基于细胞的电阻抗平台，用于实时评估寨卡病毒抑制剂

所描述的所有步骤均在无菌条件下在生物安全2级实验室的层流柜中进行。根据比利时机构审查委员会（Leefmilieu，Natuur en Energie，协议SBB 219 2011/0011）和鲁汶大学生物安全委员会的规则，所有使用的病毒均按批准获得和使用。 1. 细胞培养维护 注意：该协议是用一系列细胞系执行的，但当然可以适应任何贴壁细胞系，只需要细胞接种密度优化。 在加湿培养箱中以37°C和5%CO2 在T75培养瓶中培养A549人肺腺癌细胞系，U87人恶性胶质母细胞瘤细胞系和HEL 299人胚胎肺成纤维细胞。 以80%-95%汇合度传代细胞。在培养细胞之前，所有试剂都应在室温（RT）下进行。 从细胞中取出条件培养基。使用 5 mL Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 洗涤细胞单层一次。 将 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA） 均匀分布在细胞单层上。然后，在37°C下孵育长达3分钟，直到细胞开始分离。 加入 9 mL 新鲜完全生长培养基（详见 材料表 ）。轻轻上下移液以重悬细胞。 将所需体积的细胞悬液转移到新的T75培养瓶中，并加入适当体积的新鲜生长培养基以获得15mL的总体积。注意：根据特定的细胞系，本协议中使用的 体外 细胞系以1：4至1：10稀释度传代培养，以允许理想的生长条件。每3-4天进行一次传代培养，因此所需的细胞悬液体积也可以根据孵育天数而变化。 2. CEI板的制备 取带有叉指电极的 96 孔板（参见 材料表），并用 100 μL 生长培养基填充所有孔。 用DPBS填充孔之间的空间。注意：这样做是为了减少在96孔板中培养细胞时观察到的蒸发引起的边缘效应。 将板在37°C下在具有5%CO2的培养箱中孵育4小时。 3. 细胞接种 如第 1 节所述，将细胞从培养瓶中分离，并将它们重悬于 50 mL 管中的新鲜生长培养基中。 使用所选方法计数活细胞的数量。注意：在A549细胞的情况下，活力通常达到~100%。为了确定细胞数量，我们使用基于吖啶橙/碘化丙啶染色的自动细胞分析系统（见 材料表）。其他细胞计数方法同样有效。 将细胞重悬于新鲜生长培养基中以获得所需的细胞密度。在本研究中，最佳 A549 细胞密度为 0.15 × 106 （活）细胞/mL。 将带有叉指电极的 96 孔板从培养箱中取出，并用多通道移液管去除培养基。 在 96 孔板中每孔分配 100 μL 细胞悬液（在这种情况下相当于 15 ×10 3 个细胞）。 让细胞在室温下平衡15分钟，然后再将它们放入CEI设备中。 4. 设置和运行 CEI 检测 将容纳CEI设备板架的培养箱置于37°C和5%CO2。 将96孔板放入设备中。 打开设备的软件，然后单击“收集数据”窗格中的“设置”来设置新实验。等待笔记本电脑连接到ECIS设备，并通过检查孔的阻抗来配置板。检查所有孔是否正确配置，如绿色所示。如果没有，请重复步骤 4.2，直到所有孔均为绿色。 在 “井配置”窗格中，根据使用的区域性软件选择 阵列类型。 选择 多频率/时间模式。注意：在此模式下，器件测量一定频率范围内的阻抗变化。 通过单击 开始开始测量。注意：可以在软件界面上监控实时阻抗。选择要显示的 所需频率 。在本例中，选择 16 kHz。 5. 化合物制备和孵育 注意：作为抗病毒化合物的一个例子，使用迷宫激素A1（见 材料表）。由于该协议可以推广到所有具有潜在抗病毒活性的化合物，因此我们将其称为“化合物”。 允许不添加胎牛血清（FBS）（称为“测定缓冲液”）的完整细胞培养基在室温下平衡。 将化合物放在冰上。 在 5 mL 聚丙烯管中的测定培养基中制备每种化合物的 10x 浓缩稀释液。 在 5 mL 聚丙烯管中的测定培养基中连续稀释化合物以获得所需的 10x 浓度。 通过单击数据收集设置窗格中的暂停来暂停 CEI 设备。等待当前时间点完成并取出96孔板。 在光学显微镜下验证细胞的粘附和单层形成。 用多通道移液管从每个孔中取出 20 μL。 在所需孔中加入 20 μL 化合物溶液或载体。准备具有正确移液的特定条件的布局。 将板在37°C下用5%CO2孵育15分钟。注意：此孵育步骤使用普通细胞培养箱代替CEI设备。细胞对照（CC）孔是载体处理的孔。 6. 病毒制备和感染 解冻一瓶病毒原液。在本例中，使用ZIKV MR766和ZIKV PRVABC59。 以所需的MOI制备病毒稀释液或在15 mL聚丙烯管中的测定培养基中制备稀释液。注意：在此代表性示例中，使用了MOI 0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001，0.005和0.00005。 在 96 孔板的指定孔中加入 100 μL 病毒稀释液。向CC孔中加入测定培养基。 净化所使用的病毒容器。 将板放回CEI设备中，并通过单击“ 恢复实验”连续6天继续测量。注意：病毒对照（VC）孔是载体处理的感染细胞，而在CC孔中，添加测定培养基而不是病毒稀释。如果评估化合物的细胞毒性，则加入 100 μL 测定缓冲液而不是病毒稀释液。 7. 数据分析 通过单击 “完成 ”结束实验，并添加 可选的摘要注释，例如在出现的窗口中提供有关特定实验条件的信息。数据收集完成后单击 确定 。 在 “图形”窗格中 选择所需的频率，在该频率中，在实验结束时测量 CC 和 VC 之间的最大阻抗差。为了确定最佳频率，对未感染和感染的细胞进行试点实验，并选择在感染细胞的阻抗下降到其基线水平的时间点导致未感染和感染细胞之间观察到的最大阻抗差异的频率。在 感染ZIKV的A549细胞的情况下，这是 16 kHz。 要以电子表格格式导出所有数据，请确保在“ 井配置”窗格中 选择了所有孔，然后单击 “文件”|”导出数据 |图形数据。 通过从所有数据点中减去实验结束时测量的平均VC阻抗值并将其除以感染前测量的最后一个时间点的平均CC阻抗值来归一化数据。 在时间函数中绘制归一化数据，得到CEI轮廓图。 计算每个条件的曲线下归一化面积（AUCn）以确定参数，例如50%抑制浓度（IC50）。 例如，计算其他有用的参数，例如CIT50，以比较各种病毒株的感染性。