共聚焦显微镜分析大鼠活骨骼肌纤维的线粒体密度和纵向分布

所有动物实验程序均由蒙特雷技术委员会动物使用和护理委员会 （CICUAL） 评估和批准（协议 2019-007）。本研究使用年龄在 12 至 13 周的雄性 Zucker（+/+ 和 fa/fa）大鼠。将动物饲养在标准饲养条件下（12小时/12小时光/暗循环，湿度40-60%），并可以随意获得食物（标准大鼠食物）和水。 1.溶液组成 通过混合 表1中所示的组分来制备新鲜的Relax溶液。使用氢氧化钠 （NaOH） 将 pH 值调节至 7.3。 使用用于确定游离金属浓度的模拟程序计算松弛溶液中的游离钙浓度。 在二甲基亚砜 （DMSO） 中制备 5 mM 四甲基罗丹明甲酯 （TMRE） 储备液，随后在 DMSO 中稀释 0.1 mM。 2.腓肠肌纤维束的解剖 将动物放入诱导室并盖上盖子。打开氧源，将气体流速设置为0.5 L/min，将蒸发器设置为4%七氟醚以诱导麻醉。 一旦大鼠睡着了，将其以仰卧位放在腔室外，同时保持麻醉。捏住脚趾或尾巴以验证是否缺乏反射。 用剪刀切开腹部的皮肤和肌肉。然后，切开胸廓以保持进入心脏。 要进行心脏切除术，请用镊子从最上面的静脉和动脉抓住心脏，然后用剪刀剪断血管。取出心脏。 安乐死后，立即用乙醇消毒后肢，然后使用剃须机剃须。 握住后足，用剪刀在跟腱水平的皮肤上切开一个切口。 用剪刀在胫骨近端水平剪断后肢。将其转移到含有 3 mL 冰冷 Relax 溶液的 60 mm 培养皿中，处于背部位置。用足够的溶液覆盖它，以防止肌肉变干。 识别跟腱，用镊子小心地将其抬起，然后用虹膜剪刀将肌肉从骨头上解剖。从解剖的这一步开始使用立体显微镜。 识别并分离整个腓肠肌，这是后肢后部的主要块。 用细尖镊子解剖并丢弃肌肉周围的结缔组织和脂肪组织。将肌肉的侧头转移到装有冰冷Relax溶液的新培养皿中（见 图2A）。 用镊子从一端轻轻握住肌肉，然后用微型剪刀小心地将其分成一束。始终用镊子轻轻地握住束的一端来操纵束。注意： 捆束长约 10 毫米，宽约 2 毫米。 将纤维束转移到装有 2 mL 冰冷 Relax 溶液的新培养皿中。只选择外观光滑、从一端到另一端完整且不缩短的（图 2B）。 3.通过共聚焦显微镜获取骨骼肌线粒体的活细胞成像 在室温下将纤维在 2.5 × 10-4 mM TMRE 的 Relax 溶液中孵育 20 分钟。注意：在TMRE的推荐工作浓度下，预计它处于非淬火模式。从现在开始避免暴露在光线下。 在孵育期间：打开共聚焦显微镜标准软件，选择配置框架，在硬件配置对话框中选择激光，勾选氦氖543选项。 在采集框架中，选择采集对话框，在采集模式下，选择“XYZ”面板。 在 XY 对话框中，选择 512 x 512 格式，400 Hz 速度，然后检查 针孔面板。在弹出的针孔对话框中，选择 “AU ”作为单位，并为针孔添加值“ 3 Airy ”。注意：如果有足够的荧光信号守恒，请考虑减小最接近 1 Airy 最佳标准的针孔尺寸。 在“ 光束路径设置 ”对话框中，选择20倍的水浸物镜和0.7（20倍/0.7 IMM）的数值孔径（NA），并选择576-700 nm的发射波长窗口。选择 DD488/543 和 15% 的激光功率作为 543 激光器。注意：强烈建议使用用于实时成像扫描的水浸物镜（如果有）。由于浸没培养基和孵育培养基的折射率相似。 孵育20分钟后，交换孵育培养基两次。确保在孵育后 20-30 分钟内获取共聚焦图像。 用 0.15 mm 硼硅酸盐玻璃盖玻片准备记录室。注意： 考虑到厚度通常在 0.15 到 0.22 毫米之间以获得最佳性能，请根据可用的记录室选择盖玻片的厚度。 向记录室中加入 200 μL Relax 溶液并转移纤维束。 在共聚焦显微镜中，使用明场模式来识别用于线粒体荧光记录的活纤维。活纤维是完整的，没有收缩，并且具有完整的条纹图案。 将纤维束彼此分开并用镊子对齐。选择最接近盖玻片的那些。 使用 实时按钮 扫描荧光，以在控制面板控制台中调整增益和偏移，考虑以下几点：为接近 0 任意单位 （A.U.） 的背景选择低荧光强度值。 选择介于 100 和 200 A.U 之间的增益级别以避免录音系统饱和。因此，不要记录最高的荧光水平。 选择 150-190 nm 的像素大小以获取光纤的全宽，并在 XY 对话框中调整缩放系数。注意：考虑使用更接近奈奎斯特标准 （90 nm） 的像素大小，这允许扫描光纤的整个宽度。 在 Z 堆栈对话框中，调整 Z 距离以采集从 15 μm 光纤深度（开始按钮）到 22 μm（结束按钮）的荧光信号。选择 3 μm 作为 Z 步长。 单击 “开始 ”按钮以获取共聚焦图像。获得由在 15、 18 和 21 μm 深度采集的三个共聚焦图像组成的 Z 堆栈。 4. 线粒体密度分析 在用于生物图像分析的开源平台18中，打开Z-stack文件并旋转图像以水平放置光纤，如 图3B所示。 随机选择一个感兴趣的矩形区域 （ROI），其中包括线粒体 （ROImito） 占据的区域。为 X 选择 ROImito 大小范围为 65 至 90 μm。对于 Y，尺寸将取决于光纤宽度，避免其外围。 复制具有选定 ROImito 的 Z 堆栈，并将其保存为 TIFF 格式的新 Z 堆栈 （Mito-stack）。使用 ROI 管理器工具保存在原始堆栈上选择的 ROImito 位置。 按如下方式计算背景减法的阈值：使用快捷 键 command+shift+t 打开“ 阈值 ”对话框。 选择阈值算法 Otsu |黑白 |深色背景 选项。观察图像现在已二值化。 在“阈值”对话框中，观察荧光强度分布的直方图和显示的 阈值 。注意：线粒体阳性像素的荧光强度值大于阈值，并在二值图像中显示为白色像素。 通过选择 Apply，将阈值应用于二进制映像堆栈。在弹出的 “将堆栈转换为二进制 ”对话框中，选择“ 计算每个图像的阈值”、“黑色背景”、“创建新堆栈”选项，然后单击 “确定”。 观察生成了包含三个二进制映像的堆栈 （BinDMito-stack）。 将其保存为 TIFF 格式。 计算 BinDMito堆 栈中的线粒体密度，如下所示：选择 “分析 ”菜单。接下来，单击 直方图。在弹出的直方图对话框中，单击 “是 ”，将堆栈的所有图像都包含进去分析。 在“ 堆栈直方 图”对话框中，单击 “列表 ”，获取直方图数据。将直方图数据传输到电子表格。 在电子表格中，识别值为 255 的 Mito 像素。使用公式（1）计算线粒体密度：线粒体密度 = × 100 （1）总像素在“直方图”对话框中标识为 N ，或通过在电子表格中对直方图的像素计数求和来计算。 要计算线粒体占据的面积 （μm2），请将 BinDMito 堆栈的线粒体像素乘以像素大小。 5. 快速傅里叶变换分析线粒体分布 在用于生物图像分析的开源平台中，打开 BinDMito 堆栈并绘制一个宽 256 像素、高 5 μm 的矩形 ROI。将一个 ROI 定位在中心位置，另一个定位在横向位置，如图 4A，B 所示。 使用 ROI 管理器工具配置 FFT 分析的 ROI 并保存。注意：根据分析的需要，可以在不同的位置选择其他ROI，并且可以修改其大小。然而，宽度必须等于 2n 像素才能执行 FFT（例如，128、256、512 像素）。 使用快捷 命令 + k 获取 ROI 的绘图配置文件，并将数据传输到电子表格。 在电子表格中，使用从绘图剖面图获得的数据填充 B 列和 C 列。 B 柱包含以 μm为单位的距离， C 柱包含荧光强度（A.U.）的相应灰度值。 D 列对应于 FFT 频率 （event/μm），其填充方式如下：计算采样频率（Fs）：Fs=1/Δ d，其中Δd是距离步长（B的第二个值）。 计算 Δ Fs：Δ Fs= Fs/N，其中 N 是 B 的数据点数 （256）。 计算FFT频率（S）的停止值： S = （N/2） ×ΔFs。 按如下方式填写 D 列：D 列的第一个值等于 0。 选择 D 列中的第二个单元格，转到主菜单，选择填充，然后单击系列。选择列。对于步长值，使用计算出的 Δ Fs。对于止损值，请使用计算出的 S。 接下来，用 FFT 复数值填充 E 列，如下所示：在 C 列的第一个单元格中插入 0，因为距离 0 必须与信号 0 重合才能计算 FFT。 然后，转到“数据”菜单，单击“数据分析”，然后选择“傅里叶分析”。 在新窗口中，为输入范围选择 C 列中描述的荧光信号的数据点范围。注意： 数据点数必须为 2n （例如，荧光信号的 256 或 128 个数据点）。 为输出范围选择 E 的相应范围。 选择 “确定” ，让 FFT 复数值自动填充。 用FFT幅度填充 F 列，如下所示：使用 IMABS 函数 从 E 中的复数返回 F 中的绝对值，然后乘以 2/N 进行归一化（等式 （2））：FFT 幅度 = （IM.ABS （E1…E n） × （2/n） （2） 使用 F 中的 FFT 幅度绘制 FFT 频谱，作为 D 中 FFT 频率的函数，直到 S. 找到最大峰值的点及其相应的 FFT 频率。 用公式（3）将最大峰值的FFT频率转换为距离。这个计算出的距离代表线粒体分布的纵向距离。距离 （μm） = 1/FFT 频率 （3）注意：由于 FFT 对称性，请勿绘制超过 S 值的 FFT 频率， 该 值对应于数据点的一半，避免 FFT 频谱重复。 6. 可选的预处理步骤，以减少图像分析前的图像噪声 应用中值滤波器或二维反卷积，如下所示：对于中值滤波器：选择 “流程”|”筛选器 ，然后单击 中位数 选项。 在弹出的“中位数”对话框中，选择“半径”为“2.0”，然后单击“确定”。选择 Yes （是） 将该过程应用于 Mito 堆栈中的所有映像。 观察图像中噪点的减少。 对于 2D 反卷积：生成理论点扩散函数 （PSF）。 下载插件PSF_Generator.jar并将文件放入“Plugins”文件夹中。 在PSF发生器对话框中，单击“Born & Wolf 3D光学模型”选项，输入共聚焦扫描期间使用的“折射率浸入值1.33”，然后为“精度计算”选项选择“最佳”。 捕获 576 nm 的发射波长，使用的物镜的 NA 为 0.7，Z 步长为 3,000 nm。 捕获要去卷积的共聚焦图像的像素 大小XY ，以及表示X和Y像素数以及Z步数的大小 XYZ （此协议为3 ）。 在 PSF 生成器的“显示”菜单中，单击选项“线性”，选择“8 位分辨率”，然后选择查找表 （LUT） 的“灰色”选项。 运行 PSF 生成器 并保存以 TIFF 格式创建的理论 PSF。 对通过打开位于“图像”菜单中的“堆栈”选项的“Z 项目”工具创建的 PSF 切片求和。 在弹出的“投影”对话框中，选择“投影类型求和切片”，然后单击“确定”。以 TIFF 格式保存新的 PSF。注意：可以使用通过共聚焦扫描获得的具有已知直径的荧光微珠实验获得的 PSF 代替理论上的 PSF。 下载插件“DeconvolutionLab_2.jar”19 并将其放入插件文件夹中。 单击菜单 插件。接下来，单击 DeconvolutionLab2。 使用工具将共聚焦图像与 Mito 堆栈分离 图像堆叠 从位于 图像 菜单中的 堆栈 选项 选项，并将其保存为 TIFF 格式。 在 DeconvolutionLab2 对话框中，选择从 Mito 堆栈获取的映像之一。选择创建的理论 PSF，然后选择具有 15 次迭代的算法 Richardson-Lucy。 运行 DeconvolutionLab2，验证图像中的信号改善和降噪，并将其保存为 TIFF 格式。 继续执行步骤 4.4 进行图像分析。 对于去卷积图像的阈值，请在阈值过程中将其转换为 8 位掩码。通过在“图像”菜单的“堆栈”工具中选择“要堆叠的图像”，使用二进制和反卷积图像创建堆栈。 对于去卷积图像的 FFT 分析，绘图剖面包含以像素为单位的距离。将像素单位转换为 μm ，如下所示：在电子表格中，完成步骤 5.4 后，将数据从 B 传输到 A。接下来，通过将 A 的每个像素数乘以像素大小，用以 μm 为单位的距离填充 B。