은 나노 입자를 사용한 마우스의 골관절염 개선

모든 동물 작업은 광저우 Forevergen Medical Laboratory Animal Center(2018-0186)의 동물 윤리 및 복지 위원회(AEWC)의 승인을 받았습니다. 1. KOA 마우스 모델 구축 BALB/c 마우스(18-24g, 생후 12-14주)를 습도 70%와 26°C의 환경, 12시간의 명암주기로 유지합니다. 이 실험을 위해 동물들은 광저우 포에버젠 의학 실험실 동물 센터에서 관리되었습니다. II형 콜라겐을 사용하여 앞서 설명한 대로 KOA 마우스 모델을 설정합니다21. 아래 설명에 따라 관절 내 주사를 수행합니다.마취를 위해 펜토바르비탈나트륨(40mg/kg) 2%, 진통제로 부프레노르핀(0.05mg/kg, 피하주사)을 바릅니다. 그런 다음 테이프로 쥐 팔다리를 고정하고 면도기로 머리카락을 제거하고 0.1 % 요오드포와 알코올을 번갈아 가며 스크럽하여 3 회 소독합니다. 멸균 장갑을 착용하고 멸균 가위를 사용하여 피부, 피하 조직 및 슬개골 인대를 순차적으로 노출시킵니다. 절개 부위를 0.5cm 이하로 유지하십시오.알림: 수술 중 마우스의 체온을 유지하기 위해 가열 담요를 사용했습니다. 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 30mg/kg(0.4mg/mL) II형 콜라겐분해효소 10U를 관절강(슬개하 인대 아래)에 주입합니다22.알림: 바늘과 피부 사이의 각도는 약 15°여야 합니다. 그런 다음 바늘의 방향을 바꾸고 바늘을 완전히 빼야 합니다. 주사 후 피하 조직을 먼저 봉합한 다음 피부를 봉합합니다. 0.1% 요오드화로 봉합사 부위를 살균합니다. 마우스가 마취에서 깨어난 후 개별적으로 환기되는 케이지(IVC)에 별도로 넣습니다. 2. 은 나노 입자의 합성 참고 : 은 나노 입자의 제조는 이전에 상세히 설명되었습니다19. 전체 배합 공정은 얼음 위에서 수행됩니다. 준비 후 혼합물을 4 °C에서 보관합니다. 그렇지 않으면 혼합물이 실온에서 쉽게 응고됩니다. 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 총 400μL의 콜라겐 유형 I(4mg/mL)을 넣고 얼음 위에 놓습니다. 위의 콜라겐에 총 200μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 넣고 용액을 잘 섞은 다음 얼음 위에 놓습니다. 마지막으로 상기 용액에 은 나노 입자 400 μL를 첨가 한 후 충분히 혼합한다. 나노 입자 용액의 최종 농도는 1mM입니다.참고 :은 나노 입자의 평균 직경은 5nm에서 15nm23 사이입니다. 이것은 전자 현미경으로 확인되었습니다. 3. II형 콜라겐분해효소 유도 KOA 마우스의 은 나노입자 처리 1 주일 후 유형 II 콜라겐 분해 효소 유도 KOA 마우스를 케이지에서 꺼내고은 나노 입자를 주입합니다. 은 나노 입자를 일주일에 한 번 주입하고 30 일 후에 표본을 수집합니다. 복강 내 주사를 통해 마취를 위해 총 2% 펜토바르비탈나트륨(용량: 2mL/kg)을 주사한 후 1.2단계에서 설명한 대로 피부를 고정하고 준비한 후 멸균합니다. 멸균 장갑을 착용하고 멸균 가위를 사용하여 피부, 피하 조직 및 무릎 인대를 순차적으로 노출시킵니다. 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 바늘로 15° 각도로 관절강에 들어갑니다. 은 나노 입자 콜라겐 혼합물 약 20μL를 천천히 주입하고 바늘24를 천천히 빼냅니다. 피하 조직과 피부를 차례로 봉합하고 멸균합니다. 마우스가 마취에서 깨어난 후 개별적으로 환기되는 케이지(IVC)에 넣습니다. 은 나노 입자 콜라겐 혼합물 (20 μL)을 일주일에 한 번 빈도로 4 회 주입합니다.참고: 은 나노 입자 콜라겐 혼합물로 처리한 마우스는 개별 케이지에 보관해야 합니다. 생쥐 싸움은 함께 유지될 때 발생할 수 있으며, 이는 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 주입 중에 바늘이 관절강에 닿았을 때 긴장감이 생기고 주입 후 무릎 관절에 붓기가 발생합니다. 이 2가지의 방법의 조합은 연구원이 약이 무릎 합동으로 성공적으로 주사되었다는 것을 보증하는 것을 허용합니다. 4. 무릎 관절 및 활막 조직의 수집 이산화탄소 질식 또는 관련 동물 윤리 위원회에서 승인한 기타 프로토콜로 쥐를 희생하십시오. 피부와 피하 조직을 순차적으로 멸균 및 해부하고 무릎 관절을 완전히 노출시킵니다. 대퇴골과 경골을 포함한 무릎 관절을 적출하고 근육 조직을 제거합니다. 대퇴골, 경골 및 주변 연조직(인대와 수정체)을 포함한 무릎 관절 조직을 10% 포르말린으로 모아 보존 및 고정합니다. 5. 헤마톡실린-에오신 염색 하룻밤 동안 고정한 후 절편을 파라핀으로 매립하고 마이크로톰을 사용하여 파라핀이 박힌 조직을 0.4μm 두께로 자릅니다. 추가 염색(헤마톡실린-에오신 염색, 사프라닌 O/패스트 그린 및 면역조직화학(IHC) 염색)을 위해 준비된 섹션을 사용하십시오. 절편을 크실렌으로 두 번 탈파라핀화하고 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올을 각각 5분 동안 순서대로 담그고 다시 수분을 공급합니다. 헤마톡실린(0.1g/100mL)으로 절편을 5분 동안 염색한 다음 1% HCl에 10초 동안 넣고 에오신(0.5g/100mL)에 1분 동안 직접 넣습니다. 현미경으로 활막의 조직병리학적 변화를 관찰합니다. 6. 사프라닌 O/패스트 그린 조직을 파라핀에 포매하고 5.1단계에서 설명한 대로 조직학적 절편을 준비합니다. 자일렌으로 섹션을 두 번 탈파라핀화하고 에탄올 시리즈(예: 증류수에 각각 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올을 각각 5분 동안)로 재수화합니다. 준비된 부분을 헤마톡실린으로 염색하고 PBS로 각각 2분 동안 세 번 세척합니다. 염산 알코올로 단면을 분화하고 PBS로 각각 2 분 동안 3 회 세척합니다. 절편을 0.02% Fast Green 염색액에 5-10분 동안 담근 다음 0.1% Safranin O 염색액에 1-2분 동안 담그십시오. 1% 아세트산으로 절편을 분화한 후 PBS 세척을 수행합니다. 절편의 섬유연골 형성을 감지하고 분석합니다. 7. 면역조직화학(IHC) 염색 조직을 파라핀에 매립하고 5.1단계에서 설명한 대로 조직학적 절편을 준비합니다. 자일렌으로 섹션을 두 번 탈파라핀화하고 에탄올 시리즈(예: 증류수에 각각 100%, 95%, 80% 및 70% 에탄올을 각각 5분 동안)로 재수화합니다. Tris-EDTA 완충액(10mM Tris base, 1mM EDTA 용액, pH 9.0)에 절편을 담그고 95°C의 전자레인지에서 10분 동안 가열하여 항원 회수를 수행합니다. 절편을 3% 과산화수소 용액에 10분 동안 노출시켜 내인성 과산화효소를 제거합니다. 비특이적 결합을 차단하기 위해 5% 염소 혈청으로 절편을 치료합니다. CD177에 대해 희석된 1차 항체(1:1,000 희석)를 추가하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 PBS로 섹션을 세 번 씻습니다. 절편을 PBS로 담그고 실온에서 30분 동안 적절한 2차 항체(HRP-conjugated polymer anti-rabbit system)로 절편을 배양합니다. 3,3′-diaminobenzidine(DAB)을 발색원으로 사용하여 IHC 염색의 시각화를 수행합니다. 현미경으로 단면을 보고 획득한 이미지를 분석합니다.