JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

نموذج فأر للتوعي القرني عن طريق الحرق القلوي

Published: June 30, 2023
doi:
10.3791/65289
, , ,
1Cullen Eye Institute, Department of Ophthalmology,Baylor College of Medicine

Summary

يركز هذا البروتوكول على الأوعية الدموية القرنية الجديدة الناجمة عن الحرق القلوي في الفئران. تولد هذه الطريقة نموذجا لأمراض القرنية يمكن استنساخه ويمكن السيطرة عليه لدراسة تكوين الأوعية المرضية والآليات الجزيئية المرتبطة بها واختبار العوامل الدوائية الجديدة لمنع الأوعية الدموية الجديدة للقرنية.

Abstract

الأوعية الدموية القرنية (CoNV) ، وهو شكل مرضي من تكوين الأوعية الدموية ، ينطوي على نمو الأوعية الدموية والليمفاوية في القرنية اللاوعائية من الحافة ويؤثر سلبا على الشفافية والرؤية. الحرق القلوي هو أحد أكثر أشكال الصدمات العينية شيوعا التي تؤدي إلى CoNV. في هذا البروتوكول ، يتم تحفيز CoNV تجريبيا باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم بطريقة خاضعة للرقابة لضمان التكاثر. يعد نموذج الحرق القلوي مفيدا لفهم أمراض CoNV ويمكن توسيعه لدراسة تكوين الأوعية بشكل عام بسبب الأوعية الدموية والشفافية وإمكانية الوصول إلى القرنية. في هذا العمل ، تم تحليل CoNV عن طريق الفحص المباشر تحت مجهر تشريح وعن طريق تلطيخ القرنيات المسطحة باستخدام مضاد CD31 mAb. تم الكشف عن تكوين الأوعية اللمفاوية على القرنيات المسطحة عن طريق التلوين المناعي باستخدام مضاد LYVE-1 mAb. تم تصور وذمة القرنية وقياسها باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). باختصار ، سيساعد هذا النموذج على تطوير فحوصات الأوعية الدموية الحديثة الحالية واكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة لتكوين الأوعية الدموية المرضية للعين وخارج العين.

Introduction

القرنية هي نسيج لاوعائي يحافظ على شفافيته من خلال إنشاء امتياز وعائي 1,2. يمكن أن يؤدي تلف القرنية إلى التهاب وتطور الأوعية الدموية والليمفاوية ، وكذلك التليف3. يؤدي الأوعية الدموية القرنية (CoNV) إلى ضعف البصر وهو السبب الرئيسي الثاني للعمى في جميع أنحاء العالم4. يؤثر CoNV على حوالي 1.4 مليون شخص في الولايات المتحدة سنويا5. يمكن أن يحدث CoNV بعوامل مختلفة ، بما في ذلك الحروق الكيميائية والالتهابات والالتهابات ونقص الأكسجة 3,6. الحروق الكيميائية هي واحدة من أكثر حالات الطوارئ العينية شيوعا ، وهي تمثل حوالي 13.2٪ من إصابات العين وتتطلب تقييما وعلاجا فوريا7. يمكن أن تكون الحروق الكيميائية حروقا قلوية أو حمضية ، لكن الحروق القلوية تسبب إصابة أكثر شدة ، حيث تخترق القلويات أعمق في الأنسجة8.

تستخدم نماذج الفئران من حرق القلويات على نطاق واسع لدراسة CoNV والتئام الجروح. بالمقارنة مع نموذج تكوين الأوعية الدموية في جيب القرنية 9,10 ، فإن نماذج الحرق القلوي سهلة نسبيا ويمكن استخدامها أيضا لدراسة التهاب القرنية والتليف والانتشار الظهاري. ترتبط هذه النماذج أيضا ارتباطا وثيقا بالحروق الكيميائية السريرية أكثر من نماذج خياطة القرنية لتكوين الأوعيةالدموية 11. مع الحرق القلوي ، تطور القرنية اللاوعائية الأوعية الدموية بسبب الالتهاب وعدم التوازن في العوامل المضادة لتولد الأوعيةالدموية والمؤيدة لتولد الأوعية 1,2. تتمثل عيوب نماذج حرق القرنية القلوي في الصعوبات في التحكم في منطقة وشدة الحرق القلوي ، والتباين في الأوعية الدموية الجديدة للقرنية ، والحرق غير المقصود للأنسجة المجاورة بسبب المحلول القلوي الزائد. الغرض من هذه الدراسة هو وصف نموذج حرق قلوي للقرنية متحكم فيه في الفئران باستخدام ورق ترشيح منقوع مسبقا في محلول هيدروكسيد الصوديوم. يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة العوامل الوعائية ، والكواشف العلاجية المضادة لتولد الأوعية ، وغيرها من العوامل والكواشف التي يمكن أن تعدل الالتهاب والتليف.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية ، بما في ذلك الإجراءات التجريبية والقتل الرحيم ، من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في كلية بايلور للطب برقم البروتوكول AN-8790. 1. تحضير 1 N هيدروكسيد الصوديوم أضف 4 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بوزن 400 مجم من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، وأضفه إلى الأنبوب بعناية. قم بإذابة هيدروكسيد الصوديوم عن طريق تحريك المحلول ببطء باستخدام قضيب زجاجي. قم بتكوين الحجم إلى 10 مل عن طريق إضافة ماء منزوع الأيونات معقم إلى الأنبوب ، واخلطه مرة أخرى عن طريق قلب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل. أغلق الغطاء بإحكام ، وقم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد المحلول الطازج كل شهر لأن تركيز محلول NaOH قد ينخفض عن طريق امتصاص المحلول لثاني أكسيد الكربون في الهواء. امزج دائما محلول هيدروكسيد الصوديوم برفق قبل الاستخدام.تنبيه: قم بإعداد المحلول داخل غطاء كيميائي ، وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE). 2. تحضير محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) أضف 30 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى دورق زجاجي. قم بوزن 4 جم من بارافورمالدهيد (PFA) ، وأضفه إلى الدورق. احتفظ بالكأس على طبق ساخن على حرارة 60 درجة مئوية مع التحريك. أضف محلول 1 N NaOH بالتنقيط لرفع الأس الهيدروجيني حتى يزول المحلول. تحقق واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 N حمض الهيدروكلوريك (HCl). اضبط مستوى الصوت النهائي على 50 مل باستخدام 1x PBS. تبريد وتصفية الحل. يخزن المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية.تنبيه: قم بإعداد المحلول في غطاء دخان أثناء ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. 3. تحضير كوكتيل الكيتامين / الزيلازين قم بإعداد كوكتيل الكيتامين / الزيلازين بإضافة 0.8 مل من الكيتامين (تركيز المخزون: 100 مجم / مل) و 0.16 مل من الزيلازين (تركيز المخزون: 100 مجم / مل) إلى 9.4 مل من المحلول الملحي. قم بتخزين الكوكتيل في زجاجات حقن معقمة في درجة حرارة الغرفة (RT). 4. حرق القلويات على القرنية الماوس حقن ميلوكسيكام (4-6 ملغ/كغ من وزن الجسم) تحت الجلد قبل 30 دقيقة من الإجراء لتخفيف الآلام. تخدير الفئران (C57BL/6J، 6-8 أسابيع من العمر، ذكر) باستخدام حقنة i.p. من كوكتيل الكيتامين/الزيلازين (الكيتامين 80 ملغم/كغم والزيلازين 16 ملغم/كغم من وزن الجسم). تحقق من استجابة الانعكاس (سحب الدواسة) عن طريق الضغط على أصابع الماوس ، وتأكد من عدم وجود المنعكس. ضع قطرة واحدة من المخدر الموضعي ، 0.5٪ بروباراكائين ، على سطح القرنية في عين واحدة ، وقطرة من الدموع الاصطناعية على العين الأخرى. باستخدام لكمة خزعة 2 مم ، قم بإخراج أقراص ورق الترشيح Whatman. أضف 2 ميكرولتر من 1N NaOH إلى طبق بتري نظيف. ضع قرص ورق الترشيح مقاس 2 مم على قطرة 1 N NaOH ، واتركه ينقع لمدة 15 ثانية. التقط ورق الترشيح بالملقط ، وضع ورق الترشيح على العين المعالجة بالبروباراكايين في وسط القرنية لمدة 30 ثانية.ملاحظة: يجب أن يلامس ورق الترشيح مركز القرنية فقط ، ويجب توخي الحذر لتجنب حركة ورق الترشيح بمجرد وضعه ، لأن تحريك ورق الترشيح يمكن أن يسبب حروقا في الأنسجة المجاورة. اغسل العين عن طريق التنظيف ب 20 مل من محلول ملحي معقم في حقنة معقمة.ملاحظة: يجب توخي الحذر لضمان غسل القرنية ، جنبا إلى جنب مع كيس الملتحمة ، جيدا لضمان عدم حدوث مزيد من الضرر للقرنية أو الأنسجة المحيطة. غسل كيس الملتحمة سيمنع سيمبلفارون. امسح المحلول الملحي الزائد برفق عن العينين والمنطقة المحيطة باستخدام مناديل ناعمة يمكن التخلص منها. بعد ذلك ، احتفظ بالفئران في قفص التعافي على وسادة تدفئة دافئة حتى تصبح متنقلة.ملاحظة: تتم مراقبة الفئران يوميا بعد حرق القلويات لمدة 3 أيام. إذا لوحظت أعراض الألم أو الإجهاد ، يتم إعطاء ميلوكسيكام (4-6 ملغ / كغ من وزن الجسم) تحت الجلد. 5. فحص وتقييم الأوعية الدموية الجديدة والعتامة في الفئران المخدرة ، افحص العينين تحت مجهر التشريح في اليوم 10 بعد الحرق ، واحصل على صور باستخدام كاميرا متصلة بمنظار التشريح لتسجيل العتامة والأوعية الدموية الجديدة.ملاحظة: يكفي إجراء منظار تشريح منتظم مزود بكاميرا. أثناء مراقبة القرنية من خلال مجهر التشريح ، قم بتسجيل العتامة بعد الحرق بناء على المقياس التالي12:0 = لا عتامة ؛ القرنية واضحة1 = عتامة خفيفة ؛ ضبابية طفيفة في مناطق القزحية والتلاميذ ؛ القزحية والتلميذ مرئية بسهولة2 = عتامة معتدلة ؛ القزحية والتلميذ بالكاد مرئية3 = عتامة شديدة. القزحية أو التلميذ غير مرئي4 = قرنية معتمة. القزحية والتلميذ غير مرئيين أثناء مراقبة القرنية من خلال مجهر التشريح ، قم بتسجيل CoNV بناء على المقياس التالي12:0 = لا الأوعية الدموية الجديدة. لا سفن جديدة من ليمبوس1 = الأوعية الدموية الخفيفة ؛ السفن الجديدة الناشئة من ليمبوس2 = الأوعية الدموية الحديثة المعتدلة. نشأت الأوعية الدموية من الليمبوس وتنمو نحو مركز القرنية3 = الأوعية الدموية الجديدة الشديدة. الأوعية الدموية التي تنشأ من الليمبوس وتصل إلى و / أو تعبر مركز القرنية استخدم اختبار t الخاص بالطالب لمقارنة درجات العتامة والأوعية الدموية الجديدة إحصائيا بين الحروق القلوية ومجموعات العين الصحية. القتل الرحيم للفئران في اليوم 10 عن طريق التعرض للأيزوفلوران بنسبة 5٪ حتى 1 دقيقة بعد توقف التنفس ، يليه خلع عنق الرحم ، وجمع القرنيات للتصوير المسطح. 6. التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) التقط صور OCT للجزء الأمامي من العين في الفئران المخدرة في اليوم 10 بعد الحرق. قم بإجراء الحصول على صورة OCT كمسح ضوئي لوحدة التخزين باستخدام وضع IR + OCT مع مجال رؤية 30 درجة وكثافة الأشعة تحت الحمراء بنسبة 100٪. تحديد سمك القرنيات باستخدام برنامج ImageJ. لقياس السماكة، استخدم أداة تحديد الخط في برنامج ImageJ لإنشاء خط مستقيم بين السطحين الأمامي والخلفي عند القرنية المركزية. انقر فوق تحليل > قياس في أدوات البرنامج لنقل القيم إلى نافذة البيانات. انسخ القيم إلى ملف جدول بيانات ، وقارن إحصائيا سمك القرنية بين حرق القلويات ومجموعات العين السليمة باستخدام اختبار t للطالب.ملاحظة: سمك القرنية هو المسافة من نقطة على سطح القرنية الأمامي إلى أقرب نقطة على سطح القرنية الخلفي في مركز القرنية. 7. تلطيخ مناعي ل CoNV على القرنيات المسطحة القتل الرحيم للفئران في اليوم 10 بعد حرق القلويات ، واستئصال العينين عن طريق تشريح حاد. اسحب الجفون بعيدا باستخدام إصبعي الإبهام والسبابة ، وضع ملقط تحت كرة العين. أغلق الملقط ، واسحب مقلة العين برفق من المدار. ضع مقل العيون في 1x PBS. لكل مقلة عين ، قم بإزالة القرنية من كرة العين عن طريق إجراء شق أولا باستخدام إبرة 30 جم أسفل منطقة الليمبوس. قطع حول منطقة النسيان باستخدام مقص القرنية الدقيقة ، مع شق كنقطة انطلاق ، وفصل القرنية والحافة ببطء عن الكرة الأرضية. نظف القرنيات برفق باستخدام فرشاة رسم دقيقة لإزالة القزحية. إصلاح القرنيات في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 1 ساعة. اغسل القرنيات ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة لكل منها في 1x PBS في درجة حرارة الغرفة (RT). احتضان في مخزن مؤقت مانع (1x PBS مكمل ب 0.1٪ Triton-X 100 و 5٪ ألبومين مصل بقري [BSA]) لمدة 1 ساعة في RT. نقل القرنيات إلى محلول الأجسام المضادة الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة في 1x PBS المكمل ب 1٪ BSA و 0.1٪ Triton-X 100 و Dylight550 المترافق المضاد ل CD31 mAb (1: 100) و Alexa Fluor488-conjugated anti-LYVE-1 mAb (1: 100). احتضان لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية. اغسل القرنيات في 1x PBS ثلاث مرات لمدة 20 دقيقة لكل منهما. قم بتلطيخ النوى باستخدام محلول البقع Hoechst (1: 1000) لمدة 5 دقائق في الظلام. قم بتسطيح القرنيات بجروح شعاعية ، وقم بتثبيتها على شريحة زجاجية تم تنظيفها مسبقا باستخدام وسيط التثبيت وأغطية الغطاء. أغلق أغطية الغطاء بطلاء أظافر شفاف ، وجفف الشرائح طوال الليل في الظلام قبل تحليلها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. تصوير القرنيات المثبتة بشكل مسطح باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عن طريق خياطة صور Z-stack الفردية ؛ استخدم هدف 10x ، ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر ، ودقة 512 بكسل × 512 بكسل لكل شريحة على ماسحات Galvano غير الرنانة. حدد كثافة الدم CD31 + والأوعية الليمفاوية LYVE-1 + باستخدام برنامج ImageJ. لتحديد كثافة الأوعية الدموية ، قم بتحويل الصور متحدة البؤر إلى صورة 8 بت. اختر كثافة الأوعية الدموية من المكونات الإضافية. اختر منطقة الاهتمام على الصورة ، وانقر فوق موافق. سيتم فتح القياسات في نافذة بيانات جديدة. انسخ القيم إلى ملف جدول بيانات ، وقارن إحصائيا كثافة الأوعية الدموية بين الحرق القلوي ومجموعات العين السليمة باستخدام اختبار t للطالب.ملاحظة: CD31 ، ويسمى أيضا جزيء التصاق الخلايا البطانية للصفائح الدموية -1 (PECAM-1) ، هو جزيء التصاق خلوي يشارك في تكوين الأوعية ويتم التعبير عنه بشكل كبير في الخلايا البطانية للأوعية الدموية المبكرة والناضجة13. LYVE-1 (مستقبل الهيالورونان البطاني للأوعية اللمفاوية -1) هو علامة سطح الخلية على الخلايا البطانية اللمفاوية ويمكن استخدامه كعلامة تكوين الأوعية اللمفاوية14.

Representative Results

تصف هذه الدراسة طريقة للحث على تكوين الأوعية القرنية في عين الفأر عن طريق حرق القلويات. أظهرت الصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر التشريح (الشكل 1A ، B) ارتفاعا ملحوظا في درجات الأوعية الدموية الجديدة والعتامة في القرنيات في مجموعة الحروق القلوية (P < 0.05; الشكل 1 ج ، د). تم تلطيخ القرنيات التي تم جمعها في اليوم 10 بشكل أكبر بمضادات CD31 mAb للأوعية الدموية ومضاد LYVE-1 mAb للأوعية الليمفاوية ، على التوالي (الشكل 2A-I). أظهرت مجموعة الحروق القلوية كثافات أعلى بكثير من الأوعية الدموية واللمفاوية بعد 10 أيام (P < 0.001 و P < 0.05 ، على التوالي ؛ الشكل 2J ، K). لوحظ أن سمك القرنية ، كما تم تصويره وقياسه كميا باستخدام OCT (الشكل 3A ، B) ، أعلى بكثير في المجموعة المصابة بحرق قلوي (P < 0.01; الشكل 3 ج). الشكل 1: الأوعية الدموية الجديدة للقرنية الناتجة عن الحرق القلوي والعتامة. (أ، ب) انتشرت الأوعية الدموية القرنية من الأوعية الطرفية باتجاه مركز القرنية في عين الفأر المحترقة القلوية (B) (A) ولكن ليس العين السليمة بعد 10 أيام من الإصابة. (ج، د) القياس الكمي للأوعية الدموية الجديدة للقرنية (C) و (D) العتامة في اللوحتين A و B (± SEM ؛ اختبار t ؛ * P < 0.05 ؛ n = 3 عيون ، 1 عين / فأر). تمثل الأسهم الحمراء الحافة ، ويشير السهم الأصفر إلى الأوعية الجديدة المنبثقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: الأوعية الدموية الجديدة للقرنية وتكوين الأوعية اللمفاوية الناتجة عن الحرق القلوي. كشفت الكيمياء الهيستولوجية المناعية عن (A ، D ، G) الدم والأوعية الليمفاوية (B ، E ، H) باستخدام مضادات CD31 و anti-LYVE-1 mAbs ، على التوالي. (أ-ج) قرنية الفأر السليمة. (مد-طاء) القرنية المحترقة بالقلويات بعد 10 أيام من الإصابة. (ج، و، ط) صور متراكبة لإشارات CD31 و LYVE-1. (ز-ط) صور مكبرة للوحات D-F. أشرطة المقياس = (A-F) 200 ميكرومتر و (G-I) 500 ميكرومتر. (J ، K) القياس الكمي لكثافة الأوعية الدموية واللمفاوية في الألواح A-F ، كما هو موضح (± SEM ؛ اختبار t ؛ * P < 0.05 ؛ ***P < 0.001 ؛ n = 3 عيون ، 1 عين / فأر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: زيادة سمك القرنية الناتجة عن الحرق القلوي . (أ) صورة OCT لعين فأر سليمة. ب: صورة OCT لقرنية الفأر بعد 10 أيام من الحرق القلوي. (ج) القياس الكمي لسمك القرنية في اللوحتين A و B ، كما تم قياسها في مركز القرنية (± SEM ؛ اختبار t ؛ ** P < 0.01 ؛ n = 3 عيون ، 1 عين / فأر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

القرنية هي نسيج ممتاز لدراسة تكوين الأوعية الدموية والالتهابات لأنه يمكن الوصول إليها والأوعية الدموية ، مما يعني أنه يمكن اكتشاف الأوعية الدموية الجديدة وتوثيقها بسهولة. تم استخدام حرق القرنية في الأرانب والجرذان والفئران لدراسة تكوين الأوعية الدموية في القرنية ، والالتهاب والعتامة ، والتقرح ، وانثقاب القرنية ، والتليف15،16،17. علاوة على ذلك ، فإن نموذج الفأر لحرق القرنية ذو قيمة لاختبار الاستراتيجيات العلاجية المختلفة لتكوين الأوعية والالتهاب لأن الفئران لديها جهاز مناعي يرتبط ارتباطا وثيقا بنظام البشر18. كما أن توفر تقنيات لمعالجة جينوم الفأر وراثيا يجعل الأنواع خيارا ممتازا لهذا النوع من الدراسة19. كان التحدي في هذا البحث هو تطوير طريقة لحرق القرنية توفر فيزيولوجيا مرضية متسقة وقابلة للتكرار.

نموذج الحرق القلوي مفيد بشكل خاص للفحص الدوائي للأدوية التي تعدل تكوين الأوعية والالتهاب والتليف. إن الحد الأدنى من متطلبات الكواشف والموارد ، وبساطة إجراء الحرق القلوي ، وفوائد المدة القصيرة للبروتوكول والملاحظة المباشرة للنتائج تجعل حرق القلويات على قرنية الفأر خيارا أساسيا لفحص الأدوية الدوائية. ومع ذلك ، ينبغي مراعاة بعض الاحتياطات عند تنفيذ هذا الإجراء لضمان الاتساق وقابلية التكاثر. أولا ، يجب وضع ورق الترشيح في وسط القرنية لتجنب حرق مناطق أخرى من العين ، وخاصة الأطراف والجفون والملتحمة. ثانيا ، يجب أن يكون حجم وتركيز هيدروكسيد الصوديوم مناسبا للحصول على نتائج متسقة من الحرق القلوي على القرنية. يجب ألا يكون المرشح مبللا ولكن يجب أن يكون منقوعا في محلول هيدروكسيد الصوديوم. تم تحسين حجم المرشح ونوع المرشح والحالة الطبيعية وحجم المحلول المستخدم في هذه الطريقة لتجنب تجاوز تدفق هيدروكسيد الصوديوم. قد يؤدي استخدام ورق ترشيح مختلف الحجم أو حجم أكبر أو أقل من NaOH إلى حدوث تناقضات في الأوعية الدموية الجديدة. ثالثا ، من المهم منع محلول NaOH من امتصاص CO2 في هواء الغرفة عن طريق شد غطاء أنبوب المحلول على الفور بعد الاستخدام وتقليل نسبة الهواء / المحلول. يجب توخي الحذر لاستخدام المحاليل القلوية الطازجة لمنع التناقضات في الأوعية الدموية الجديدة وتجنب تقرح القرنية. أخيرا ، من الضروري إجراء غسيل مكثف لجميع محلول NaOH من العين والملتحمة بالمحلول الملحي لمنع المزيد من الضرر للقرنية والأنسجة المحيطة بالعين. الغسيل الشامل للقرنية والأنسجة المجاورة سيمنع أيضا سيمبلفارون.

البروتوكول الموصوف هنا هو طريقة فعالة وموثوقة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لتكوين الأوعية الدموية في القرنية. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لدراسة التهاب القرنية والتليف والتئام الجروح.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة SRB الخيرية ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) P30EY002520 ، ومنحة مؤسسية غير مقيدة من أبحاث الوقاية من العمى (RPB) إلى قسم طب العيون ، كلية بايلور للطب. يتم دعم WL من قبل مؤسسة Knights Templar Eye Foundation في طب العيون.

Materials

0.9% Sodium Chloride Injection Hospira KL-7302
30 G Needle McKesson 16-N3005
A1R Confocal Nikon Instruments
Anti-CD31 Novus Biologicals NB100-1642R
Anti-LYVE-1 Life technologies 53-0443-82
ASM Module Heidelberg Engineering Anterior segment objective
Biopsy Punch McKesson 16-1309
BSA Thermoscientific 9048-46-8
Coverslip VWR International 22X22-1-601640G
Dissection Microscope AmScope SM-4TZ-30WY-10M3
Fluoromount-G Electron Microscopy Sciences 17984-25
Forceps Fine Science Tools 15000-02
Forceps Fine Science Tools 11049-10
Forceps Fisherbrand 12-000-157
Forceps  Roboz RS-4905
Gonak Hypromellose  Akorn 17478006412
GraphPad Prism 9 GraphPad Sotware, Inc
Heating pad K&H Pet Products 100213018
Hoescht Life Technologies 62249
HRA + OCT Spectralis Heidelberg Engineering
Insulin Syringe Mckesson 102-SN310C31516P
Kimwipe Kimberly Clark Professional 34155
Micro Cover Glass VWR 48366-067
Microscissors Roboz RS-5110
Microscopic Slide Fisherbrand 12-550-15
NaOH Sigma Aldrich 55881-500G
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone  Bausch & Lomb 24208-0795-35
Normal Serum Jackson Immuno 008-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127-500G
PBS Gibco 20012-027
Proparacaine HCl Bausch & Lomb 24208073006
Saline Henry Schein 1531042
SMZ125 Nikon Instruments
Syringe 10 mL McKesson 16-S10C
Triton X-100 Sigma Aldrich TX1568-1
Whatmann Filter Paper Cytiva WHA1003323
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellenberg, D., et al. Novel aspects of corneal angiogenic and lymphangiogenic privilege. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (3), 208-248 (2010).
  2. Azar, D. T. Corneal angiogenic privilege: Angiogenic and antiangiogenic factors in corneal avascularity, vasculogenesis, and wound healing (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 264-302 (2006).
  3. Rolfsen, M. L., et al. Corneal neovascularization: A review of the molecular biology and current therapies. Expert Review of Ophthalmology. 8 (2), 167-189 (2013).
  4. Skobe, M., Dana, R. Blocking the path of lymphatic vessels. Nature Medicine. 15 (9), 993-994 (2009).
  5. Lee, P., Wang, C. C., Adamis, A. P. Ocular neovascularization: An epidemiologic review. Survey of Ophthalmology. 43 (3), 245-269 (1998).
  6. Su, W., et al. Efficacious, safe, and stable inhibition of corneal neovascularization by AAV-vectored anti-VEGF therapeutics. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 107-121 (2021).
  7. Lasagni Vitar, R. M., et al. Epidemiology of corneal neovascularization and its impact on visual acuity and sensitivity: A 14-year retrospective study. Frontiers in Medicine. 8, 733538 (2021).
  8. Said, D. G., Dua, H. S. Chemical burns acid or alkali, what’s the difference. Eye. 34, 1299-1300 (2020).
  9. Muthukkaruppan, V. R., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 2 (4413), 1416-1418 (1979).
  10. Kenyon, B. M., et al. A model of angiogenesis in the mouse cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1625-1632 (1996).
  11. Cursiefen, C., Maruyama, K., Jackson, D. G., Streilein, J. W., Kruse, F. E. Time course of angiogenesis and lymphangiogenesis after brief corneal inflammation. Cornea. 25 (4), 443-447 (2006).
  12. Yoeruek, E., et al. penetration and efficacy of topically applied bevacizumab: Evaluation of eyedrops in corneal neovascularization after chemical burn. Acta Ophthalmologica. 86 (3), 322-328 (2008).
  13. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  14. Johnson, L. A., Prevo, R., Clasper, S., Jackson, D. G. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. The Journal of Biological Chemistry. 282 (46), 33671-33680 (2007).
  15. Choi, H., et al. Comprehensive modeling of corneal alkali injury in the rat eye. Current Eye Research. 42 (10), 1348-1357 (2017).
  16. Chung, J. H., Fagerholm, P., Lindström, B. The behaviour of corneal epithelium following a standardized alkali wound. Acta Ophthalmologica. 65 (5), 529-537 (1987).
  17. Chang, J. H., Gabison, E. E., Kato, T., Azar, D. T. Corneal neovascularization. Current Opinion in Ophthalmology. 12 (4), 242-249 (2001).
  18. Alves da Costa, T., Lang, J., Torres, R. M., Pelanda, R. The development of human immune system mice and their use to study tolerance and autoimmunity. Journal of Translational Autoimmunity. 2, 100021 (2019).
  19. vander Weyden, L., White, J. K., Adams, D. J., Logan, D. W. The mouse genetics toolkit: Revealing function and mechanism. Genome Biology. 12 (6), 224 (2011).

Tags

Corneal NeovascularizationAlkali BurnMouse ModelAngiogenesisCorneaImmunostainingCD31LYVE-1Optical Coherence TomographyOcular TraumaCorneal TransparencyVision

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ammassam Veettil, R., Li, W., Pflugfelder, S. C., Koch, D. D. A Mouse Model for Corneal Neovascularization by Alkali Burn. J. Vis. Exp. (196), e65289, doi:10.3791/65289 (2023).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image