Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram visualizadas pela primeira vez por Brinkmann e col. como uma via de morte celular diferente da apoptose e necrose em 2004¹. Nessa via, os neutrófilos liberam sua cromatina descondensada no espaço extracelular para formar grandes estruturas semelhantes a teias cobertas por proteínas antimicrobianas que antes eram armazenadas nos grânulos ou citosol. Essas proteínas antimicrobianas incluem elastase neutrofílica (NE), mieloperoxidase (MPO) e histona citrulinada H3 (H3cit), que são comumente usadas para detecção por imunofluorescência indireta de NETs². Esse método não apenas identifica a presença quantitativa dessas proteínas; na verdade, ele tem a vantagem de detectar especificamente estruturas semelhantes à NET. Nas NETs, as proteínas mencionadas co-localizam-se com o DNA extracelular, que pode ser detectado por uma sobreposição dos sinais de fluorescência de cada proteína corada e do DNA extracelular. Em contraste com os sinais de sobreposição devido ao DNA extracelular e à co-localização de proteínas em NETs, os neutrófilos intactos não mostram co-localização. Aqui, os componentes NET são geralmente armazenados separadamente nos grânulos, núcleos e citosol³.

Desde sua primeira descoberta, tem sido demonstrado que as NETs desempenham um papel central em inúmeras doenças, particularmente aquelas que envolvem inflamação. Os TNEs apresentam funções antimicrobianas durante a infecção através do aprisionamento e morte de patógenos extracelulares no sangue e nos tecidos ^4,5. No entanto, os TNEs também têm sido associados a doenças autoimunes e respostas hiperinflamatórias, como lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumática e asma alérgica ^6,7,8. Os TNEs promovem vaso-oclusão e inflamação na aterosclerose, adesão plaquetária e especula-se que desempenhem um papel no câncer metastático 9,10,11. No entanto, acredita-se que tenham propriedades anti-inflamatórias, reduzindo os níveis de citocinas pró-inflamatórias¹². Embora as NETs estejam ganhando mais interesse em um campo mais amplo de pesquisa, um método robusto de detecção de NET é fundamental para pesquisas futuras.

Embora a visualização de NETs em diferentes tecidos por imunofluorescência seja complexa e necessite de personalização, além da microscopia eletrônica, é atualmente um dos métodos mais renomados para visualizar as interações entre NETs e células, sendo predominantemente utilizada em tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina (FFPE)^13,14. No entanto, a comparação de imagens NET é difícil, pois diferentes laboratórios usam seus próprios protocolos personalizados. Esses protocolos diferem no uso de anticorpos, recuperação de antígenos ou método de permeabilização e são frequentemente otimizados para um tipo específico de tecido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27º.

Após Brinkmann e col. publicarem o primeiro estudo metódico utilizando a visualização imunofluorescente de NETs em tecido FFPE, quisemos otimizar esse protocolo para uma maior variedade de tecidos e espécies¹⁵. Além disso, para estabelecer um protocolo de imunofluorescência amplamente aplicável, testamos diferentes protocolos modificados de estudos que utilizaram métodos de imunofluorescência em tecido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Além disso, tentamos um novo anticorpo contra H3cit para coloração extracelular mais específica²⁸. Nós hipotetizamos que, adaptando sistematicamente os protocolos de coloração atuais para diferentes espécies e tecidos, a imagem in vitro pode ser melhorada, resultando em uma melhor representação da interação entre neutrófilos e NETs tanto local quanto sistemicamente.