ラット腸管オルガノイドの作製と操作

注:すべての細胞培養は、組織培養フード内で適切な無菌技術を使用して取り扱う必要があります。この研究におけるすべての動物研究は、イェール大学の動物管理委員会(IACUC)によって承認されました。 1. 細胞培養試薬の調製 R-spondin 1 馴化培地は、製造元の指示に従って調製します。Wnt3aコンディショニングメディアは、製造元の指示に従って準備します。 表 1 の説明に従って AdDMEM+ を準備します。 ガストリンを滅菌dH2Oに再懸濁し、100μMストックを調製する。分注し、-80°Cで保管します。 N-アセチルシステインを滅菌水に再懸濁し、100 mMストックを調製します。分注し、-20°Cで最大1か月間保管します。 組換えヒトノギンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)+0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)に再懸濁し、250 μg/mLストックを調製します。分注し、-80°Cで保管します。 組換えマウス上皮成長因子(EGF)をPBS + 0.1% BSAに再懸濁し、100 μg/mLのストックを調製します。分注し、-80°Cで保管します。 組換えヒトIGF-1をPBS + 0.1% BSAで希釈し、100 μg/mLのストックを調製します。分注し、-80°Cで保管します。 組換えヒトFGF-2を5 mM Tris(pH 7.6)に再懸濁し、100 μg/mLストックを調製します。分注し、-80°Cで保管します。注:すべての成長因子について、培地の最終濃度の100倍になるようにPBS + 0.1% BSAで中間希釈液を使用してください。-20°Cで保管してください。 2. ラット小腸オルガノイドの樹立 注:このプロトコルは、ラット腸オルガノイド23,24の以前に公開された2つのプロトコルから変更されました。 表2に従ってラット腸管オルガノイド培地(rIOM)を調製し、ウォーターバスを37°Cに設定しました。 この完全な培地は、4°Cで5日間安定です。 15 mL のコニカルチューブに PBS 中の 3 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)10 mL を調製し、氷上に保管します。250 μLの細胞外マトリックス抽出物(EME)を氷上で解凍します。 ネズミを一晩断食し、自由に水を飲めます。 IACUC承認のプロトコルに従ってラットを安楽死させます。このプロトコルでは、成体の雄のSprague Dawleyラット(体重~200g)をCO2吸入によって安楽死させました(資料表)。頸椎脱臼は、安楽死の二次的な方法として用いられた。 解剖には滅菌オートクレーブ滅菌鉗子と解剖ハサミを使用してください。安楽死させたラットを解剖面の腹側を上にして置きます。鉗子で皮膚層をつまみます。次のカットは表面レベルで行う必要があるため、この皮膚層をカットするだけで、内臓を損傷するほど深くはありません。 腹腔を開くには、大きくて鋭い解剖ハサミを使用して、腹部の中央にある大きな縦方向の表面レベルの切り込みで皮膚層を切り取ります。次に、そのカットから、両側に1つずつ、2つの短い水平カットを作成します。鉗子を使用して皮膚をはがし、腹腔を露出させます。腹膜を切断して、腹腔内の内臓を完全に露出させ、腸にすぐにアクセスできるようにします。 はさみと鉗子を使用して、胃の位置を特定し、黄色がかったセグメントとして表示される、約2〜3 cm離れた十二指腸を特定します。近位空腸は、十二指腸と空腸の間のランドマークとして機能するトレイツの靭帯から約4〜5cm遠位に位置しています。 単離した腸片を10cmのシャーレに入れます。腸間膜の目的の腸セグメントをできるだけきれいにします。10 mLの氷冷PBSで、管腔内容物がなくなるまで洗い流します。ペーパータオルの上で、腸の部分を~2cmの長さに切ります。各腸片を縦方向に開いて、上皮を露出させます。 ガラス顕微鏡スライドを使用して、露出した管腔表面をこすり、絨毛を取り除きます。氷上で調製したEDTA溶液に腸片を入れます。10rpmに設定されたチューブリボルバーで4°Cで30分間回転させます。 解剖顕微鏡で、円錐形チューブの内容物を10cmのシャーレに注ぎます。さらに~5 mLの氷冷PBSを加えます。 細かい鉗子を使用して、腸のセグメントを持ち、激しく振る。PBSへの上皮放出を見ることができます。最初は、PBSには主に絨毛が含まれます。 シェイクを続けます。絨毛を含むPBSを定期的に廃棄し、10 mLの新鮮な氷冷PBSを腸の断片に加えます。破片を振とうを続け、絨毛がPBSに放出されなくなるまで、この洗浄ステップを繰り返しますが、代わりにPBSには主に陰窩が含まれています。細胞の生存率が損なわれないように、陰窩の単離は15分を超えないようにしてください。 残りの腸の断片を捨てます。ペトリ皿に残っているPBSを腸陰窩用に濃縮します。組織培養フードで、PBSを含む陰窩を回収し、70 μmのセルストレーナーでろ過します(材料表)。 250 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを5 mLのAdDMEM+に再懸濁します。再び250 x g で5分間遠心分離します。注意: スイングバケットローター付きの遠心分離機を使用することをお勧めします。 上清を除去し、ペレットに~50 μLの培地を残します。ペレットを残りの培地に再懸濁し、氷上でEMEのアリコートに加えます。静かに上下にピペットで移動させ、EME全体で陰窩を均等に吊り下げます。気泡の発生は避けてください。 50 μL の EME ドームを 35 mm 組織培養皿に播種し、37 °C、5% CO2 組織培養インキュベーターで 20 分間インキュベートします。 10 μM Y27632 と 10 μM CHIR99021(表 3)を含む 2 mL の rIOM (表 2) を加えます。継代後、Y27632およびCHIR99021を中止することができます。 rIOM は 2 日から 3 日ごとに交換します。必要に応じて、オルガノイドの初期数、サイズ、および増殖速度に応じて、通常は3〜7日の間に継代します。 3. 継代ラット腸管オルガノイド 250 μL の EME アリコートを氷上で解凍し、rIOM を 37 °C に予熱します。 オルガノイドを含む35 mmプレートから培地を吸引し、1 mLの解離試薬を添加して、オルガノイドをEMEドームから直ちに放出します。 断片化されたオルガノイドを含む解離試薬を直ちに15 mLのコニカルチューブに移します。培養プレートを2 mLのAdDMEM+で洗浄し、断片化されたオルガノイドを含む15 mLのコニカルチューブに加えます。 ガラス製のパスツールピペットを使用して、15〜20回静かに上下にピペットで移動し、オルガノイドを断片化します。350 x g で2分間遠心分離します。 コニカルチューブの底部から~50 μLの溶液をEMEに加えます。ピペットで静かに上下に動かして混ぜます。泡を作らないでください。 50 μL の EME ドームを 35 mm のディッシュに播種し、37 °C、5% CO2 組織培養インキュベーターで 20 分間インキュベートします。 10 μM Y27632 と 10 μM CHIR99021 で 2 mL の rIOM を加えます。成長培地は2〜3日ごとに交換してください。メディアを変更する場合、Y27632 と CHIR99021 は省略できます。 4. ラット腸管オルガノイドの凍結保存と融解 凍結保存ラット腸オルガノイド注:凍結保存プロトコルは、ヒトおよびマウスオルガノイドの以前のプロトコルから変更されました25。凍結前に、オルガノイドは初代培養で少なくとも2つの継代を持っている必要があります。凍結保存の前に、大きなスフェロイドまたはわずかに出芽したオルガノイドまでオルガノイドを増殖させることが、融解後の生存可能なオルガノイドの収量が高くなるため、お勧めします。これは、R-spondin馴化培地を15%に増やすか、オルガノイド培養物に10 mMのニコチンアミド(表3)を添加することで達成できます。顕微鏡を使用して、35 mmディッシュ上のオルガノイドの数を数えます。200個のオルガノイドが各クライオバイアルに分注されるようにクライオバイアルを標識します。 35 mmディッシュからrIOMを取り外します。2 mLの冷組織培養グレードのPBSと交換してください。 P1000チップを使用して、培養皿の底部からEMEドームをピペッティングで上下に動かし、PBSに放出します。ピペットで上下に~20回繰り返してEMEを分解し、オルガノイドを放出します。オルガノイドとPBSを15 mLのコニカルチューブに集めます。 2 mLの冷たいPBSを培養皿に加え、ピペットで上下させて、残っているオルガノイドをPBSに放出します。PBS を 15 mL コニカルチューブに移します。 オルガノイドを290 x g で5分間遠心分離してペレット化します。オルガノイドペレットを破壊することなく上清を除去し、廃棄します。 5 mLの冷たいAdDMEM+に静かに再懸濁して、ペレットを洗浄します。200 x g で4分間遠心分離します。上澄みを慎重に取り除いて廃棄します。 オルガノイドペレットをオルガノイド200個あたり1 mLの低温凍結培地に再懸濁します。1 mLのオルガノイドを凍結培地に分注し、標識クライオバイアルごとに分注します。クライオバイアルを冷凍容器に入れます。 オルガノイドを-80°Cの凍結容器で24時間保存した後、クライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。 ラット腸管オルガノイドの融解注:このプロトコルは、ヒトおよびマウスの腸管オルガノイドを融解するための以前のプロトコルから変更されました26。250 μL の EME アリコートを氷上で解凍します。15% R-spondin 馴化培地、10 μM Y27632、10 μM CHIR99021を添加した rIOM を調製します。37°Cで温める。 室温で2 mLの霜取り培地(表3)を15 mLのコニカルチューブに加えます。 液体窒素からオルガノイドのバイアルを取り出し、バイアルを37°Cのウォーターバスに入れ、バイアルがほぼ完全に解凍されるまで解凍します。 1 mLの霜取り媒体をバイアルに加え、すべての内容物を霜取り媒体を含む円錐形のチューブに移します。バイアルを1 mLの解凍媒体で2回洗浄し、コニカルチューブに移します。 200 x g で5分間遠心分離します。培地を吸引し、オルガノイドとともに~50 μLの培地を残します。オルガノイドを含む培地を250 μLのEMEに移します。 気泡を避けながら、ピペッティングで上下させることにより、EMEを介してオルガノイドを均等に分配します。6個の50μLドームを35 mmの組織培養皿にピペットで移します。 組織培養インキュベーターで15〜20分間インキュベートして、EMEを重合させます。調製したrIOMを2 mL皿に加えます。 2 日後、メディアを rIOM と交換します。Y27632およびCHIR99021の使用を一時停止することができます。オルガノイドの成長は、融解後の最初の継代で遅くなる可能性があります。実験を開始する前に、融解後にオルガノイドを2回継代することをお勧めします。 5. 3Dオルガノイドからのラット腸管2D単分子膜の作製 注:以下のプロトコルは、~300個の腸管オルガノイド/ドームを含む50 μL(35 mmディッシュ)の6つのドームから始めて、EMEでコーティングされた48ウェルプレートの24ウェルを生成するために必要な容量を説明しています(スケール:1つのドームで4つのウェルを生成します)が、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。書かれているように、このプロトコルは4-5日で~80%のコンフルエンスを達成します。コンフルエント度が高くなると、細胞は再び3Dオルガノイド構造を獲得し始めます。低コンフルエンス(≤40%)では、細胞は単層のままで、~14日間生存可能です。研究の目的が 2D 単層を使用することである場合は、1 つのドームで 24 ウェルプレートの 8 つのウェルが生成されるようにスケールダウンします。ウェルをコラーゲンIでコーティングして単層を形成することもできます。 塗装面の処理プレートをEMEでコーティングするには、EMEを低温AdDMEM+で1:20に希釈します(表1)。コラーゲンでコーティングする場合は、メーカーの指示に従ってコラーゲンIを準備してください。AdDMEM+ で 5 mg/mL のコラーゲン I を 100 μg/mL(この場合は 1:50)に希釈します。 200 μLの希釈EMEまたはコラーゲンでプレートをコーティングし、ウェル表面全体を覆います。組織培養インキュベーターで37°Cで1〜2時間インキュベートします。 表4に従って、2D単層培養(rIOM2D)用のラット腸管オルガノイド培地を調製します。 単分子膜の生成オルガノイドを含む35 mmプレートから培地を吸引します。PBSを1 mL添加します。 P1000チップで引っ掻いてウェル内のEMEを破壊します。ピペットで上下に約20回動かして、すべてのEMEを緩めます。すべてを15 mLのコニカルチューブに移します。 35 mm プレートに 1 mL の PBS を加えて追加のオルガノイドを回収し、同じ 15 mL コニカルチューブに移します。 350 x g で 2 分間遠心分離し、EME 残渣を含む上清を吸引します。オルガノイドペレットに1 mLのトリプシン溶液を加え、37°Cで2分間インキュベートします。 P1000チップを使用して10回ピペットで上下させ、2 mLのAdDMEM+を加えてトリプシンを中和します。 350 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、4.8 mL の rIOM2D を加えます(表 4)。細胞ペレットを再懸濁します。 オルガノイドを配置する前に、AdDMEM+中の余分なEMEまたはコラーゲンをウェルから取り出します。次に、200 μL のオルガノイドを rIOM2D に添加し、10 μM の Y27632 をプレコートした各ウェルに加えます。 4〜16時間後、培地を回収し、1,000 x g で1分間遠心分離します。上清を新しい15 mLコニカルチューブに移し、ペレットを廃棄します。 各ウェルを 300 μL の PBS で洗浄し、遠心分離した rIOM2D を各ウェルに 200 μL 添加します。rIOM2D を 2 〜 3 日ごとに変更し、Y27632 の使用を一時停止します。 2D単分子膜からの3Dオルガノイドの改質注:EMEで増殖した単分子膜は3Dオルガノイドを改質するように誘導できますが、コラーゲンIで増殖した単分子膜は3Dオルガノイドに効率的に戻りません。通常、単層から生成されたオルガノイドのウェルを2〜3個使用して、5日目に50μLのEMEのドームを1個作ることができます。EME を rIOM2D で 1:4 に希釈します。単分子膜のコンフルエントが~80%に達したら、培地を慎重に吸引し、単層を含むウェルに希釈したEMEを100 μL添加します。 組織培養インキュベーターで37°C、5%CO2 で20分間インキュベートします。その後、100 μLのrIOM2Dを添加し、組織培養インキュベーターに戻します。3Dオルガノイドは、希釈したEMEを追加してから5日以内に生成されます。 小さなオルガノイドが再形成した後(~5日目)、rIOMを調製します。すべてのウェルの内容物を回収し、ピペッティングで上下させてEMEを破壊し、15 mLのコニカルチューブに移します。 350 x g で2分間遠心分離します。上清とEME残渣を吸引します。 1 mLの冷たいAdDMEM+を加え、350 x g で2分間遠心分離します。上清を除去し、培地を~50 μL残します。 培地とオルガノイド 50 μL を 250 μL の EME アリコートに移します。ピペットを上下に動かして、オルガノイドをEME全体に分散させます。 50 μL の EME ドームを 35 mm のディッシュにピペットで入れ、組織培養インキュベーターで 20 分間インキュベートします。 2 mL の rIOM と 10 μM Y27632 を加えます。成長培地は2〜3日ごとに交換してください。メディアを変更する場合、Y27632 は省略できます。 6.遺伝子操作 2D単分子膜の一過性トランスフェクション注意:セクション5.1に従って、ラット腸上皮単層を48ウェルプレートに調製します。トランスフェクションは、70%〜80%のコンフルエントで実施する必要があります。トランスフェクションを行う前に、必ずウェル内の培地を 200 μL の新鮮な rIOM2D と交換してください。プラスミドDNAの260/280nmおよび260/230nmの吸光度比を計算します。良好なトランスフェクション結果を得るためには、これらを1.8以上にする必要があります。注:プラスミドコントロールを使用して、トランスフェクションの効率を計算します。蛍光タンパク質をコードするプラスミドは、簡便にするために推奨されます。このプロトコルでは、pLJM1-EGFP27 が使用されました。1 mg/mL の 20 kDa ポリエチレンイミン(PEI; 表3)。各ウェルについて、チューブA(プラスミド0.6 μg+還元血清培地50 μL)およびチューブB(PEI1.8 μL+還元血清培地50 μL)を調製します。DNA:PEI比を1:3に維持します。 両方のチューブを30秒間ボルテックスします。チューブAとチューブBを組み合わせ、再び30秒間ボルテックスします。必要に応じて、遠心分離機を使用してスピンダウンします。室温で20分間インキュベートします。 DNA/PEI複合体を2D単分子膜に滴下して静かに添加します。プレートを静かに渦巻かせて混ぜます。37°C、5%CO2でインキュベートします。この発現は通常、24時間後に検出できます。注:3Dオルガノイド構造に戻す必要がある場合は、トランスフェクション後48時間待ってから希釈したEMEを添加してください。 ラット腸管オルガノイドのレンチウイルス形質導入注意: レンチウイルスを使用する前に、教育機関から適切な承認と専門的なトレーニングを受けてください。レンチウイルスを取り扱うときは、常に適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。ここでは説明しませんが、オルガノイドの感染を成功させるには、高品質で濃縮されたレンチウイルスが不可欠です。このプロトコルは、空のpLJM1-EGFPベクターを利用しました27 可溶性GFPを発現する。このプロトコルは、以前に公開されたプロトコルから変更されています28.形質導入効率は、ウイルス粒子の品質と濃度、オルガノイドの小細胞クラスターへの効率的な解離、および発現する遺伝子に依存します。感染後5日で計算すると、選択前の平均形質導入効率は19.4%(±標準偏差6.5%)でした。レンチウイルス感染の 2 日前に、形質導入されるレンチウイルスごとに 24 ウェルプレートの 2 つの高密度ウェルを継代 (セクション 3) することを計画します。24ウェルプレートの各ウェルは、EMEの50 μLドームを1つ収容できます。 EMEが固まったら、0.5 mLのrIOMを添加し、10 mMのニコチンアミド、10 μMのY27632、および2.5 μMのCHIR99021を添加します。これにより、大きなスフェロイド形態が誘導され、レンチウイルス形質導入の効率に有利になります。プレーティング後2日以内に、ラットオルガノイドは大きなスフェロイドになります。有意な分化(すなわち、出芽)が観察された場合は、オルガノイドを再継代します。 濃縮されたウイルスを氷上で解凍します。 表3に従って、新鮮な形質導入培地を調製します。 P1000チップを使用して、ピペッティングで上下に動かし、細胞培養皿の底部からEMEドームを培地に放出します。ピペットで上下に20回続けてEMEを分解し、オルガノイドを放出します。 オルガノイドと培地を15 mLのコニカルチューブにピペットで移します。オルガノイドが同じ遺伝子型を持ち、同じ系統に由来する場合、すべてのウェルを一緒にプールすることができます。 各ウェルを1 mLの冷たいAdDMEM+で2回洗浄します。AdDMEM+ を回収し、同じ 15 mL コニカルチューブに移します。 ガラス製のパスツールピペットを使用して、ラットオルガノイドを機械的に破壊します。これは、細胞の小さな多細胞クラスターを目的としているため、重要なステップです。ピペットで上下に~30回。4倍の対物レンズを使用して、顕微鏡下で破壊の効率を確認します。細胞懸濁液が主に細胞クラスターで構成され、オルガノイドがほとんど残っていないまで、このプロセスを続けます。注:あるいは、オルガノイドを室温で 200 x g で 5 分間遠心分離し、上清を慎重に除去し、組織培養インキュベーターで 37 °C に予熱した従来のトリプシン/EDTA に代わる 1 mL の組換え酵素に再懸濁することもできます。オルガノイドをトリプシン置換液中で37°Cのウォーターバス中で2分間インキュベートし、定期的にボルテックスして解離を促進します。トリプシン置換による長時間のインキュベーションは、細胞死を促進する可能性があるため、避けてください。4倍の対物レンズを使用して、顕微鏡下で破壊の効率を定期的にチェックします。懸濁液が主に単一細胞で構成されており、細胞培養回数が少ない場合は、4 mLのAdDMEM+を添加してトリプシン置換を希釈し、次の手順に進みます。 細胞クラスターを含む 15 mL のコニカルチューブを 200 x g で 4 °C で 5 分間回転させます。 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に取り除いて廃棄します。 細胞クラスターをウェルあたり230 μLの形質導入培地に再懸濁し、感染させます。感染には、レンチウイルスごとに48ウェルプレートのウェルを1つ使用します。 230 μL の細胞懸濁液を標識 48 ウェルプレートの各ウェルにプレーティングします。各ウェルに20μLの濃縮ウイルスを加えます。P1000チップを使用して、各ウェルでウイルス/細胞溶液を混合し、プレートを透明フィルムで密封します。 脊椎置換を行う:プレートを600 x g で32°Cで1時間遠心分離します。 プレートを開封し、37°C、5% CO2 で6時間インキュベートします。 24ウェルプレートを37°Cのインキュベーターで予熱します。 インキュベーション後、各ウェルを上下にピペットで移し、内容物をラベル付きの1.5 mLチューブに移します。各ウェルを750 μLのAdDMEM+で洗浄し、チューブに移します。チューブを600 x g で4°Cで5分間回転させます。 遠心分離機からチューブを取り出し、氷上に保管します。P1000チップを使用して、上清を慎重に取り除き、適切に廃棄します。 細胞ペレットをEMEに再懸濁し、予熱した24ウェルプレートに50 μLのドームを播種します。EMEが重合するまで37°Cで15〜20分間インキュベートします。 各ウェルに、10 mM ニコチンアミド、10 μM Y27632、2.5 μM CHIR99021を添加した 500 μL の rIOM を加えます。 感染の1日後に培地をrIOMプラス10μM Y27632と交換します。2〜3日ごとにメディアを交換してください。選択が行われる場合は、感染後48〜72時間で選択を追加します。.ピューロマイシンの選択には、2 μg/mL のピューロマイシンを使用します。 7. オルガノイドの免疫蛍光全マウント染色 培地を吸引し、PBS-Tween 20(PBS-T)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)(表3)を細胞培養皿内のオルガノイドに添加します。室温で10分間インキュベートします。 ピペッティングで上下に動かして、オルガノイドをEMEから放出します。オルガノイドを0.75 mLチューブに集めます。オルガノイドは、数分以内に重力によってチューブの底に沈殿します。必要に応じて、100 x g で1分間遠心分離します。 トランスファーピペットを使用してPFAを除去し、オルガノイドをPBS-Tに再懸濁します。オルガノイドをチューブの底に沈殿させます。PBS-Tを除去し、200 μLのブロック溶液に再懸濁します(表3)。 ロッカーまたはダイテーターで室温で45分間インキュベートします。オルガノイドは凝集してチューブの底に沈殿することがあります。定期的にチューブを指でフリックして再懸濁し、溶液全体に分散させます。 オルガノイドをチューブの底に沈殿させます。必要に応じて、100 x g で1分間遠心分離します。ブロック溶液を除去します。 100 μLのブロック溶液で希釈した一次抗体を添加します。ナテーティングミキサーで室温で24rpmで45分間インキュベートします。抗体濃度は、使用する抗体によって異なります。注:このステップは、一次抗体に基づいて、4°Cで一晩まで延長できます。 オルガノイドをチューブの底に沈殿させます。必要に応じて、100 x g で1分間遠心分離します。 トランスファーピペットを使用してPBS-Tで5回洗浄します。24rpmのニューテーティングミキサーで室温で5分間インキュベートします。この手順を 2 回繰り返します。 1:200に希釈した二次抗体と、100 μLのブロック溶液で希釈した4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)50 μg/mLを加えます。ナテーティングミキサーで室温で24rpmで30分間インキュベートします。 オルガノイドをチューブの底に沈殿させます。必要に応じて、100 x g で1分間遠心分離します。二次抗体を除去します。トランスファーピペットを使用してPBS-Tで5回洗浄します。 室温で24rpmのニューテーティングミキサーで5分間インキュベートします。洗浄手順を2回繰り返します。 オルガノイドを洗浄している間に、VALAPシーラント(表3)のアリコートを40〜50°Cで加熱して液化します。絵筆を使って、カバーガラスほどの大きさの顕微鏡スライドにVALAPの薄い正方形を描きます。22 mm x 22 mm の No. 1.5 カバーガラスを使用します。 ハサミを使用して、P200ピペットチップの端を切ります。オルガノイドをスライド上のVALAPウェルに移します。ティッシュワイプを使用して、PBS-Tを慎重に吸い取ります。オルガノイドを乾燥させないでください。 VALAP ウェルに褪色防止用封入剤を浸水させます(表 3)。~22 mm x 22 mmの正方形の場合、これには100〜150 μLの褪色防止剤が必要です。 オルガノイドはクラスター化することができます。必要に応じて、ピペットチップで褪色防止剤を渦巻き、オルガノイドを再分配します。22 mm x 22 mm No. 1.5カバーガラスで取り付け、気泡を避けます。VALAPの薄層を端に塗ってカバーガラスを密封します。注:倒立顕微鏡の場合、オルガノイドは35 mmのガラス底ディッシュに取り付けることもできます。 8. フォルスコリンによるラット腸管オルガノイドの腫脹 rIOMで継代した後、3〜5日間オルガノイドを増殖させます。オルガノイドは24ウェルプレートで増殖させ、同じ領域を簡単に再イメージングできるようにすることをお勧めします。フォルスコリン(T0)を添加する前の画像をキャプチャします。 フォルスコリン(表3)をオルガノイド培地に直接添加し、最終濃度を10 μMにします。 同量のジメチルスルホキシド(DMSO)をコントロールウェルに添加します。 コントロールウェルとフォルスコリン処理ウェルを15〜30分ごとに定期的に画像化します。イメージングを行わないときは、オルガノイドをインキュベーターに保管するか、インキュベーションで制御されたイメージングシステムを使用してください。最大腫れは120分で観察する必要があります。. 標準的なプロトコルに従って、取得した画像から相対的な腫れを計算します29。