Op methanol gebaseerd hele-mountpreparaat voor het onderzoek van retinale ganglioncellen
Summary
Methanol kan worden gebruikt als een hulpmedium voor retinale preparaten voor de gehele montage van het netvlies en langdurige opslag, wat nuttig is voor het onderzoek van retinale ganglioncellen.
Abstract
Retinale ganglioncellen (RGC’s), de projectieneuronen van het netvlies, verspreiden externe visuele informatie naar de hersenen. Pathologische veranderingen in RGC’s hebben een nauwe relatie met tal van retinale degeneratieve ziekten. Whole-mount retinale immunostaining wordt vaak gebruikt in experimentele studies op RGC’s om de ontwikkelings- en pathologische omstandigheden van het netvlies te evalueren. Onder sommige omstandigheden moeten sommige waardevolle netvliesmonsters, zoals die van transgene muizen, mogelijk gedurende een lange periode worden bewaard zonder de morfologie of het aantal RGC’s te beïnvloeden. Voor geloofwaardige en reproduceerbare experimentele resultaten is het gebruik van een effectief conserveringsmedium essentieel. Hier beschrijven we het effect van methanol als een hulpmedium voor retinale preparaten voor de gehele montage en langdurige opslag. Kortom, tijdens het isolatieproces wordt koude methanol (−20 °C) op het oppervlak van het netvlies gepipetteerd om de weefsels te helpen fixeren en hun permeabiliteit te vergemakkelijken, en vervolgens kunnen de netvliezen worden opgeslagen in koude methanol (−20 °C) voordat ze worden immunogekleurd. Dit protocol beschrijft de retina-isolatieworkflow en het protocol voor de opslag van weefselmonsters, wat nuttig en praktisch is voor het onderzoek van RGC’s.
Introduction
Retinale ganglioncellen (RGC’s) zijn de enige projectieneuronen in het netvlies en ze integreren en verzenden externe visuele informatie naar de hersenen1. Veel neurodegeneratieve ziekten zoals glaucoom en traumatische optische neuropathie worden gekenmerkt door onomkeerbare schade en verlies van RGCs 2,3. Het analyseren van de morfologische en kwantitatieve veranderingen van RGC’s is een cruciale stap om te bepalen hoe neurodegeneratieve ziekten zich ontwikkelen en bevorderen 4,5.
Indirecte immunofluorescentietest is een algemeen aanvaarde methode om de verdeling van eiwitten en het aantal cellen te controleren. In het laboratorium wordt whole-mount retinale immunostaining vaak gebruikt in experimentele studies op RGC’s om de fysiologische en pathologische omstandigheden van het netvlies te evalueren6. De meest voorkomende markers die worden gebruikt voor RGC-kwantificering in het hele netvlies zijn Brn3a, RNA-bindend eiwit met multiple splicing (RBPMS), enzovoort 7,8. Het karakteriseren van de hoeveelheid en distributie van RGC’s vereist hoogwaardige retinale immunostaining van de hele mount. Over het algemeen wordt het netvlies in immunostainingprotocollen ondergedompeld in chemische fixatieven voordat het wordt geïncubeerd in antilichamen. Ideale fixatieven mogen de vorm van cellen, de toegankelijkheid of affiniteit van de epitopen voor antilichamen of de lineaire afmetingen van het weefsel niet veranderen 9,10.
Vanwege de complexe structuur van het netvlies zijn problemen zoals retinale kwetsbaarheid en vouwen, evenals enkele veel voorkomende problemen, waaronder celkrimp en onduidelijke kernen, vatbaar voor optreden bij het maken van een hele retinale pleister, wat een negatieve invloed heeft op experimenteel onderzoek. Bovendien zijn niet alle netvliezen onmiddellijk immunogekleurd, vooral als het gaat om de netvliezen van transgene muizen met dure prijzen die van kostbare oorsprong zijn, waardoor de extra retinale monsters moeten worden bewaard voor verder gebruik.
De juiste fixatieve oplossing kan het weefsel snel fixeren, weefselautolyse vermijden, de normale morfologie en structuur van de weefselcellen behouden en de antigeniciteit van eiwitten en andere stoffen behouden10. Op dit moment is op formaldehyde gebaseerde fixatie op grote schaal gebruikt in verschillende weefsels, waaronder gescheiden netvliezen, gehemisecteerde oogschelpen en hele oogbollen10. Weefselkrimp en de morfologische verandering van cellen zijn de twee kritieke uitdagingen die zich voordoen na onderdompeling in formaldehyde11. Bovendien ontstaan er steeds meer gemodificeerde fixatieformuleringen om het behoud van de oorspronkelijke eigenschappen van het netvlies en de doelcellente maximaliseren 9,10. Verschillende retinale fixatiebehandelingen kunnen de retinale structuur, eiwitimmunogeniciteit, fluorescentie-excitatie en verzwakkings-bluscyclus anders beïnvloeden12,13. Netvliezen gefixeerd met Davidson’s oplossing zijn morfologisch meer intact in vergelijking met die gefixeerd met formaline, maar Davidson’s oplossing is minder compatibel met sommige antilichamen, zoals microgliale marker-geïoniseerde calciumbindingsadapter molecuul 112. Gezien de fragiele aard van netvliezen, zouden onderzoekers zich natuurlijk afvragen of de retinale integriteit, evenals de eigenschappen en morfologie van de doelcellen, zullen veranderen na langdurige opslag. De mogelijke effecten van fixatieoplossing op retinale en RGC-celmorfologie na opslag gedurende enkele maanden zijn echter zelden gemeld. De optimalisatie van retinale fixatie is van cruciaal belang voor de evaluatie en het behoud van RGC’s.
We geven een gedetailleerde beschrijving van een betrouwbare en technisch eenvoudige methode die we gebruiken voor het hele-mount murine retinale kleuring. Onze methode benadrukt de juiste voorbereiding en opslag van netvliezen voor RGC-onderzoek, rekening houdend met de noodzaak van de langdurige opslag van netvliesweefsel en specifieke aspecten van fluorofoorvorming of -afbraak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fixatie is een essentiële stap om het netvlies te behouden, wat van invloed kan zijn op eventuele latere RGC-onderzoeken op basis van morfologie. Succesvolle fixatie legt snel de structuur en toestand van de netvliezen vast op het moment dat ze worden blootgesteld aan het bevestigingsmedium, wat van cruciaal belang is voor verdere analyse. Hoewel formaldehyde wordt beschouwd als een van de meest voorkomende fixatiemiddelen voor weefsel- en celfixatie en -conservering, werkt formaldehyde alleen niet altijd goed als het o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Hubei Key Laboratories Opening Project (subsidie nr. 2021KFY055), Natural Science Foundation of Hubei Province (grant no. 2020CFB240) en Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
