thermo Scientific	150466	cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	167008	cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium	Sartorius	05-713-1E	serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM	Gibco	11058021	electroporation medium
pCXLE-hMLN	Addgene	#27079	plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid	Addgene	#27077	plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid	Addgene	#27078	plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	to avoid bacterial contamination
plastic coverslips	Sarstedt	83.1840.002	for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix	Roth	P087.3	commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine	Gibco	21875034	basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid	Roth	HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x)	Gibco	14190094	used for washing and coating
sterile water	Roth	T1432
syringe without needle 20 mL	BD Plastipak	300629	to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm	Sarstedt	8,33,902	sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm	Sarstedt	8,33,900	sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100	Roth	3051.3	for preincubation solution
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	T10282	to count cells
trypsin-EDTA (10 x)	Biowest	X0930-100	dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL	Greiner bio-one	188271-N
tube 50 mL	Greiner bio-one	227261
vitronectin ACF	Sartorius	05-754-0002	extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg)	Tocris	1254	to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4	Stem Cell Technologies	60093.1	pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4	Stem Cell Technologies	60062FI.1	pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67	Abcam	ab15580	proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin	Proteintech	21064-1-AP	podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin	Progen	GP-N2	podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin	proteintech	20384-1-AP	podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21435	secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed	Invitrogen	A31634	secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21422	secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	secondary anditbody, dilution 1:1000

References

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Citer Cet Article

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).