Her beskriver vi en standardprotokol til kvantificering af den optokinetiske refleks. Det kombinerer virtuel tromlestimulering og video-okulografi og muliggør således præcis evaluering af funktionens selektivitet af adfærden og dens adaptive plasticitet.
Den optokinetiske refleks (OKR) er en væsentlig medfødt øjenbevægelse, der udløses af den globale bevægelse af det visuelle miljø og tjener til at stabilisere retinale billeder. På grund af sin betydning og robusthed er OKR blevet brugt til at studere visuel-motorisk læring og til at evaluere de visuelle funktioner hos mus med forskellige genetiske baggrunde, aldre og lægemiddelbehandlinger. Her introducerer vi en procedure til evaluering af OKR-responser fra hovedfaste mus med høj nøjagtighed. Hovedfiksering kan udelukke bidraget fra vestibulær stimulering på øjenbevægelser, hvilket gør det muligt at måle øjenbevægelser, der kun udløses af visuel bevægelse. OKR fremkaldes af et virtuelt tromlesystem, hvor et lodret gitter præsenteret på tre computerskærme driver vandret på en oscillerende måde eller ensrettet med konstant hastighed. Med dette virtual reality-system kan vi systematisk ændre visuelle parametre som rumlig frekvens, tids-/svingningsfrekvens, kontrast, luminans og gitterretningen og kvantificere indstillingskurver for visuel funktionsselektivitet. Højhastigheds infrarød video-okulografi sikrer nøjagtig måling af øjenbevægelsernes bane. De enkelte mus’ øjne er kalibreret for at give mulighed for at sammenligne OKR’erne mellem dyr i forskellige aldre, køn og genetiske baggrunde. Den kvantitative kraft af denne teknik gør det muligt at opdage ændringer i OKR, når denne adfærd plastisk tilpasser sig på grund af aldring, sensorisk oplevelse eller motorisk læring; Det gør således denne teknik til en værdifuld tilføjelse til repertoiret af værktøjer, der bruges til at undersøge plasticiteten af okulær adfærd.
Som reaktion på visuelle stimuli i miljøet bevæger vores øjne sig for at flytte vores blik, stabilisere nethindebilleder, spore bevægelige mål eller justere foveae af to øjne med mål placeret i forskellige afstande fra observatøren, hvilket er afgørende for korrekt syn 1,2. Oculomotorisk adfærd er blevet brugt i vid udstrækning som attraktive modeller for sensorimotorisk integration for at forstå de neurale kredsløb i sundhed og sygdom, i det mindste delvis på grund af enkelheden i det oculomotoriske system3. Styret af tre par ekstraokulære muskler roterer øjet i soklen primært omkring tre tilsvarende akser: højde og fordybning langs tværaksen, adduktion og bortførelse langs den lodrette akse og intorsion og afpresning langs anteroposterioraksen 1,2. Et sådant simpelt system giver forskere mulighed for nemt og præcist at evaluere musens oculomotoriske adfærd i et laboratoriemiljø.
En primær oculomotorisk adfærd er den optokinetiske refleks (OKR). Denne ufrivillige øjenbevægelse udløses af langsomme drifter eller glidninger af billeder på nethinden og tjener til at stabilisere nethindebilleder, når et dyrs hoved eller dets omgivelser bevæger sig 2,4. OKR, som et adfærdsparadigme, er interessant for forskere af flere grunde. For det første kan den stimuleres pålideligt og kvantificeres nøjagtigt 5,6. For det andet er procedurerne for kvantificering af denne adfærd relativt enkle og standardiserede og kan anvendes til at evaluere de visuelle funktioner hos en stor kohorte af dyr7. For det tredje er denne medfødte adfærd meget plastisk 5,8,9. Dens amplitude kan forstærkes, når gentagne retinale glider forekommer i lang tid 5,8,9, eller når dens arbejdspartner vestibulær okulær refleks (VOR), en anden mekanisme til stabilisering af retinale billeder udløst af vestibulær input2, er svækket5. Disse eksperimentelle paradigmer for OKR-potensering giver forskere mulighed for at afsløre kredsløbsgrundlaget bag oculomotorisk læring.
To ikke-invasive metoder er primært blevet brugt til at evaluere OKR i tidligere undersøgelser: (1) videookulografi kombineret med en fysisk tromle 7,10,11,12,13 eller (2) vilkårlig bestemmelse af hoveddrejninger kombineret med en virtuel tromle6,14,15,16. Selvom deres anvendelser har gjort frugtbare opdagelser i forståelsen af molekylære og kredsløbsmekanismer for oculomotorisk plasticitet, har disse to metoder hver især nogle ulemper, der begrænser deres kræfter til kvantitativt at undersøge OKR’s egenskaber. For det første tillader fysiske tromler med trykte mønstre af sorte og hvide striber eller prikker ikke lette og hurtige ændringer af visuelle mønstre, hvilket stort set begrænser målingen af OKR’s afhængighed af visse visuelle træk, såsom rumlig frekvens, retning og kontrast af bevægelige riste 8,17. I stedet kan test af OKR’s selektivitet over for disse visuelle funktioner drage fordel af computeriseret visuel stimulering, hvor visuelle funktioner bekvemt kan ændres fra forsøg til forsøg. På den måde kan forskerne systematisk undersøge OKR-adfærden i det multidimensionelle visuelle parameterrum. Desuden rapporterer den anden metode i OKR-analysen kun tærsklerne for visuelle parametre, der udløser mærkbare OKR’er, men ikke amplituderne af øjen- eller hovedbevægelser 6,14,15,16. Manglen på kvantitativ effekt forhindrer således analyse af formen på indstillingskurver og de foretrukne visuelle træk eller detektering af subtile forskelle mellem individuelle mus under normale og patologiske forhold. For at overvinde ovenstående begrænsninger var videookulografi og computeriseret virtuel visuel stimulering blevet kombineret for at analysere OKR-adfærden i nylige undersøgelser 5,17,18,19,20. Disse tidligere offentliggjorte undersøgelser gav imidlertid ikke nok tekniske detaljer eller trinvise instruktioner, og det er derfor stadig udfordrende for forskere at etablere en sådan OKR-test til deres egen forskning.
Her præsenterer vi en protokol til præcist at kvantificere den visuelle funktionsselektivitet af OKR-adfærd under fotopiske eller scotopiske forhold med kombinationen af videookulografi og computeriseret virtuel visuel stimulering. Mus er hovedfikseret for at undgå øjenbevægelser fremkaldt af vestibulær stimulering. Et højhastighedskamera bruges til at optage okulære bevægelser fra mus, der ser bevægelige riste med skiftende visuelle parametre. Den fysiske størrelse af øjenæblerne på individuelle mus kalibreres for at sikre nøjagtigheden af at udlede øjenvinklen21. Denne kvantitative metode gør det muligt at sammenligne OKR-adfærd mellem dyr i forskellige aldre eller genetiske baggrunde eller overvåge dens ændring forårsaget af farmakologiske behandlinger eller visuel-motorisk læring.
Metoden til OKR-adfærdsanalysen, der præsenteres her, giver flere fordele. For det første løser computergenereret visuel stimulering de iboende problemer med fysiske trommer. Ved at håndtere problemet med, at fysiske trommer ikke understøtter den systematiske undersøgelse af rumlig frekvens, retning eller kontrastindstilling8, tillader den virtuelle tromle, at disse visuelle parametre ændres på forsøgsbasis, hvilket letter en systematisk og kvantitativ analyse af funktionsselektiviteten …
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Yingtian He for at dele data om retningsindstilling. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Canadian Foundation of Innovation and Ontario Research Fund (CFI/ORF projekt nr. 37597), NSERC (RGPIN-2019-06479), CIHR (Project Grant 437007) og Connaught New Researcher Awards.
2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
Compressed air | Dust-Off | ||
Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
Post | Thorlabs | TR1.5 | |
Post holder | Thorlabs | PH1 | |
PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |