用于植物分子输送的直接输液装置

直接输液装置组件直接输液装置的基本版本高8厘米，正面和侧面宽3.3厘米（图1A）。它包含一个与喷口相邻的中央储液槽，这些组分中可包含的总体积为 2.0 mL（图 1D）。增塑溶胶环高1.8厘米，直径2.7厘米（图1C）。该环还包含两个通道：一个用于容纳DPI设备喷口，另一个用于适应被处理树的树干的可变直径。此外，垂直通道周围有一个凹槽，用于引导多余的处理围绕树木，这允许通过树皮吸收额外的化合物（图1F）。组装正确后，增塑溶胶环应与DPI设备齐平，并且喷口应与树上钻的孔对齐（图1B和图1E）。 国家食品药品监督管理总局为了研究DPI装置将外源化学品引入柑橘类植物的有效性，使用该装置浸润了2.0 mL的2 mM CFDA。在处理过的植物的脉管系统中检测到荧光信号（图2A），但在用20%DMSO在H2O中处理的对照植物中不存在荧光信号（图2B）。在所有解剖的植物组织类型中都观察到该信号，包括叶叶肉、叶柄脉管系统、茎脉管系统和根脉管系统（图 2C）。该信号在处理后24小时内在植物中观察到，并且在整个组织中相对均匀地分布。 链霉素为了测试引入的化合物是否对HLB疾病有治疗作用，将2.0 mL杀菌化合物链霉素以9.5 mg / mL（总共19 mg）的浓度引入CLas阳性瓦伦西亚（柑橘）甜橙植物中。将这些植物维持在温室盆中，并使用qPCR随着时间的推移监测CLas滴度（通过CLas基因组当量每个柑橘基因组当量测量）（图3A）。链霉素和H2O处理植物的初始平均DNA CLas滴度分别为0.562 CLas基因组/柑橘基因组和0.49 CLas基因组/柑橘基因组。与同一时间点的H2O对照相比，链霉素治疗后7-28天通过qPCR检测到平均细菌滴度降低。此外，链霉素处理植物和H2O处理植物的时间0和28日平均细菌滴度之间的差异分别为0.314和0.117。 该实验旨在测量植物在不同时间段内对不同处理的反应。使用双因子二次响应面设计，将时间视为具有四个水平（0 天、7 天、14 天和 28 天）的定量离散因子，并将时间视为具有两个水平（H2O 和链霉素）的分类因子。八种治疗组合中的每一种都使用五次重复，并测量CLas滴度作为响应变量。使用基于Box-Cox图分析的对数10对数据进行转换。使用赤池信息准则（AICc）21通过前向选择进行模型约简，从而消除了时间和交互效应。其余因素，处理，是显着的（p = 0.0252），链霉素处理的植物在所有时间点的总和上显示出比H2O处理的植物（0.496）更低的平均CLas滴度（0.349）（图3B）。CLas滴度的降低对应于链霉素处理的植物在60天后新健康潮红生长的偶尔增加，如用H2O处理的代表性树木的照片所证明（图3C）与19mg链霉素（图3D）。 吡虫啉吡虫啉被引入亚洲柑橘木虱（ACP）感染的幼年柚子植物中，使用DPI设备测试其作为柚子D.杀虫筛选试验的潜力。在三种不同的浓度（5.28 μL/L、52.8 μL/L 和 528 μL/L）下测试了商用吡虫啉杀虫剂溶液的单次 2.0 mL 处理以及水对照。处理前每三个冲洗芽的平均总卵数范围为280.5至321，每个处理组使用的植物之间没有显着差异（图4A）。水对照组处理后7天3个冲洗芽的平均总存活若虫分别为293.75、268、97.5和2，吡虫啉溶液分别为5.28μL/L、52.8μL/L和528μL/L（图4B）。这表示，与根据单因素方差分析进行Tukey事后分析的水对照相比，在52.8 μL/L（p = 0.029）和528 μL/L（p = 0.002）吡虫啉溶液水平下木虱若虫的出现显着减少。此外，与水对照（图4C）相比，吡虫啉处理品系（图4D）的若虫蜜露产量减少，在最高吡虫啉溶液水平下木虱若虫死亡率的增加在视觉上很明显。 图1：直接植物输液装置和增塑溶胶环 。 （A）完整的直接植物输液装置和（C）增塑溶胶环及其尺寸。（B）直接植物输液装置和塑料溶胶环连接并附着在柑橘树上。（D）直接植物输液装置的垂直横截面，（F）增塑溶胶环，和（E）这两个组件连接并附着在柑橘树上。 请点击此处查看此图的大图。 图2：25厘米柑橘类植物叶中脉的横截面。图像显示使用直接植物输注装置在H2O中用（A）2mM CFDA或（B）20%DMSO处理后24小时。（C）2 mM CFDA处理后24 h各种植物组织的横截面，包括直接植物输液装置上方5厘米的树干（左上），直接植物输液装置下方5厘米的树干（左中），根（左下），叶中脉（右上），叶叶柄（右中）和叶叶肉（右下）。比例尺 = 1 毫米。缩写：CFDA = 5，6-羧基荧光素二乙酸酯;DMSO = 二甲基亚砜。请点击此处查看此图的大图。 图 3：使用 qPCR 监测 CLas 滴度（通过每个柑橘基因组当量的 CLas 基因组当量测量）。 （A） 显示 CLas DNA 滴度变化的时间过程，将用 19 mg 链霉素处理的五种植物与用 H2O 对照处理的五种植物进行比较。这些点表示给定时间点给定治疗的平均值。误差线表示平均值的标准误差。（B）条形图显示了H2O-和链霉素处理的植物在所有时间点的平均CLas滴度。误差条表示 95% 置信区间，星号表示链霉素和 H2O 处理植物的平均 CLas 滴度之间的显著差异 （* = p < 0.05） 根据单因素方差分析。（C）用（C）H 2 O或（D）链霉素直接灌注植物后0个月和2个月的柑橘植物代表性图像。用链霉素处理的植物在2个月后显示出新的浅绿色叶片潮红生长，这表明CLas滴度降低。缩写：CLas = 亚洲念珠菌 Liberibacter asiaticus。请点击此处查看此图的大图。 图4：监测受ACP侵扰的香橼幼年植物的木虱若虫死亡率。条形图显示 （A） 估计的初始卵计数和 （B） 在用水对照和各种稀释的吡虫啉处理后 7 天，三个柑橘冲洗的存活的柑橘假虫。误差条表示平均值的标准误差，星号表示给定处理水平与水控制之间的显著差异（* = p < 0.05，** = p < 0.01），根据单因素方差分析，然后是Tukey的事后分析。使用直接植物输注装置用 （C） 水对照或 （D） 528 μL/L 吡虫啉处理 7 天后，柑橘假虫感染的柑橘类柑橘的图像。缩写：ACP = 亚洲柑橘木虱;D. citri = Diaphorina citri Kuwayama。请点击此处查看此图的大图。 每个样品的体积（μL） 元件 12.5 2x GoTaq qPCR，含 BRYT 绿色染料预混液 5 脱氧核糖核酸模板 （20 纳克/微升） 0.5 10 μM 引物 F 和 R 用于 CLas 克拉斯： CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG （前锋）;TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA （Reverse） 0.5 10 μM 底漆 F 和 R 用于柑橘内务管理 柑橘脱水素：TGAGTACGAGCCGAGTGTTG（向前）;AAAACTTCACCGATCCACCAG （Reverse） 6.5 H2O 表 1：用于定量链霉素处理的柑橘品系中 CLas 滴度的 qPCR 混合物。 图中显示了用于CLas DNA定量和柑橘DNA定量的16S Las Long引物和柑橘脱水素引物的序列。 步 温度（°C） 时间 1 初始变性 95 2 分钟 2 变性 95 15 秒 3 退火 60 20 秒 4 外延 72 20 秒 5 转到步骤 2，重复 39x 6 熔融曲线 60 在 0.2 °C/s 时斜坡升至 95 3 分钟 表2：用于定量链霉素处理的柑橘系中CLas滴度的qPCR的反应条件。 补充图S1：显示模具组装过程以生成塑溶胶环的图像。 （A）使用卡扣在一起的塑料块来生成塑料溶胶环模具的第一层。（B）含有硅氧烷RTV橡胶、催化剂、食用色素和肥皂的混合溶液。（C）均匀浇注第一层塑溶胶环模。（D） 顶部为中心保持核心印记的增塑溶胶环图案图片。（E）将塑性塑溶醇环图案插入未固化的模具第二层中。（F）遮蔽胶带和橡胶槌，用于在第二层固化时固定图案。（G）加入第三层模具，直到它与图案的顶部齐平。（H） 从模具中去除图案。（一）全结构塑溶胶环模。 请点击此处下载此文件。 补充图S2：显示与直接植物输液装置相关的增塑溶胶环的组装过程的图像。 （一）塑溶胶环组件部件，包括模具、带O形圈的中心芯和输送通道芯。（B）在芯上涂上不粘喷雾食用油，以方便硬化后去除塑溶胶环。（C）将中心芯和O形圈插入模具中。（D）垂直于中心芯插入输送通道芯。（五）塑溶胶环芯部件在模腔内正确组装。（F）用于生成增塑溶胶环的塑料醇。（G）在微波炉中加热塑料溶胶。（H）加热后搅拌增塑溶胶。（一）检查增塑溶胶温度。（J） 将加热的塑料溶胶倒入组装好的芯中。（K） 允许在组装芯周围冷却塑溶胶。（L）完全组装好的增塑溶胶环连接到直接植物输液装置上。 请点击此处下载此文件。 补充图S3：显示直接植物输液装置组装过程的图像。 （A）在柑橘植物的中心钻一个孔，为化合物输送创造一个通道。（B）钻孔的正面视图。（C）用与化合物输送通道相对的剃须刀片切开塑料溶胶环。（D）在先前钻孔的位置将塑料溶胶环紧紧地安装在茎上。（E）将植物直接输液装置安装到增塑溶胶环上，将装置上的化合物输送插口插入增塑溶胶环的通道中。（F）使用硅胶带将植物直接输液装置固定在增塑溶胶环上，并将整个装置固定到位。（G）用感兴趣的化合物填充直接植物输液装置室。（H）使用注射器从工厂钻孔中抽出空气并开始化合物的流动。（I）在直接植物输液装置室的开口处涂上蜡密封膜并戳一个孔以防止真空。（J）柑橘类植物上完全组装的直接植物输液装置。 请点击此处下载此文件。 补充文件1：塑溶胶环中心柱芯。4 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件2：塑溶胶环中心柱芯。6 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件3：塑溶胶环中心柱芯。8 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件4：塑溶胶环中心柱芯。10 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件5：塑溶胶环中心柱芯。12 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件6：塑溶胶环中心柱芯。14 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件7：塑料溶胶环输送通道芯。4 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件8：塑溶胶环输送通道芯。6 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件9：塑溶胶环输送通道芯。8 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件10：塑料溶胶环输送通道芯。10 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件11：塑溶胶环输送通道芯。12 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件12：塑料溶胶环输送通道芯。14 mm 树的 STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件13：植物直接输液装置。STL 文件。请点击此处下载此文件。 补充文件14：用于制造塑溶胶环模具的图案。STL 文件。请点击此处下载此文件。