Generatie van patiënt-afgeleide podocyten uit huidbiopten

Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Friedrich-Alexander Universiteit Erlangen-Neurenberg (251_18B) en alle patiënten en probands gaven schriftelijke toestemming. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Voor de samenstelling van alle media en oplossingen die hier worden gebruikt, zie tabel 1. 1. Uitgroei van dermale fibroblasten uit een huidponsbiopsie Breng de huidponsbiopsie over in een steriele conische buis van 15 ml met 10 ml voorverwarmd fibroblastmedium. Verwijder het medium en was de huidponsbiopsie drie keer met 5 ml steriele, voorverwarmde 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng de huidponsbiopsie met een steriele tang over op een celkweekplaat van 10 cm en snijd deze in de breedte in drie of vier stukken met een steriel scalpel, waardoor de opperhuid en de dermis overblijven. Breng elk stuk over in een steriele 35 mm plastic celkweekschaal en druk het zachtjes tegen de kweekschaal. Verwijder overtollig medium rond de biopsiestukken. Laat 5-10 minuten drogen totdat de vloeistof verdampt en de biopsie aan het celkweekplastic is bevestigd. Voeg druppelsgewijs 1 ml fibroblastmedium toe met een pipet van 1.000 μL rond de biopsie en vul voorzichtig tot een eindvolume van 3 ml. Kweek bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 7 dagen zonder het gerecht te voeren en te verplaatsen. Verander het medium voorzichtig in vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Na 7 dagen kunnen ontgroeide spindelachtige fibroblasten rond de huidbiopsie worden gecontroleerd met behulp van een fasecontrastmicroscoop36.OPMERKING: Wanneer ontgroeide fibroblasten de rand van het gerecht bereiken, gaat u opnieuw verder met stap 1.3 om een nieuwe partij fibroblasten te genereren. Voor uitbreiding van de ontgroeide fibroblasten, wassen met 2 ml voorverwarmde 1x PBS, dissociëren van de fibroblasten met 1 ml 1x trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO2. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 15 ml en was de celkweekschaal met 2 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Bundel het wasmedium in de buis om het dissociatiemiddel te neutraliseren en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 20 °C op 200 x g. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel met 1 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Tel de cellen met een Neubauer-kamer of geautomatiseerde celteller met trypanblauw en zaai 2,5 x 10 3 tot 5 x 103 fibroblasten per cm2 in verse celkweekkolven. Plaats de kolven terug in de broedmachine en verdeel de cellen gelijkmatig door de kolven driemaal in elke richting te bewegen. Vervang de volgende dag het medium door vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Verander het medium twee keer per week en splits wanneer de fibroblasten ongeveer 80% confluency bereiken. 2. Invriezen van dermale fibroblasten Om de fibroblasten in te vriezen, was je ze met 5 ml voorverwarmde 1x PBS. Zuig de PBS aan en dissocieer de fibroblasten met 4 ml 1x trypsine-EDTA. Plaats de kolf terug in de incubator en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C bij 5% CO2. Controleer het loslaten met behulp van een fasecontrastmicroscoop en tik tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 15 ml. Was de celkweekkolf met 5 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Giet het wasmedium in de conische buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel met 2 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Tel de cellen en breng 1 x 106 cellen over naar een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet met 1 ml koud fibroblastvriesmedium bestaande uit 90% foetaal kalfsserum en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Breng over in een cryovial, plaats in een vriescontainer en vries een nacht in bij -80 °C. Voor langdurige opslag, plaats de cryovial de volgende dag in een tank met vloeibare stikstof. 3. Episomale herprogrammering van fibroblasten om hiPSC’s te genereren Gebruik voor episomale herprogrammering 1,5 x 106 fibroblasten van passage 4 tot 8. Om dit celnummer te bereiken, gebruikt u twee tot drie kolven van 250 ml met ongeveer 70% samenvloeiing. De dag voor het herprogrammeren, splits de fibroblasten in een verhouding van 1: 2 om hun proliferatieve toestand te garanderen. Zuig daarom het medium aan en was de kolven met 5 ml voorverwarmd 1x PBS per kolf. Zuig de PBS aan en dissocieer de fibroblasten met 4 ml 1x trypsine-EDTA. Plaats de kolven terug in de couveuse en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Bewaak het loslaten met behulp van een fasecontrastmicroscoop en tik tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken van het plastic oppervlak. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 50 ml en was de celkweekkolven met 5 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Giet het wasmedium in de conische buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet in 6 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Bereid zes nieuwe celkweekkolven door 5 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium per kolf toe te voegen. Voeg 1 ml fibroblastcelsuspensie toe aan elke kolf. Plaats de kolven terug in de broedmachine en verdeel de cellen gelijkmatig door de kolven driemaal in elke richting te bewegen. Voor episomale herprogrammering, bedek twee 10 cm celkweekplaten die geschikt zijn voor hiPSC-cultuur met 4 ml koude coatingoplossing per plaat. Incubeer de platen gedurende 1 uur bij 37 °C.OPMERKING: Om hiPSC’s te kweken, zijn verschillende celkweekplastics en extra extracellulaire matrixcoating vereist (zie materiaaltabel). Verwijder de media uit de fibroblasten en was met 10 ml voorverwarmde 1x PBS per kolf. Zuig de PBS aan en dissocieer de fibroblasten met 4 ml 1x trypsine-EDTA per kolf door gedurende 5-7 minuten bij 37 °C te broeden. Controleer het loslaten met een fasecontrastmicroscoop en tik indien nodig tegen de zijkant van de kolf om de cellen los te maken van het plastic oppervlak. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 50 ml. Was de lege kolven met 6 ml voorverwarmd fibroblastmedium om de resterende cellen te verzamelen en zich in de conische buis te verzamelen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel in 3 ml verse, voorverwarmde 1x PBS. Tel de cellen en breng 1,5 x 106 fibroblasten over in een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel in 5 ml elektroporatiemedium en centrifugeer opnieuw. Zuig ondertussen de coatingoplossing op uit de gecoate celkweekplaten van 10 cm en voeg 7 ml voorverwarmd fibroblastmedium toe. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspensie van de celpellet in elektroporatiemedium met een concentratie van 1,5 x 106 cellen in 250 μL. Breng de 250 μL celsuspensie over naar een elektroporatiecuvet met een spleetafstand van 4 mm (zie materiaaltabel). Bereid een plasmidetransfectiemengsel door 4 μg van elk plasmide (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) toe te voegen aan een totaal volume van 50 μL elektroporatiemedium. Breng over op de cuvette en meng door zachtjes te vegen. Elektroporaat met één puls bij 280 V. Knip een pipetpunt met een steriele schaar en breng 125 μL van de geëlektroperde fibroblasten over op elk van de voorbereide celkweekplaten van 10 cm. Verdeel de cellen door de platen drie keer in alle richtingen te roeren en plaats ze terug in de incubator. Incubeer ‘s nachts bij 37 °C met 5% CO2 zonder verstoring. Om dode cellen te verwijderen, vervangt u het medium de volgende dag door 7 ml vers, voorverwarmd fibroblastmedium. Verander het medium 2 dagen na elektroporatie in hiPSC-kweekmedium en vervang het om de andere dag gedurende de volgende 20 dagen. 4. Selectie, uitbreiding en kwaliteitscontrole van gegenereerde hiPSC’s Controleer de cellen dagelijks gedurende ten minste 20 dagen met behulp van een fasecontrastmicroscoop met een 10x of 20x objectief om de vorming van hiPSC-kolonies na elektroporatie te observeren. Als hiPSC-kolonies ongeveer 300 μm groot zijn met duidelijke randen en de hiPSC’s een hoge kern-tot-lichaamsverhouding vertonen, zijn de hiPSC-kolonies klaar voor selectie door te plukken (figuur 2B, C en figuur 3). Vóór het plukken bekleedt u een plaat met 96 putten die geschikt is voor hiPSC-cultuur met 100 μL coatingoplossing per put en incubeer u gedurende 1 uur bij 37 °C. Markeer tijdens de incubatie kolonies van belang op de bodem van de celkweekschaal met een pen. Verwijder voor de laatste bereiding van de 96-putplaat de coatingoplossing en voeg 100 μL voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632 toe aan elke put. Was de cellen met voorverwarmde 1x PBS en voeg vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium toe dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat voordat u plukt om dode cellen te verwijderen. Om hiPSC-kolonies te plukken, gebruikt u een meetnaald en verdeelt u de hiPSC-kolonies in kleine stukjes door een raster in elke kolonie te tekenen. Controleer met behulp van een fasecontrastmicroscoop of de kolonies met succes in stukken zijn verdeeld. Breng ze met een pipet van 100 μL over op de voorbereide plaat met 96 putten. Houd de pipet rechtop boven de kolonie zonder de cellen aan te raken om krassen en verlies van de kolonie te voorkomen. Plaats de 96-putplaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 en laat de cellen een nacht ongestoord hechten. Bewaar de gerechten met de fibroblast- en hiPSC-mix, voor het geval het plukken niet lukt. Verwijder daarom ROCK-remmer Y27632 door het medium te veranderen in hiPSC-kweekmedium en plaats de platen terug in de incubator. Vervang de volgende dag het medium van de 96-wells plaat tot 200 μL vers hiPSC-kweekmedium en vervang het om de andere dag. Controleer de 96-putplaat de volgende dag en markeer de putten met succesvol geplukte klonen.OPMERKING: Als de geplukte hiPSC-klonen na de eerste poging niet volledig zijn geselecteerd en de fibroblasten in de put kunnen worden gevonden, herhaal dan het plukken uit de 96-put of schraap de fibroblasten van de plaat. 5. Uitbreiding van geselecteerde hiPSC-klonen Bewaak de hiPSC-klonen met een fasecontrastmicroscoop. Als de geselecteerde hiPSC’s ongeveer 70% confluency bereiken, zijn de hiPSC-klonen klaar voor uitbreiding. Bedek een 48-putplaat geschikt voor hiPSC-cultuur met 250 μL coatingoplossing per put gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervang de coatingoplossing door 200 μL vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat. Om de hiPSC’s los te maken van de 96-putplaat, schraapt u het plastic oppervlak met een pipetpunt van 1.000 μL. Breng de losgemaakte hiPSC’s over van de 96-well plaat naar een 48-well plaat. Verander het medium de volgende dag in vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium om dode cellen en de ROCK-remmer Y27632 te verwijderen. Als de hiPSC-klonen ongeveer 70% confluentie bereiken, breng de hiPSC’s dan over in een 24-putplaat. Bedek daarom een 24-putplaat die geschikt is voor hiPSC-cultuur met 400 μL coatingoplossing per put gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervang de coatingoplossing door 400 μL vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat. Zuig het medium uit de 48 putjes en was met 500 μL voorverwarmde 1x PBS. Vervang de PBS door 100 μL enzymatische celloslatingsoplossing met 10 μM ROCK-remmer Y27632 en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C. Spoel de hiPSC’s van de plaat met een pipet van 1.000 μL. Breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis van 15 ml. Was de lege plaat met 48 putten met hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632 en pool in de conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de hiPSC’s in 1 ml hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632 en breng over op een 24-wellsplaat. Plaats de plaat in de incubator bij 37 °C bij 5% CO2 en verdeel de cellen door de plaat drie keer in alle richtingen te roeren. Laat de cellen zich een nacht ongestoord hechten. Verander de volgende dag het medium in hiPSC-kweekmedium zonder ROCK-remmer Y27632.OPMERKING: Als hiPSC-klonen ongeveer 70% confluentie bereiken, breng de hiPSC’s dan over naar een 12-wells plaat door stappen 5.4 tot 5.7 te herhalen met verhoogde volumes die geschikt zijn voor een 12-well formaat. Als de hiPSC’s van de 12-well plaat ongeveer 70% confluency bereiken, breng de hiPSC-klonen over naar een 6-well plaat met verhoogde volumes voor een 6-well formaat. 6. Invriezen van geselecteerde hiPSC-klonen Om geselecteerde hiPSC-klonen te bevriezen, zuigt u het medium op uit een plaat met 6 putten. Was de putjes met 2 ml 1x PBS. Zuig en dissocieer de hiPSC’s met 1 ml enzymatische celloslatingsoplossing die 10 μM Y27632 bevat. Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Spoel de hiPSC’s van de plaat met behulp van een pipet van 1.000 μL en breng de losgemaakte cellen over in een conische buis van 15 ml. Was de plaat met 2 ml vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632. Zwembad in de conische buis en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet met 2 ml vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat. Tel de cellen en breng 1 x 106 cellen over naar een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op, resuspensie de celpellet in 1 ml koud, serumvrij hiPSC-vriesmedium en vries het in een cryoviaal in met behulp van een vriescontainer gedurende een nacht bij -80 °C. Voor langdurige opslag, plaats de cryovial de volgende dag in een tank met vloeibare stikstof. 7. HiPSC kwaliteitscontrole Karakterisering van hiPSC-morfologieControleer de karakteristieke hiPSC-morfologie met behulp van een fasecontrastmicroscoop met een 20x-objectief. Na herprogrammering verandert de celmorfologie van lange, spindelachtige fibroblasten naar kleine, ronde hiPSC’s, met een hoge kern-tot-lichaamsverhouding die groeit in kolonies met verschillende grenzen (figuur 2C). Als de hiPSC-kolonies te dicht worden en spontane differentiatie optreedt, schraapt u de gedifferentieerde delen van de plaat met behulp van een pipetpunt (figuur 3). Aangezien hiPSC’s een hoge proliferatiesnelheid hebben, voedt u de hiPSC-culturen elke dag met vers, voorverwarmd hiPSC-voedingsmedium. Karakterisering van pluripotentiemarkers door immunofluorescentiekleuringOm de gegenereerde hiPSC’s te controleren op pluripotentiemarker via immunofluorescentiekleuring, plaatst u plastic afdekplaten in een 24-wells plaat en bedekt u met 250 μL coatingoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de coatingoplossing door 1 ml voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632. Zaad 1,9 x 104 gedissocieerde hiPSC’s per 24-put. Laat de hiPSC’s een nacht hechten bij 37 °C en 5% CO2 zonder verstoring. Zie stap 5.4 tot en met 5.6 voor dissociatie van de hiPSC’s. Vervang het medium de volgende dag door hiPSC kweekmedium zonder ROCK-remmer Y27632. Was voor het kleuren de cellen met 1 ml voorverwarmde 1x PBS en fixeer vervolgens de hiPSC’s met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste hiPSC’s met 1x PBS en blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 200 μL preïncubatieoplossing per put gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun primaire antilichamen Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) in antilichaamverdunningsmiddel. Reinig een plastic folie met 70% ethanol en plaats deze in een vlekkamer gevuld met een waterreservoir. Plaats druppeltjes van 30 μL primaire antilichaamverdunningen op de folie. Plaats de vaste monsters ondersteboven in de verdunning en incubeer een nacht bij 4 °C. Was de monsters de volgende dag drie keer met 1x PBS gedurende 5 minuten en plaats 30 μL druppeltjes secundaire antilichaamverdunningen (1:1.000) op schone plekken op de folie. Leg de dekselglaasjes ondersteboven in de verdunning. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Na incubatie drie keer wassen met 1x PBS gedurende 5 min. Monteer de monsters op glasplaten in het montagemedium dat DAPI bevat. Laat een nacht drogen bij kamertemperatuur en in het donker en breng de monsters in beeld met een confocale microscoop (figuur 4). Uitsluiting van bacteriën en mycoplasmabesmettingOm bacteriebesmetting uit te sluiten, brengt u 500 μL gedissocieerde hiPSC’s over op 5 ml voorverwarmd Luria-Bertani (LB) medium. Zie stap 5.4 tot en met 5.6 voor dissociatie van de hiPSC’s. Incubeer een nacht bij 37 °C. Als het LB-medium troebel lijkt, is er waarschijnlijk bacteriebesmetting opgetreden. Gooi de cellen weg. Om mycoplasmabesmetting uit te sluiten, verzamelt u medium dat gedurende 2 dagen niet is vervangen uit 6 putten met ongeveer 90% confluente hiPSC’s. Gebruik kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) om mycoplasmabesmetting te detecteren. Veel commerciële mycoplasma detectiekits zijn beschikbaar voor dit doel. 8. Differentiatie van hiPSC’s in podocyten Bereiding en opslag van groeifactorenOm een stamconcentratie van 10 mM Y27632 te bereiden, reconstitueert u 10 mg Y27632 (molecuulgewicht van 320,26 g/mol) in 3,12 ml steriel water. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:1.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 10 μM. Om een stamconcentratie van 30 mM CHIR99021 te bereiden, reconstitueert u 5 mg CHIR99021 (molecuulgewicht van 465,34 g/mol) in 358,2 μl steriele DMSO. Bewaar 50 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:10.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 3 μM. Om een stamconcentratie van 100 μg/ml activine A te bereiden, reconstitueert u 100 μg activine A in 1 ml 1x PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:2.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 50 ng/ml. Om een stamconcentratie van 100 μg/ml botmorfogeen eiwit 7 (BMP7) te bereiden, reconstitueert u 100 μg BMP7 in 1 ml steriel water met 0,1% BSA. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:2.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 50 ng/ml. Om een stamconcentratie van 100 μg/ml vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) te bereiden, reconstitueert u 100 μg VEGF in 1 ml steriel water. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:4.000 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 25 ng/ml. Om een 10 mM stockconcentratie van all-trans retinoïnezuur te bereiden, reconstitueert u 10 mg all-trans retinoïnezuur in 3,33 ml steriele DMSO. Bewaar 100 μL aliquots bij -20 °C en verdun 1:100 in celkweekmedium tot een eindconcentratie van 0,5 μM. Activering van WNT-signaleringsroute om mesoderm-afstamming te inducerenVoor differentiatie van hiPSC’s in van hiPSC afgeleide podocyten, coatcelkweekplaten of kolven geschikt voor hiPSC-cultuur met coatingoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Het totale volume van de coatingoplossing is 1 ml per kweekplaat met 6 putten of 4 ml per celkweekplaat van 10 cm. Zuig het medium aan en was de hiPSC’s met voorverwarmde 1x PBS. Zuig de PBS aan en voeg een enzymatische celloslatingsoplossing toe die 10 μM Y27632 bevat met een totaal volume van 1 ml per 6-well kweekplaat of 4 ml per 10 cm celkweekplaat. Plaats de plaat terug in de incubator en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Spoel de hiPSC’s van de plaat met een pipet van 1.000 μL. Breng de losgemaakte cellen over in een conische buis. Was de plaat met vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium met 10 μM ROCK-remmer Y27632. Bundel het wasmedium in de conische buis om het dissociatiereagens te neutraliseren. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet met 2 ml vers, voorverwarmd hiPSC-kweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer Y27632 bevat. Tel de cellen en zaai 1 x 104 hiPSC’s/cm2. Verdeel de cellen door drie keer in alle richtingen te roeren. Laat de hiPSC’s een nacht hechten bij 37 °C met 5% CO2 zonder verstoring. Vervang het medium de volgende dag door 2 ml voorverwarmd mesodermdifferentiatiemedium met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A en 10 μM ROCK-remmer Y27632. Differentiatie in nefron voorlopercellenVerander na 2 dagen het mesodermmedium in 2 ml voorverwarmd nefronvoorloperdifferentiatiemedium met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A en 50 ng / ml BMP7 per 6-well kweekplaat of 6 ml per 10 cm celkweekplaat. Verander het medium om de dag gedurende de komende 14 dagen.OPMERKING: Nefron voorlopercellen prolifereren en kunnen worden gepasseerd en ingevroren na 7 dagen differentiatie in nefron voorloperexpansiemedium. Om de nefronvoorlopercellen te splitsen, bedekt u de celkweekplastics die geschikt zijn voor hiPSC-cultuur gedurende 1 uur bij 37 °C. Vervang de coatingoplossing door nefron voorloperexpansiemedium. Zuig de media aan en was de cellen met voorverwarmde 1x PBS. Verwijder de PBS en dissocieer de cellen met 1x trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Controleer het loslaten van de cellen met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Tik indien nodig tegen de zijkant van het plastic om de cellen van het oppervlak los te maken. Spoel de cellen van de plaat en breng ze over in een conische buis. Was de lege kolf of plaat met hetzelfde volume voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium als het dissociatiereagens. Bundel het wasmedium in de conische buis. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 20 °C. Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel met 2 ml vers, voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Tel de cellen en zaad 1,5 x 104 nefron voorlopercellen per cm2 voor verdere differentiatie.OPMERKING: Om de nefronvoorlopercellen te bevriezen, resuspensie 1 x 106 cellen in 1 ml koud serumvrij cryopreservatiemedium en overgebracht naar een cryovial. Bevries in een vriescontainer bij -80 °C gedurende een nacht en breng over naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Plaats de platen terug in de couveuse en verdeel de cellen gelijkmatig door drie keer in alle richtingen te roeren. Verander het medium de volgende dag in vers, voorverwarmd nefron voorloperdifferentiatiemedium. Vervang het medium om de dag totdat de cellen gedurende 14 dagen zijn gedifferentieerd in nefron voorloperdifferentiatiemedium. Terminale differentiatie in hiPSC-afgeleide podocytenZuig het medium aan en voeg 2 ml voorverwarmd podocytendifferentiatiemedium toe met 1x B27-supplement, 1% penicilline-streptomycine, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activine A, 50 ng / ml BMP7, 25 ng / μL VEGF en 0,5 μM volledig trans retinoïnezuur per 6-well kweekplaat of 6 ml per 10 cm celkweekplaat. Plaats de platen terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium om de andere dag gedurende 4 dagen met vers, voorverwarmd podocytendifferentiatiemedium. Om de hiPSC-podocyten na differentiatie in cultuur te houden, voedt u de cellen twee keer per week met podocytenonderhoudsmedium dat 10% foetaal kalfsserum, 1% penicilline-streptomycine en 0,1% insuline-transferrine-selenium bevat.OPMERKING: Terminale gedifferentieerde hiPSC-podocyten vermenigvuldigen zich niet meer. Het is echter mogelijk om ze tot 4 weken in celkweek te houden. Ontdooien en uitzetten van bevroren nefron voorlopercellenBekleed een nieuwe plastic kolf voor celkweek geschikt voor hiPSC-kweek gedurende 1 uur met coatingoplossing bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de coatingoplossing door 5 ml nefron voorloperexpansiemedium. Bereid een conische buis van 15 ml met 7 ml voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Ontdooi de bevroren cellen bij 37 °C in een waterbad zonder beweging gedurende ongeveer 20 s. Haal de cryovial uit het waterbad als de helft van de cellen is ontdooid en er wat ijs overblijft. Spuit de cryovial in met 70% ethanol en plaats in een bioveiligheidskast. Breng ontdooide cellen over naar de conische buis met het voorverwarmde nefron voorloperexpansiemedium. Gebruik een pipet van 1.000 μL en laat de cellen heel langzaam langs de wand van de buis lopen. Was de lege cryoviaal met 1 ml nefron voorloperexpansiemedium om de resterende cellen te verzamelen en zich in de conische buis te verzamelen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij 20 °C en resuspensie van de celpellet in vers, voorverwarmd expansiemedium voor nefronvoorlopercellen. Breng de ontdooide cellen over in de gecoate kolf en verander het medium de volgende dag in vers, voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Laat de cellen vóór verdere differentiatie zich vermenigvuldigen in het expansiemedium van de nefronvoorloper door het medium om de andere dag te veranderen en ga verder met stap 8.3.5. 9. Karakterisering van van hiPSC afgeleide podocyten door immunofluorescentiekleuring Om de gedifferentieerde podocyten te controleren op de podocyt-specifieke marker via immunofluorescentiekleuring, plaatst u plastic coverslips in een 24-wells plaat en bedekt u met 250 μL coatingoplossing gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2. Vervang de coatingoplossing door 1 ml voorverwarmd nefronvoorloperexpansiemedium. Zaad 2,5 x 104 gedissocieerde nefron voorlopercellen per 24-well plaat. Zie de stappen 8.3.2 tot en met 8.3.4 voor dissociatie van nefronvoorlopercellen. Laat de cellen zich een nacht hechten bij 37 °C en 5% CO2 zonder verstoring. Vervang het medium de volgende dag door voorverwarmd nefron voorloperdifferentiatiemedium. Voltooi differentiatie door het medium om de dag te veranderen totdat de cellen in totaal 14 dagen zijn gedifferentieerd in nefron voorloperdifferentiatiemedium en nog eens 5 dagen in podocytendifferentiatiemedium. Na de laatste differentiatie was u de cellen met 1 ml voorverwarmde 1x PBS. Bevestig de hiPSC-podocyten met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen met 1x PBS en blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 200 μL preïncubatieoplossing per put gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Verdun de primaire antilichamen synaptopopodie (1:200), podocine (1:100) en nefrine (1:25) in antilichaamverdunningsmiddel en plaats druppeltjes van 30 μL primaire antilichaamverdunning op een schone plastic folie in een kleuringskamer met een waterreservoir. Plaats afdekglaasjes met vaste hiPSC-podocyten ondersteboven in de verdunning. Incubeer een nacht bij 4 °C. De volgende dag drie keer wassen met 1x PBS gedurende 5 min. Verdun de secundaire antilichamen (1:1.000) in 1x PBS en plaats druppeltjes van 30 μL secundaire antilichaamverdunning op schone plekken op de folie. Leg de dekselglaasjes ondersteboven in de verdunning. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Na incubatie drie keer wassen met 1x PBS gedurende 5 min. Monteer de monsters op glasplaten in een montagemedium dat DAPI bevat. Laat een nacht drogen bij kamertemperatuur en in het donker. Beeld de monsters af met een confocale microscoop.