인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

호중구 세포외 트랩(NETs)은 2004년 Brinkmann et al.에 의해 세포사멸 및 괴사와 다른 세포 사멸 경로로 처음 시각화되었습니다¹. 이 경로에서 호중구는 탈응축된 염색질을 세포 외 공간으로 방출하여 이전에 과립이나 세포질에 저장되었던 항균 단백질로 덮인 큰 거미줄 모양의 구조를 형성합니다. 이러한 항균 단백질에는 호중구 엘라스타제(ne), 골수화효소(MPO) 및 시트룰린 히스톤 H3(H3cit)가 포함되며, 이는 NET의 간접 면역형광 검출에 일반적으로 사용됩니다². 이 방법은 이러한 단백질의 정량적 존재를 식별할 뿐만 아니라; 실제로 NET과 유사한 구조를 구체적으로 감지할 수 있다는 장점이 있습니다. NET에서 언급된 단백질은 세포외 DNA와 함께 국소화되며, 이는 각 염색된 단백질과 세포외 DNA의 형광 신호의 중첩에 의해 검출될 수 있습니다. NET에서 세포외 DNA와 단백질의 공동 국소화로 인한 중첩 신호와 대조적으로, 온전한 호중구는 공동 국소화를 나타내지 않습니다. 여기서, NET 성분은 일반적으로 과립, 핵 및 세포질³에 별도로 저장된다.

첫 번째 발견 이후 NET은 수많은 질병, 특히 염증과 관련된 질병에서 중심적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다. NET은 혈액과 조직에서 세포외 병원체를 포획하고 사멸시킴으로써 감염 중 항균 기능을 보여줍니다 ^4,5. 그러나 NET은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 및 알레르기성 천식과 같은 자가면역 질환 및 과염증 반응과도 관련이 있습니다 ^6,7,8. NET은 죽상동맥경화증, 혈소판 부착에서 혈관 폐색과 염증을 촉진하며 전이성 암에 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다 9,10,11. 그럼에도 불구하고, 그들은 전염증성 사이토카인 수치를 감소시킴으로써 항염증 특성을 가지고 있다고 생각된다¹². NET은 광범위한 연구 분야에서 더 많은 관심을 받고 있지만, 강력한 NET 검출 방법은 향후 연구의 기본입니다.

면역형광 이미징을 사용하여 다양한 조직에서 NET을 시각화하는 것은 복잡하고 맞춤화가 필요하지만, 전자 현미경을 제외하고는 현재 NET과 세포 간의 상호 작용을 시각화하는 가장 유명한 방법 중 하나이며 주로 포르말린 고정 파라핀 포매 조직(FFPE)에 사용됩니다^13,14. 그러나 여러 실험실에서 자체 맞춤형 프로토콜을 사용하기 때문에 NET 이미징을 비교하는 것은 어렵습니다. 이러한 프로토콜은 항체, 항원 회수 또는 투과화 방법의 사용이 다르며 종종 특정 유형의 조직에 최적화되어 있습니다 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Brinkmann et al.이 FFPE 조직에서 NET의 면역형광 시각화를 사용한 최초의 방법론적 연구를 발표한 후, 우리는 더 다양한 조직과 종에 대해 이 프로토콜을 최적화하기를 원했습니다¹⁵. 또한 광범위하게 적용 가능한 면역형광 프로토콜을 확립하기 위해 FFPE 조직에서 면역형광 방법을 사용하여 NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25를 검출하는 연구에서 다양한 수정된 프로토콜을 테스트했습니다^{. 26,27}. 또한, 보다 특이적인 세포외 염색을 위해 새로운 H3cit 항체를 시도했다²⁸. 우리는 현재의 염색 프로토콜을 다양한 종과 조직에 체계적으로 적용함으로써 체외 이미징을 개선하여 호중구와 NET 간의 상호 작용을 국소 및 전신적으로 더 잘 표현할 수 있다는 가설을 세웠습니다.