Sonodynamische therapie voor de behandeling van multiform glioblastoom in een muismodel met behulp van een draagbaar benchtop gericht echografiesysteem

Alle dierstudies zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Athymische naakte vrouwelijke muizen (leeftijd: 10 weken) werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel). Alle voorschriften van bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) werden gevolgd, inclusief het gebruik van maskers, handschoenen en jassen. 1. Tumorimplantaties en bioluminescentiebeeldvorming Voer tijdens de beginfase van het onderzoek intracraniële tumorimplantatie uit, volgens een eerder gepubliceerd rapport6.OPMERKING: In deze studie werden 100.000 M59 menselijke GBM-xenotransplantaatcellen in 4 μL celsuspensie gebruikt voor implantatie op een diepte van 3,0 mm in de schedel. Kwantificeer voorafgaand aan de behandeling de tumorgrootte in elke muis niet-invasief met behulp van een in vivo luminescentiebeeldvormingssysteem (zie Tabel met materialen) volgens een eerder gepubliceerd rapport7.OPMERKING: Dit werd gedaan op de datum van de behandeling, 7 dagen na de eerste tumorimplantaties. Verdeel de muizen met behulp van beeldvormende kwantificering in vergelijkbare subgroepen voor behandeling.OPMERKING: In deze studie werden twee subgroepen opgenomen: (1) onbehandelde tumordragende muizen (n = 4) en (2) tumordragende muizen die SDT ondergingen (n = 4). Er werd geen statistisch significant verschil in tumorgrootte vóór de behandeling waargenomen tussen de twee groepen (p > 0,05). 2. Instelling van de behandelingsdag Haal 5-ALA-hydrochloride (zie materiaaltabel) uit de vriezer en weeg 200 mg/kg muisgewicht van 5-ALA af (weeg bijv. voor een muis van 25 g 5 mg af). Doe dit alleen bij omgevingslicht.NOTITIE: Steriel alle apparatuur voor gebruik. Los de totale hoeveelheid 5-ALA op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), zodat elk dier een oplossing van 60 mg/ml 5-ALA krijgt toegediend met de juiste gewichtsdosering (bijv. voor een muis van 25 g, los 5 mg 5-ALA op in 83,33 μL PBS). Injecteer voor elk dier in de SDT-testgroep de juiste hoeveelheid oplossing van 5-ALA intraperitoneaal in het dier (berekend in stap 2.1 en 2.2). Laat de dieren 3 uur in hun kooien om de 5-ALA te metaboliseren. 3. Voorbereiding van de vereisten voor experimenten Vul een reservoir met gedeïoniseerd (DI) water.OPMERKING: De benodigde hoeveelheid water is gebaseerd op het aantal muizen dat in het onderzoek is gebruikt. Bevestig de instroom – en uitstroombuizen aan de ultrasone ontgasser (zie Materiaaltabel) en steek de stekker van de ontgasser in het stopcontact (1 = AAN, 0 = UIT). Plaats het andere uiteinde van de Flow in en Flow out buizen in het DI-waterreservoir. Zet de ontgasser aan en laat 45 minuten draaien. Vul het pas ontgaste water tot aan de bovenkant van een luchtdichte, afgesloten container voor gebruik tijdens het onderzoek. Giet ultrasone gel (zie Materiaaltabel) in een conische buis, plaats deze vervolgens in een centrifuge en draai gedurende 5 minuten op 160 x g om eventuele lucht uit de gel te verwijderen.OPMERKING: Er is voldoende gel nodig om een klodder gel op de kop van elk dier te vormen. 4. Installatie van het MRgFUS-systeem Sluit het MRgFUS-systeem aan (zie Materiaaltabel) met behulp van het bedradingsschema zoals te zien is in afbeelding 1 (onderpaneel).Sluit alle benodigde componenten (desktopcomputer, monitor, MRgFUS-platform, oscilloscoop, versterker) aan op stroom. Sluit alle kabels aan op de juiste locaties. Sluit de gewenste transducer via de BNC- en coaxkabels aan op het MRgFUS-platform en sluit vervolgens de bijbehorende impedantie-matchingbox aan op de juiste draden.OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een transducer van 515 kHz gebruikt. Schakel alle apparaten in. Open op het besturingssysteem van de desktopcomputer de AUREUS-applicatie, die al is geïntegreerd in de FUS-systeemsoftware. Selecteer Alle hardware aansluiten om de hardware op het systeem aan te sluiten en ervoor te zorgen dat de onderdelen communiceren met de software. Selecteer de gebruikte transducer door het vervolgkeuzemenu te selecteren en de gewenste transducer te kiezen. 5. Initialisatie Draai de onderste schroef los van het fantoom en vul de holte met gedeïoniseerd en ontgast water totdat het overstroomt, en plaats de schroef vervolgens weer terug. Plaats het fantoom op de overeenkomstige locatie van het MRI-bed (zie afbeelding 2) en plaats het MRI-bed vervolgens in de MRI-houder in de overeenkomstige sleuf. Plaats de MRI-houder op de overeenkomstige plaats in de MRI-scanner (zie Materiaaltabel). Stel de houder zo af dat het fantoom-MRI-bed zonder obstakels in de MRI-boring kan schuiven om een hoogwaardig beeld van het fantoom te verkrijgen. Markeer deze locatie zodat deze in de toekomst gemakkelijk kan worden gerepliceerd.OPMERKING: Zodra deze locatie is gevonden, wordt de locatie voor de rest van de behandeling niet meer gewijzigd. Zorg er daarom voor dat het een geschikte locatie is voor het plaatsen van MRI-tests bij dieren, anders moet de hele registratie worden herhaald. Maak een MRI-scan van het fantoom met behulp van de instellingen in tabel 1. Verwijder de houder uit de magneetboring, maar bewaar deze op de scanner. Verwijder het MRI-bed met het fantoom uit de houder en plaats het bed met het fantoom op het MRgFUS-systeem door de pin aan de onderkant in de juiste gleuf te schuiven. Plaats de registratietip op de magnetische sleuven op de transducerarm zodat deze naar beneden wijst in de richting van het fantoom (zie afbeelding 2). Kies in de software Selecteer een nieuwe startpositie en selecteer vervolgens Jog-modus Aan om te beginnen met begeleid gericht zoeken. Nadat de jog-modus is omgeschakeld, gebruikt u de toetsen links, rechts, omhoog, omlaag, pagina omhoog en pagina omlaag om de transducerarm handmatig te verplaatsen in respectievelijk links, rechts, vooruit, achteruit, omhoog en omlaag. Pas de aanwijzer handmatig aan in alle drie de dimensies totdat de punt van de aanwijzer het midden van het kruispatroon raakt dat aan de bovenkant van het fantoom ligt (zie afbeelding 2). Download de fantoom-MRI-beelden naar de computer en plaats ze in een map in de gekozen map en laad vervolgens de MRI-beelden in de software door Fantoombeelden laden te selecteren. De axiale fantoomsegmenten vullen dan het scherm aan de rechterkant. Scroll door deze segmenten via de muisschuifbalk. Pas de helderheid aan door op de afbeelding te klikken en vast te houden en vervolgens de muis omhoog of omlaag te bewegen.OPMERKING: Als een van de bestanden in de map geen ongecomprimeerde DICOM-bestanden zijn, kan de software ze niet lezen en importeren, dus verwijder alle andere bestanden uit die map. Scroll naar een afbeelding van het fantoom met een duidelijke cirkel met drie donkere gaten in elk. Klik op het midden van het fantoom en er verschijnt een rode cirkel. Klik en sleep op de cirkel totdat deze dezelfde diameter heeft en op één lijn ligt met de omtrek van het fantoom (zie figuur 2). De coördinaten van deze positie worden aangeduid als ‘thuispositie’; sla dit op door te klikken op L/R, A/P en S/I instellen. Klik op Jog-modus uit, verwijder de registratietip van de transducerarm en selecteer vervolgens Focus zoeken afsluiten. Bevestig de uitgangspositie om de initialisatievolgorde te voltooien. 6. Diervoorbereiding voor SDT Verdoof de muis met behulp van een isofluraan-O2-gasmengsel in een inductiekamer. Stel het gasdebiet in op 1.0 ml/min en de verdamper op 2.0% voor anesthesie-inductie, waarvoor doorgaans 3-5 minuten in de kamer nodig is (zie Materiaaltabel). Beoordeel het dier op adequate sedatie door in de teen te knijpen. Breng een oogzalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.NOTITIE: Houd de anesthesiediepte tijdens de procedure in de gaten. Injecteer de muis met 40 μL gadoliniumcontrastmiddel via de staartader (zie Materiaaltabel). Verwijder al het haar dat de hoofdhuid boven de schedel blokkeert met behulp van een ontharingscrème en een elektronisch scheerapparaat. Zet het dier vast aan het MRI-bed met behulp van de volgende stappen (zie figuur 3).Sluit de inlaatbuis van het MRI-bed (Figuur 3A) aan op een bron van isofluraan voor anesthesie en stel het gasdebiet in op 1.0 ml/min en de verdamper op 2.0% voor anesthesie-inductie. Sluit de uitlaatbuis aan op een koolstoffilterbus voor absorptie van anesthesie. Plaats het neuskegelstuk in de gleuf, zoals weergegeven in afbeelding 3B. Schuif de bijtstang door de bijtstanggaten in zowel de neuskegel als aan het einde van het bed, zoals afgebeeld, met het uiteinde van de bijtbeschermer zwevend boven de open put in het MRI-bed. Plaats het dier op het MRI-bed met zijn oren uitgelijnd met de stereotactische gaten in de oorbalk en klem zijn tanden door de bijtbescherming om het op zijn plaats te houden. Schuif de neuskegel naar voren zodat deze zich over de snuit van het dier bevindt om een gestage stroom anesthesie te bieden. Schuif de oorbalken door de gaten aan beide zijden van het MRI-bed en til de kop van het dier op totdat beide oorbalken in de gehoorgangen van de muis passen.NOTITIE: Duw niet te ver, omdat dit de trommelvliezen van het dier kan beschadigen. Zorg ervoor dat het dier zich in een comfortabele houding bevindt. Draai vervolgens met een platte schroevendraaier de MRI-compatibele schroeven vast om beide oorbalken, de neuskegel en de bijtstang vast te zetten. Hierdoor wordt het dier op zijn plaats vergrendeld en wordt elke hoofdbeweging voorkomen totdat het dier uit het bed wordt gehaald.OPMERKING: Zorg ervoor dat de positionering van het dier op het MRI-bed na deze stap niet wordt verstoord. Als het dier beweegt, moet de hele opstelling (stap 6.5) worden herhaald, ongeacht hoe ver het protocol is. Terwijl het dier wacht, plaatst u het MRI-bed op een warm warmtekussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden.NOTITIE: Houd de lichaamstemperatuur tijdens de procedure in de gaten en houd deze op peil. Isofluraan wordt gedurende de hele behandeling continu aan het dier toegediend via buisjes die aan de neuskegels zijn bevestigd wanneer het bed van het dier op het FUS-systeem is bevestigd, met behulp van de bevestigingen op het platform. 7. MRI-procedures Neem het MRI-bed met het dier stereotactisch gefixeerd en plaats het in de MRI-houder die eerder op de MRI-scanner is aangesloten (zie Materiaaltabel), door het gat in het MRI-bed aan het uiteinde naar de pin op de MRI-wieg te steken, zoals weergegeven in figuur 3. Bevestig de inlaat- en uitlaatanesthesieslangen aan de overeenkomstige buizen in de MRI-machine. Schuif de MRI-houder met het dier in de MRI-boring en zorg ervoor dat u dezelfde positie behoudt als waar het fantoom is geplaatst. Voer een lokalisator uit om de locatie van de hersenen van dieren te zien en vervolgens een post-contrast T1-gewogen MRI-scan die de hele hersenen bestrijkt met behulp van de MRI-instellingen uit tabel 2. Exporteer de MRI-scan als een set niet-gecomprimeerde DICOM-bestanden, één voor elk plakje. 8. Gerichte ultrasone behandeling (Figuur 4) Haal het dier na voltooiing van de scan uit de MRI-houder en plaats het op het platform door de voorkant van het bed in de overeenkomstige pin aan de achterkant van het platform te steken en de achterkant van het bed in de bijbehorende pin te steken. Sluit de inlaatbuis van het MRI-bed aan op een bron van isofluraan voor anesthesie en stel het gasdebiet in op 1.0 ml/min en de verdamper op 2.0% voor onderhoud van anesthesie. Sluit de uitlaatbuis aan op een koolstoffilterbus voor absorptie van anesthesie. Breng de set DICOM-bestanden over naar de computer en plaats ze in een map in de hoofdwerkmap van het huidige onderzoek.OPMERKING: Raadpleeg stap 5.9 voor bestandsvereisten. Ga in de software naar de hoofdinitialisatiepagina en schakel de Jog-modus in door te klikken op Guided Focus Finding en klik vervolgens op Jog-modus aan. Plaats een beetje gecentrifugeerde ultrasone gel op de kop van het dier, met voldoende gel om de hele hoofdhuid boven de schedel te bedekken. Giet DI en ontgast water tot 80% in het waterbad en plaats het waterbad vervolgens op de overeenkomstige kolommen op het platform. Laat het waterbad gevuld met DI-water zakken totdat het onderste membraan de ultrasone gel op de kop van het dier raakt en een koppelingsoppervlak vormt tussen het water en de gel. Zorg ervoor dat de ultrasone gel de hele kop van het dier tot aan het waterbad bedekt en dat er geen luchtbellen in de ultrasone gel tussen het waterbad en de hoofdhuid van de muis zitten. Dompel de ultrasone transducer onder in het waterbad en zorg ervoor dat er geen luchtbellen op het oppervlak van de transducer ontstaan. Laat de transducerarm zakken met behulp van de Jog-modus naar beneden in de richting van de gedeeltelijk ondergedompelde transducer en koppel deze aan de transducer door de magnetische sleuven met elkaar uit te lijnen terwijl het transduceroppervlak ondergedompeld blijft. Schakel de Jog-modus uit en sluit vervolgens Gericht zoeken afsluiten, zoals gedaan tijdens de initialisatiestap. Zorg ervoor dat u de uitgangspositie bevestigt zoals eerder gedaan. Ga naar het tabblad Behandeling en upload vervolgens de T1-gewogen MRI-bestanden na contrast door op het mappictogram in het midden bovenaan het scherm te klikken. Selecteer de map met de DICOM-bestanden die eerder naar de computer zijn geüpload en open deze. Deze stap zou automatisch alle DICOM-bestanden in het paneel rechtsboven moeten laden. Selecteer vervolgens op het tabblad Sonicatiemodus de juiste behandelingsmodus door Burst of Continuous Wave te kiezen. Als de burst-modus is ingeschakeld, voert u op het tabblad Sonicatie-instellingen de burst-lengte, burst-periode en het aantal perioden in. Deze parameters komen overeen met elke sonicatielocatie. Als u zich in de continue golfmodus bevindt, voert u alleen de sonicatieduur in.OPMERKING: In deze studie werd de continue golfmodus gebruikt voor een duur van 120 s. Klik op het doelpictogram in het midden bovenaan de pagina en selecteer de juiste locaties op het juiste MRI-segment waar het FUS-brandpunt moet worden gericht. Er zal een lichtrood vierkant met een rode cirkel aanwezig zijn waar op wordt geklikt. Er kan meer dan één selectie worden gekozen. Links van het MRI-beeld bevindt zich een tabel met de 3D-coördinaten van de geselecteerde brandpuntsgebieden. Voer in de laatste kolom van de tabel het vermogensniveau in dat op elk brandpuntspunt moet worden gesoniseerd, dat afzonderlijk kan worden berekend voor elke transducer die wordt gebruikt om de gewenste druk- of intensiteitsniveaus te verkrijgen. Klik op elk brandpuntspunt in de tabel om te bevestigen, waardoor de coördinaten worden gemarkeerd en het bijbehorende brandpuntsgebied op de afbeelding blauw wordt.NOTITIE: Raadpleeg het gegevensblad van de transducer om te bepalen hoe het in de tabel ingevoerde vermogensniveau moet worden vertaald in druk of intensiteit, aangezien deze waarden transducerspecifiek zijn. Als u tevreden bent met alle brandpuntsgebieden, selecteert u Bewegingstest. Dit zal de software ertoe aanzetten de transducer naar alle brandpuntsafstanden te verplaatsen om ervoor te zorgen dat de bewegingen mogelijk zijn. Na bevestiging geeft de software Motion Test Completed aan. Als er een fout optreedt, past u de brandpuntsgebieden aan zodat ze binnen de 3D-assen van de transducermotoren passen. Als u klaar bent, selecteert u Begin Sonication om het sonicatieprotocol te starten, waarbij u de transducer verplaatst en de juiste FUS-parameters toepast op elk geselecteerd brandpuntsgebied. Zodra het sonicatieprotocol is voltooid, koppelt u de transducer los van de transducerarm, verwijdert u het waterbad van het platform en veegt u de ultrasone gel van de hoofdhuid van het dier. Schroef de beet en oorbalken los, haal het dier uit het MRI-bed en plaats het dier vervolgens op een warm kussen totdat het dier wakker wordt uit de narcose. Breng het dier nu terug naar zijn kooi. Herhaal voor volgende dieren hetzelfde protocol, beginnend bij sectie 6. Nadat de gewenste dieren zijn behandeld, reinigt u alle oppervlakken die door dieren zijn aangeraakt met 70% ethanol (zie Materiaaltabel). Sluit de software af en sluit vervolgens elk apparaat af en schakel het uit. 9. Stappen na de behandeling Herhaal het in-vivobeeldvormingssysteem (IVIS)-protocol uit rubriek 1 voor bioluminescentie die 24 uur na de behandeling wordt gemeten. Om de effectiviteit van de behandeling te analyseren, vergelijkt u de bioluminescentie-opnames voor en na de behandeling om de groeisnelheid voor zowel behandelde als onbehandelde groepen te bepalen. Voer follow-up MRI-scans uit met dezelfde instellingen als in stap 6.4. Vergelijk met behulp van contrastversterkte scans de gemiddelde grijswaardenintensiteit van het tumorgebied of bereken het totale volume dat door het contrastmiddel wordt bedekt om verschillen in tumorvolume voor en na de behandeling te bepalen.