מדידות פיזור ראמאן משופרות על פני השטח של מולקולה אחת המופעלות על ידי ננו-אנטנות אוריגמי DNA פלסמוני

1. הרכבת מזלג אוריגמי DNA הרכבה עצמית של מבנה האוריגמי DNA בסיר אחד. ראשית, הוסף גדיל פיגום עגול M13mp18 של 2.5 ננומטר (7,249 נוקלאוטידים, ראה טבלת חומרים) ו-100 ננומטר של 201 אוליגונוקלאוטידים קצרים (טבלה 1) ב-1x TAE (tris[hydroxymethyl]aminomethane [tris], חומצה אצטית, אתילאנדיאמין חומצה אצטית [EDTA]) בתוספת חיץ15 mM MgCl 2. לאחר מכן, התאם את הנפח הכולל ל -100 μL באמצעות מים טהורים במיוחד. אנאל את התמיסה לאחר מכן על ידי שיפוע טמפרטורה ב thermocycler, תחילה על ידי חימום מהיר ל 80 ° C, ולאחר מכן על ידי קירור מ 80 ° C ל 20 ° C ב 1 ° C / 12 דקות, ולאחר מכן מ 20 ° C ל 16 ° C ב 1 ° C / 6 דקות, ולאחר מכן קירור מהיר מ 16 ° C ל 8 ° C. השתמש במסנני Amicon של 100 kDa לחיתוך משקל מולקולרי (MWCO) (ראה טבלת חומרים) כדי לטהר את התערובת מעודפי סיכות.הוסף 100 μL של תמיסת אוריגמי DNA למסנני Amicon, כמו גם 400 μL של מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 6,000 x גרם במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השליכו את המסנן על ידי הסרת המסנן והפיכת הצינור כדי להסיר את השטיפה בכיור, ולאחר מכן הוסיפו שוב 400 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד למסנן ולצנטריפוגה. חזור על שלב זה פעם נוספת. כדי לאסוף את תמיסת הננו-מבנה המטוהר, הפוך את המסנן בצינור ובצנטריפוגה חדשים (1,000 x גרם, 2 דקות, RT) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). פתרון זה ניתן לאחסן במקרר ב 8 ° C עד 2 שבועות.הערה: יש להשתמש במאגר TAE 1x או 1x TAE בתוספת חיץ 15 mM MgCl2 במקום מים טהורים במיוחד לשלב טיהור מסנן Amicon, מכיוון שמים מפחיתים את היציבות ומורידים את ריכוז מזלגות האוריגמי של ה- DNA המתקבלים. למדידת מולקולת צבע יחידה, תערובת גדילי סיכות הדנ”א מוחלפת בתערובת גדילים שונה המכילה צבע TAMRA בקצה 5 אינץ’. גדיל שונה זה נמצא באמצע גשר ננו-מזלג (טבלה 2). 2. ציפוי ננו-חלקיקי זהב (AuNP) הערה: גרסה שונה של פרוטוקול Liu et al.23 שימשה לציפוי AuNPs, ותהליך הציפוי כלל הקפאת תמיסת AuNP-DNA. צנטריפוגה (3,500 x גרם, 5 דקות, RT) 400 μL של תמיסת AuNP בקוטר 60 ננומטר (מתקבלת מסחרית; ראה טבלת חומרים), ובאמצעות פיפטה, להסיר את supernatant. לאחר מכן, resolubilize את הגלולה ב 25 μL של מים טהורים במיוחד. הריכוז הסופי של AuNPs הוא ~ 0.3 nM. הוסף 1 μL של 100 mM תמיסת tris-(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) ל-4 μL של DNA מהונדס בתיול (100 μM כפי שסופק על-ידי היצרן; ראה טבלת חומרים) ודגור במשך 10 דקות ב-RT. לאחר הדגירה, מוסיפים את תערובת 5 μL לתמיסת AuNP המרוכזת (שלב 2.1), מערבולות למשך 5 שניות, ומקפיאים למשך שעתיים לפחות ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה ב-RT, צנטריפוגה (3,500 x גרם, 5 דקות, RT) את התערובת כדי להסיר את ה-DNA הציפוי שנוסף יתר על המידה. בעזרת פיפטה, להסיר את supernatant, ו reublize את הגלולה ב 10 μL של מים.הערה: ישנם שני גדילי ציפוי עבור כל אחד מה-AuNPs בננו-מזלג (טבלה 2). השלבים זהים למעט רצף גדיל ציפוי הדנ”א. ברגע שהחלקיקים מצופים, הם יציבים מאוד; הם יכולים להישאר כפי שהם במשך חודשים במקרר ואפילו ניתן להקפיא אותם. עבור AuNPs של צבע בציפוי מלא, גדילי ה- DNA המצפים הם בעלי צבע TAMRA פנימי. 3. הרכבה של דונה הוסף את תמיסת AuNP המצופה לתמיסת ננו-מזלג, עם יחס מולארי ריכוז של 1.5:1. הוסף את MgCl 2 לריכוז סופי של 4 mM באמצעות תמיסת מלאי MgCl2 של 50 mM. כוונן את הנפח הסופי ל- 20 μL באמצעות מים טהורים במיוחד. הכלאה של DONAs באמצעות שיפוע טמפרטורה בתרמוסייקלר. ראשית, יש לחמם במהירות ל-40°C, לאחר מכן לקרר מ-40°C עד 20°C ב-1°C/10 דקות, ולאחר מכן לקרר במהירות מ-20°C עד 8°C. 4. אלקטרופורזה ג’ל הערה: הננו-חלקיקים הבלתי קשורים בתמיסת DONA מוסרים על ידי אלקטרופורזה של ג’ל אגרוז. הכינו ג’ל אגרוז 1%. לשם כך, להמיס 0.8 גרם של agarose ב 80 מ”ל של 1x TAE בתוספת 5 mM MgCl2. הוסף 2.25 μL של מאגר העמסה (30% גליצרול, 13 mM MgCl 2; ראה טבלת חומרים) ל- 18 μL של תמיסת DONA כדי להגיע לריכוז סופי של 5 mM MgCl 2 מ- 4 mM בשלב3.2. מאגר ההעמסה גם מבטיח שהדגימה תישאר בתוך כיס הג’ל. הפעל את הג’ל במשך 60 דקות ב 70 V באמבט מי קרח. מאגר הריצה הוא 1x TAE בתוספת 5 mM MgCl2. גזרו את הרצועה המעניינת והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופיה עטופה בסרט פלסטיק פרפין, ולאחר מכן סחטו את התמיסה באמצעות שקופית מיקרוסקופית שנייה עטופה בסרט פלסטיק פרפין. בעזרת פיפטה, לאסוף את הנוזל סחוט לתוך צינור 500 μL. 5. קולוקליזציה של מדידות AFM ורמאן פלזמה לטפל שבב סיליקון (ראה טבלה של חומרים) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לדגור 10 μL של תמיסת DONA מטוהר בתוספת 10 μL של 100 mM MgCl2 על השבב במשך 3 שעות. לאחר מכן, שטפו את השבב פעמיים בתערובת של 1:1 (לפי נפח) של אתנול ומים וייבשו במכה עם אוויר דחוס. לאחר מכן, הדביקו את השבב על דיסק מגנטי והכניסו אותו למכשיר להדמיה.הערה: לפני תחילת המדידות, המיקום של לייזר עירור ראמאן מותאם להיות על גבי קצה הבדיקה AFM. בעבודה הנוכחית נעשה שימוש במיקרוסקופ HORIBA LabRAM HR Evolution Raman המשולב ל-HORIBA Omegascope AFM. המכשיר נשלט באמצעות התוכנה LabSpec ו-AIST. למדידת AFM, השתמש במצב הקשה (מצב AC) עם עצות ACCESS-NC-A (תדר תהודה: 300 kHz; קבוע קפיץ: 45 N/m)24. מצב AC שולט אוטומטית בכל הפרמטרים, למעט קצב הסריקה, המוגדר ל- 1 הרץ.הערה: לאחר הדמיית AFM, קצה ה-AFM נסוג כך שהוא לא נמצא בנתיב של לייזר הרמאן. זה נעשה באמצעות פונקציית מאקרו, “בדיקה משם”, מתוכנת במערכת. בדרך זו, עבור כל נקודה שנבחרה בתמונת AFM, הלייזר יהיה באותו מיקום ללא היסט בהשוואה ל- AFM. בחר את אורך גל הלייזר הרצוי, הספק וזמן הצטברות למדידות ראמאן, שכן כל הפרמטרים הללו תלויים במדגם הנמדד.השתמש בפרמטרים שהוזכרו למדידת TAMRA AuNP בציפוי מלא: לייזר 633 ננומטר, הספק 100 μW וזמן אינטגרציה של 1 שניות. השתמש בפרמטרים שהוזכרו למדידת TAMRA יחידה: לייזר 633 ננומטר, הספק 400 μW וזמן אינטגרציה של 4 שניות. לאחר התאמת הפרמטרים, מקם את הסמן על גבי ה- DONA הרצוי בתמונת AFM; הפונקציה “העבר סמן” בתוכנה עושה זאת. לאחר מכן, התחל את מדידת הרמאן.הערה: ישנם מצבים שונים לרכישת הספקטרה: מדידה של נקודה אחת – מיפוי זמן חד-ממדי – שבו נקודה בודדת נמדדת לאורך זמן25; ומיפוי שטח XY דו-ממדי, שבו שלב ממונע מועבר מתחת ללייזר כדי לקבל ספקטרום ממערך של נקודות ברשת XY26.