Integrierte photoakustische, Ultraschall- und Angiographietomographie (PAUSAT) für die nicht-invasive Ganzhirnbildgebung des ischämischen Schlaganfalls
Summary
Diese Arbeit demonstriert den Einsatz einer multimodalen ultraschallbasierten Bildgebungsplattform für die nicht-invasive Bildgebung des ischämischen Schlaganfalls. Dieses System ermöglicht die Quantifizierung der Sauerstoffsättigung des Blutes durch photoakustische Bildgebung und die Beeinträchtigung der Durchblutung im Gehirn durch akustische Angiographie.
Abstract
Hier wird eine experimentelle ischämische Schlaganfallstudie vorgestellt, bei der unser neu entwickeltes nicht-invasives Bildgebungssystem verwendet wird, das drei akustische Bildgebungstechnologien integriert: photoakustische Bildgebung, Ultraschall und angiographische Tomographie (PAUSAT). Die Kombination dieser drei Modalitäten hilft bei der multispektralen photoakustischen Tomographie (PAT) der Sauerstoffversorgung des Gehirns, der Hochfrequenz-Ultraschallbildgebung des Hirngewebes und der akustischen Angiographie der zerebralen Blutdurchblutung. Die multimodale Bildgebungsplattform ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen der zerebralen Perfusion und Sauerstoffversorgung im gesamten Mäusegehirn nach einem Schlaganfall. Es wurden zwei häufig verwendete ischämische Schlaganfallmodelle evaluiert: das Modell des permanenten Verschlusses der mittleren Hirnarterie (pMCAO) und das Modell der Photothrombose (PT). PAUSAT wurde verwendet, um die gleichen Mäusegehirne vor und nach einem Schlaganfall abzubilden und beide Schlaganfallmodelle quantitativ zu analysieren. Dieses bildgebende System war in der Lage, die Gefäßveränderungen des Gehirns nach ischämischem Schlaganfall deutlich darzustellen, einschließlich einer signifikant reduzierten Durchblutung und Sauerstoffversorgung in der Schlaganfall-Infarktregion (ipsilateral) im Vergleich zum unverletzten Gewebe (kontralateral). Die Ergebnisse wurden sowohl durch Laser-Speckle-Kontrast-Imaging als auch durch Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung bestätigt. Des Weiteren wurde das Schlaganfall-Infarktvolumen in beiden Schlaganfallmodellen gemessen und mittels TTC-Färbung als Ground Truth validiert. Durch diese Studie haben wir gezeigt, dass PAUSAT ein leistungsfähiges Werkzeug in nicht-invasiven und longitudinalen präklinischen Studien zum ischämischen Schlaganfall sein kann.
Introduction
Das Blut transportiert Sauerstoff (über das Hämoglobin-Protein) und andere wichtige Nährstoffe in das Gewebe unseres Körpers. Wenn der Blutfluss durch das Gewebe unterbrochen ist (Ischämie), kann es zu schweren Gewebeschäden kommen, deren unmittelbarste Auswirkungen auf Sauerstoffmangel (Hypoxie) zurückzuführen sind. Ein ischämischer Schlaganfall ist das Ergebnis einer unterbrochenen Durchblutung einer bestimmten Region des Gehirns. Die Hirnschädigung infolge eines ischämischen Schlaganfalls kann innerhalb von Minuten nach einem Gefäßverschluss auftreten und oft schwächende und dauerhafte Auswirkungen haben 1,2. Eine sehr wertvolle Strategie, um die Physiopathologie nach einem ischämischen Schlaganfall zu bewerten und neue Behandlungen zu identifizieren und zu testen, ist die Verwendung von Kleintiermodellen im Labor. Die im Labor entdeckten Behandlungen sollen in die klinische Anwendung überführt werden und das Leben der Patienten verbessern. Die Verwendung von Tieren in der biomedizinischen Forschung muss jedoch sorgfältig nach den 3R-Prinzipien von Russell und Burch bewertet werden: Ersatz, Reduktion und Verfeinerung3. Ziel der Reduktionskomponente ist es, die Anzahl der Tiere zu reduzieren, ohne die Datenerhebung zu beeinträchtigen. Vor diesem Hintergrund bietet die Möglichkeit, die Läsionsentwicklung mittels nicht-invasiver Bildgebung longitudinal zu bewerten, einen großen Vorteil bei der Reduzierung der Anzahl der benötigten Tiere sowie bei der Maximierung der von jedem Tier erhaltenen Informationen4.
Die Photoakustische Tomographie (PAT) ist ein hybrides Bildgebungsverfahren, das optischen Absorptionskontrast mit räumlicher Auflösung der Ultraschallbildgebung kombiniert5. Der Bildgebungsmechanismus von PAT ist wie folgt. Ein Anregungslaserpuls wird auf das abgebildete Ziel gerichtet. Unter der Annahme, dass das Target Licht mit der Wellenlänge des Anregungslasers absorbiert, steigt die Temperatur an. Dieser schnelle Temperaturanstieg führt zu einer thermoelastischen Ausdehnung des Targets. Die Ausdehnung bewirkt, dass sich eine Ultraschallwelle vom Ziel ausbreitet. Durch die Detektion der Ultraschallwelle an vielen Positionen kann die Zeit, die die Welle benötigt, um sich vom Ziel zu den Detektoren auszubreiten, genutzt werden, um durch einen Rekonstruktionsalgorithmus ein Bild zu erstellen. Die Fähigkeit des PAT, die optische Absorption in tiefen Geweberegionen zu erkennen, unterscheidet PAT von der Ultraschallbildgebung, die die Grenzen unterschiedlicher akustischer Impedanzen von Geweben erkennt5. Im sichtbaren und nahen Infrarotspektrum sind die primären hochabsorbierenden Biomoleküle, die in Organismen reichlich vorhanden sind, Hämoglobin, Lipide, Melanin und Wasser7. Von besonderem Interesse bei der Erforschung des Schlaganfalls ist das Hämoglobin. Da Oxyhämoglobin und Desoxyhämoglobin unterschiedliche optische Absorptionsspektren aufweisen, kann PAT mit mehreren Anregungslaserwellenlängen verwendet werden, um die relative Konzentration der beiden Zustände des Proteins zu bestimmen. Dadurch kann die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins (sO2) oder die Sauerstoffsättigung des Blutes innerhalb und außerhalb der Infarktregion quantifiziert werden 8,9. Dies ist ein wichtiges Maß bei ischämischem Schlaganfall, da es den Sauerstoffgehalt im geschädigten Hirngewebe nach einer Ischämie anzeigen kann.
Die Akustische Angiographie (AA) ist ein kontrastmittelverstärktes Ultraschall-Bildgebungsverfahren, das besonders für die Darstellung der Morphologie der Gefäße in vivo geeignet ist 10. Die Methode beruht auf der Verwendung eines Zwei-Element-Wobbler-Schallkopfs (ein Niederfrequenzelement und ein Hochfrequenzelement) in Verbindung mit Mikrobläschen, die in das Kreislaufsystem des Bildgebenden injiziert werden. Das Niederfrequenzelement des Wandlers wird zum Senden mit der Resonanzfrequenz der Mikrobläschen (z. B. 2 MHz) verwendet, während das Hochfrequenzelement zum Empfang der superharmonischen Signale der Mikrobläschen (z. B. 26 MHz) verwendet wird. Wenn die Mikrobläschen mit einer Resonanzfrequenz angeregt werden, haben sie eine starke nichtlineare Reaktion, was zur Erzeugung von superharmonischen Signalen führt, die das umgebende Körpergewebe nicht erzeugt11. Durch den Empfang mit einem Hochfrequenzelement wird sichergestellt, dass nur die Mikroblasensignale detektiert werden. Da die Mikrobläschen auf die Blutgefäße beschränkt sind, entsteht ein angiographisches Bild der Morphologie der Blutgefäße. AA ist eine leistungsstarke Methode zur Darstellung eines ischämischen Schlaganfalls, da die Mikrobläschen, die durch das Kreislaufsystem fließen, nicht durch verstopfte Gefäße fließen können. Auf diese Weise kann AA Regionen des Gehirns erkennen, die aufgrund eines ischämischen Schlaganfalls nicht durchblutet sind, was auf die Infarktregion hinweist.
Die präklinische ischämische Schlaganfallforschung stützt sich in der Regel auf den Einsatz von Histologie und Verhaltenstests, um die Lokalisation und den Schweregrad des Schlaganfalls zu beurteilen. Die Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung ist eine gängige histologische Analyse, die zur Bestimmung des Schlaganfall-Infarktvolumens verwendet wird. Es kann jedoch nur an einem Endpunkt verwendet werden, da das Tier eingeschläfert werden muss12. Verhaltenstests können verwendet werden, um eine Beeinträchtigung der motorischen Funktion zu mehreren Zeitpunkten zu bestimmen, aber sie können keine quantitativen anatomischen oder physiologischen Werte liefern13. Die biomedizinische Bildgebung bietet einen eher quantitativen Ansatz, um die Auswirkungen eines ischämischen Schlaganfalls nichtinvasiv und longitudinal zu untersuchen 9,14,15. Bestehende bildgebende Verfahren (z. B. Magnetresonanztomographie [MRT]) bei Kleintieren können jedoch mit hohen Kosten verbunden sein, nicht in der Lage sein, gleichzeitig strukturelle und funktionelle Informationen zu liefern, oder eine begrenzte Eindringtiefe aufweisen (wie die meisten optischen Bildgebungsverfahren).
Hier kombinieren wir photoakustische, Ultraschall- und angiographische Tomographie (PAUSAT; siehe Systemdiagramm in Abbildung 1), was komplementäre strukturelle und funktionelle Informationen über die Durchblutung und Oxygenierung nach ischämischem Schlaganfall ermöglicht16. Dies sind zwei wichtige Aspekte bei der Beurteilung des Schweregrads der Verletzung und der Überwachung der Genesung oder des Ansprechens auf Behandlungen. Durch den Einsatz dieser integrierten Bildgebungsverfahren kann die Menge an Informationen, die von jedem Tier gewonnen werden, erhöht werden, wodurch die Anzahl der benötigten Tiere verringert wird und mehr Informationen über die Untersuchung potenzieller Behandlungen für ischämische Schlaganfälle bereitgestellt werden.
Abbildung 1: PAUSAT-Diagramm . (A) Vollständiger Schaltplan des PAUSAT-Systems, einschließlich des Lasers und des OPO, die für PAT verwendet werden. (B) Innenansicht des PAUSAT-Systems, einschließlich zweier Ultraschallwandler. Der Dual-Element-Wobbler-Schallkopf wird sowohl für B-Mode-Ultraschall als auch für AA verwendet, und der Linear-Array-Schallkopf wird für PAT verwendet. Beide Wandler sind auf demselben motorisierten 2D-Tisch montiert, was eine Abtastung zur Erzeugung volumetrischer Daten ermöglicht. Diese Zahl wurde von16 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt einige wichtige Aspekte dieser Methode, die, wenn sie falsch durchgeführt werden, zu einer erheblichen Verringerung der Bildqualität und der quantitativen Analyse führen können. Das am häufigsten auftretende Ergebnis von Benutzerfehlern in PAUSAT-Bildern ist entweder ein fehlendes Signal oder eine sehr geringe Signalstärke, die beide aus verschiedenen Gründen auftreten können. Ein Grund dafür ist ein Problem mit der akustischen Kopplung. Große Luftblasen im Wasser, das den Kopf der Maus während der Bil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei dem Ingenieurteam von SonoVol Inc. für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch den American Heart Association Collaborative Sciences Award (18CSA34080277) an J. Yao und W. Yang gesponsert; Die National Institutes of Health (NIH) der Vereinigten Staaten gewähren R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN-Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; Der CAREER-Preis der United States National Science Foundation (NSF) 2144788; der Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178) an J. Yao; und NIH gewährt W. Yang R21NS127163 und R01NS099590.
Materials
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
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