Det nuvarande protokollet är en uppdatering av tidigare protokoll och innehåller relativt enkla metoder för att odla cochleaplantor av hög kvalitet. Detta ger tillförlitlig datainsamling och högupplöst avbildning i levande och fasta celler. Detta protokoll stöder den pågående trenden att studera celler i innerörat.
Obehandlad hörselnedsättning medför betydande kostnader för det globala hälso- och sjukvårdssystemet och försämrar individers livskvalitet. Sensorineural hörselnedsättning kännetecknas av kumulativ och oåterkallelig förlust av sensoriska hårceller och hörselnerver i cochlean. Hela och vitala cochleaplantor är ett av de grundläggande verktygen inom hörselforskningen för att upptäcka hårcellsavfall och för att karakterisera de molekylära mekanismerna i innerörats celler. För många år sedan utvecklades ett protokoll för neonatal cochleaisolering, och även om det har modifierats med tiden har det fortfarande potential för förbättringar.
Denna artikel presenterar ett optimerat protokoll för isolering och odling av hela neonatala cochleaexplantat i odlingskammare med flera brunnar som möjliggör studier av hårceller och spiralganglieneuronceller längs hela cochleans längd. Protokollet testades med hjälp av cochlea-explantat från möss och råttor. Friska cochlea-explantat erhölls för att studera interaktionen mellan hårceller, spiralganglieneuronceller och de omgivande stödjecellerna.
En av de största fördelarna med denna metod är att den förenklar organodlingsstegen utan att kompromissa med kvaliteten på explantaten. Alla tre varven av Cortis organ är fästa vid botten av kammaren, vilket underlättar in vitro-experiment och omfattande analys av explantaten. Vi ger några exempel på cochleabilder från olika experiment med levande och fixerade explantat, som visar att explantaten behåller sin struktur trots exponering för ototoxiska läkemedel. Detta optimerade protokoll kan användas i stor utsträckning för integrativ analys av däggdjurets cochlea.
De flesta fall av sensorineural hörselnedsättning beror på degeneration av sensoriska hårceller, hörselnervceller och/eller auditiva synapser1. Denna degenerativa process i sinnescellerna är progressiv och vanligtvis irreversibel, vilket resulterar i hörselnedsättning. Därför är information om sensoriska cellers livskraft och förändringar i signalvägar under stressförhållanden avgörande för att skydda cellerna från skador och därmed förluster. Undersökningen av cochlea-explantat i odling gör det möjligt att rekapitulera vävnadskomplexet och upprätthålla ett normalt cell-cellnätverk, vilket möjliggör en bättre beskrivning av signalprocesserna. För att etablera experimentella modeller av ototoxicitet har antibiotikumet gentamicin och det kemoterapeutiska medlet cisplatin ofta använts, eftersom de är kända för att ha ototoxiska biverkningar3.
In vitro-odlingssystem för explantat cochlear har utvecklats och modifierats med tiden. En beskrivning av det stegvisa protokollet för odling av hela cochleaplantor saknas dock ofta i flera publikationer. Ett av de första videoprotokollen för den primära odlingen av det murina organet Corti publicerades av Parker et al., där författarna beskrev stegen för isolering av det sensoriska epitelet, odling på glastäcken och elektroporering av explantat för transfektionsexperiment4. Ett annat protokoll som använder täckglas av glas har också tidigare publicerats, där organisationen av cellstrukturen i innerörat övervägdes5. Ett alternativt protokoll som använder Millicell-membran för odling av musexplantat av Corti-organet och vestibulära organ har rapporterats6. Dessa videorapporter har bidragit till att förbättra metoden, men det finns fortfarande utmaningar som måste lösas. För att ta itu med ett antal problem som uppstår i samband med användningen av täckglas och glasinlägg syftar detta protokoll till att effektivisera stegen för organodling och odling av organ av hög kvalitet för tillförlitliga data. Detta uppnås genom att minimera den direkta hanteringen av organet under de experimentella procedurerna och undvika organöverföring innan man får högupplösta bilder av de levande och fasta cellerna.
Det aktuella protokollet uppdaterar tidigare publicerade de vitro-odlingssystem och introducerar flera optimeringar i isoleringen av Corti-organet och överföringen till odlingskamrarna, samt integrationen av en ny glaskammare för att förbättra odlingsförhållandena och ytterligare analys. Detta optimerade protokoll minskar risken för skador på organet, vilket kan uppstå vid användning av täckglas under mediebytet eller under överföringen av organet från täckglas eller membran för vidare analys 4,5,6. Glastäckena har ett bättre reflekterande index än plasten; De är dock ömtåliga och kan lättare gå sönder. De flerbrunnskamrar som används här är fästa vid ett objektglas, som är väl lämpade för organodling och för högupplöst avbildning. Överföringen av de isolerade organen utförs med en spatel, vilket gör att organet kan föras i rätt riktning och skjutas in i kammaren, i stället för att använda kraft med en pipett som tidigare rekommenderats 4,5,6.
De poly-D-lysinbelagda flerbrunnskamrarna, som bör innehålla tillräckligt med medium, underlättar organöverföringen och korrekt positionering av explantaten utan att applicera adhesivt tryck och samtidigt undvika organöverlappning, som tidigare nämnts6. Dessutom löses oavsiktlig organöverlappning och ojämna strukturer med hjälp av en konfokal Z-stack. Detta protokoll har optimerats för olika tillämpningar, såsom explantation av mus och råtta, explantat av Cortis och cochleas organ, odling i serumhaltigt och serumfritt medium, ototoxiska bedömningar och allmänna läkemedelsresponsexperiment. Cochleaplantorna monteras och inkuberas i kammare med täckglasbotten, vilket underlättar vidhäftningen av cochleaplantorna till kamrarna för optimal hantering under in vitro-experimenten , efterbearbetningen av explantaten och avbildningen av levande och fixerade cochleaplantor. Visualiseringen av hela längden av Cortis organ och kvantifieringen av hårceller effektiviseras. Dessutom är bedömningarna av stödcellerna, spiralganglieneuroncellerna och neuriterna korrekta. Därför kan detta protokoll användas för en omfattande analys av cochleaceller hos däggdjur.
Syftet med att uppdatera detta protokoll var att effektivisera stegen från isolering av explantat till avbildning av levande och fixerade cochleaceller. Vi förbättrade några steg under isoleringen och introducerade några innovativa verktyg i syfte att etablera ett effektivt och smidigt protokoll för att få explantat av hög kvalitet. Metoden som beskrivs är ett optimerat protokoll från tidigare rapporter 4,5. Dessutom saknar vissa aktuella studier ett stegvis uppdaterat protokoll. Med förenklade explanteringssteg ger detta protokoll enkel hantering av välbevarade explantat, vilket är avgörande för reproducerbara data. Införandet av flerbrunnskammare med ett polymertäckglas för explantat i innerörat förbättrar organbindningen och bevarandet av intakta explantat. Här presenterar vi flera exempel på experiment under stressförhållanden för att visa att organen i odling bibehåller sin cellulära organisation trots förlust av hårceller och skador på neuriterna.
En av utmaningarna med att odla organ i innerörat är att undvika att organen lossnar och flyter, eftersom detta påverkar explantens integritet, svaret på behandlingen och de efterföljande undersökningarna. Tidigare odlades explantat på täckglas 4,5. Även om odling på glasytor verkar vara ett bra alternativ, är beläggning av glaset tidskrävande, och täckglasen i sig är ömtåliga och ömtåliga. Ett alternativt protokoll som använder Millicell-cellodlingsinsatser försöker lösa detta problem6. Att skära och överföra membranet med explantaten verkar dock vara ett känsligt steg i det protokollet. Dessutom kan explanterna skadas under montering och tätning av täckglaset. I vårt föreslagna tillvägagångssätt, när explanterna väl har överförts till poly-D-lysinbelagda kammare och placerats i rätt position, krävs ingen ytterligare överföring eller täckning med täckglas. En ytterligare fördel med detta protokoll är användningen av kammare med en tunn gasgenomsläpplig polymertäckglas som ger optimala odlingsförhållanden för organexplantaten. Denna polymer har en optisk kvalitet som liknar glas, vilket gör den lämplig för cellavbildning i högupplöst mikroskopi.
Tillsats av serum till mediet används i de flesta protokoll för cell- och vävnadsodling, inklusive odling av explantat i innerörat med 1%-10% FBS 4,5,6,16. Förekomsten av serum påverkar odlingsförhållandena för experimenten; I vissa situationer är därför kultur utan serum att föredra. Frånvaron av serum i odlingen av cochleaexplantat ersattes antingen genom tillsats av N2 till DMEM eller genom tillsats av N2 till neurobasal-A-medium 5,6. I detta avseende testade vi odlingsförhållandena för explantaten med och utan serum. Under båda förhållandena var cellerna i innerörat vitala och reagerade på ototoxiska förhållanden. Vi testade dessa förhållanden i 72 timmar, men explantorna kan bibehållas i odling ännu längre, särskilt när de inkuberas med serumfritt medium tillsammans med N2, B27 och tillväxtfaktorer, som föreslagits i andra studier 5,16.
Förutom de allmänna kritiska stegen i isoleringen av explantat i innerörat, såsom varaktigheten av organisoleringen och det antibiotikum som används, finns det också några kritiska steg i detta protokoll, som dock är hanterbara. Ett av de kritiska stegen i denna metod är relaterat till volymen av medium som finns kvar i kammaren efter att organet har satts in. Detta har optimerats för att hålla explantorna vid liv och fästs på bottenytan. Ett annat kritiskt steg är relaterat till den inkubationstid som krävs för att explanterna ska kunna fästa på botten av kammaren. Inkubationstider längre än 2 timmar med några mikroliter medium kan påverka explantans hälsa. Kortare inkubationstider, t.ex. 1 timme, kan också användas, så länge man är noga med att inte lossa explantorna. En annan viktig aspekt är resterna av poly-D-lysin. Tvättstegen för poly-D-lysin bör följas strikt, eftersom rester av bromidsaltet av poly-D-lysin kan vara giftiga för cellerna. Efter att tvättstegen har följts exakt, underlättar beläggningen med poly-D-lysin den smidiga vidhäftningen av explantorna till kamrarna så att positionen kan korrigeras innan de blir ordentligt fästa vid kammarens botten.
En av begränsningarna med denna metod är avbildning av celler med hjälp av upprätt mikroskopi. Detta kan vara en viktig fråga för de laboratorier som har inverterade mikroskop. Glasglas med avtagbara silikonkammare kan användas för upprätt och inverterad mikroskopi; Våra beläggningsförhållanden med poly-D-lysin måste dock testas först. En ytterligare begränsning är förvaringen av kamrarna, eftersom insatserna inte är avtagbara, och den totala höjden på en kammare med lock är nästan 11 mm jämfört med 1 mm höjd på ett vanligt mikroskopglas. Kammaren med 8 brunnar använder dock mindre utrymme än de plattor med 4 brunnar som föreslogs före16.
Vi presenterar här bilder tagna med två mikroskop. Medan det punktskannande konfokalmikroskopet ger högupplösta bilder av vävnader på grund av sin tunna optiska sektion, ger det snurrande skivkonfokalmikroskopet en snabbare bildtid med bra upplösning. Stereocilierna i de inre hårcellerna (IHC) och de yttre hårcellerna (OHC) visualiseras med hjälp av konfokalmikroskopi. Eftersom stereocilierna hos IHC är större än hos OHC, visualiserades de upprepade gånger och väl i detta arbete. För OHC-stereocilier kan andra alternativa mikroskop förbättra visualiseringen, såsom superupplösningsmikroskopi (SRM). Explantationsbilderna som tagits med det snurrande skivmikroskopet är tillräckliga för enkel integration av automatiserad hårcellsräkning med hjälp av en djupinlärningsmetod12. Dessutom är den korta insamlingstiden viktig för experiment med levande celler och vävnader. Dessutom är detta protokoll inte begränsat till neonatala cochleaexplantat. Med vissa optimeringar kan även andra explantat som vestibulära organ eller embryonala vävnader odlas.
Kvantifiering av cochleaceller, såsom hårceller och neuroner, in vitro är viktigt för att bedöma cellviabilitet och därmed andelen skadade eller förlorade celler. Undersökningar av signalvägar och cellfunktioner bidrar till att avslöja mekanismerna för död och överlevnad. Undersökningar av embryonal och neonatal cochleavävnad är användbara för att undersöka cochleans utvecklingsstadier. Därför kommer detta protokoll att bidra till att optimera in vitro-studier av explantat i innerörat, till exempel för att upprätta ototoxiska modeller, undersöka utvecklingsstadier, utvärdera signalvägar och utföra läkemedelsscreeningstudier.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Animal Facility vid Institutionen för biomedicin vid universitetet i Basel för deras stöd inom djurvård, Microscopy Core Facilities samt Information Technology Service vid Institutionen för biomedicin för deras tekniska assistans och Swiss National Science Foundation (SNSF) för ekonomiskt stöd (MD-PhD-stipendium till M.C., Bidragsnummer 323530_191222).
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube 17 x 120 mm style | FALCON | 352096 | |
45° Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm style | FALCON | 352070 | |
Antifade Mounting Medium | VECTASHIELD | H-1000 | |
Alexa Fluor 568 phalloidin | Thermofisher | 2151755 | |
Anti-beta III Tubulin antibody [TUJ-1] | Abcam | ab14545 | |
Antifade Mounting Medium With DAPI | VECTASHIELD | H-1200 | |
Anti-myosin VII rabbit polyclonal | Abcam | ab3481 | |
B-27 Supplement (50x), minus antioxidants | Thermofisher | 10889038 | |
CARBON STEEL surgical blades 23 | Swann Moiton | 210 | |
CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent | Thermofisher | C10723 | |
DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX | Thermofisher | 31331028 | |
Double spatulas, one curved end | VWR | RSGA038.150 | |
Ethyl alcohol 70% V/V 1,000 mL | bichsel | 160 0 106 00 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Thermofisher | 16000036 | |
Fixative Solution 4% paraformaldehyde prepared in PBS | Thermofisher | 201255309/201255305 | |
High Intensity Cold Halogen Light Source | Intralux® | 5100 | |
Huygens Professional version 21.10 | Scientific Volume Imaging | ||
ibidi µ-Slide 8 well | ibidi | 80826 | |
microscope | LEICA | M80 | |
microscope | LEICA | MS5 | |
MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator, for live-cell imaging | Thermofisher | M36008 | |
N2 supplement (100x) | Thermofisher | 17502048 | |
Nikon Eclipse Ti microscope with a Yokogawa CSU-W1 spinning disk confocal unit, and a Photometrics Prime 95B camera. | NIKON | ||
Nikon Eclipse Ti microscope with an A1 point-scanning confocal unit | NIKON | ||
Operating scissors | Fine Science Tools | 14005-16 | |
Operating scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Operating tweezers | Fine Science Tools | 11008-15 | |
PBS pH 7.2 (1x), 500mL | Thermofisher | 20012-019 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
POLY-D-LYSINE HYDROBROMIDE MOL WT GT 30 | Sigma-Aldrich | P7405 | |
Scalpel Handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Steri 250 Second sterilizer | Simon Keller AG | 031100 | |
Sterilizer, desiccant pellets | Simon Keller AG | 31120 | |
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353802 | |
Tissue Culture Dish 60 x 15 mm | FALCON | 353004 | |
Trito X-100 | Sigma | T9284 | |
Unconventional myosin-VIIa | Developmental Studies Hybridoma Bank | 138-1s | |
WFI for Cell Culture[-]Antimicrobial, 500 mL | Thermofisher | A12873-01 |