使用基于光学的系统对水凝胶嵌入的完整小鼠肌纤维进行高通量收缩测量

对于 离体 收缩研究，根据欧洲理事会指令（2010/63 / EU）经荷兰动物研究法许可，从为其他批准的研究项目和/或VU大学育种盈余而牺牲的动物中获得死后组织。 1. 材料准备 准备用于研磨的移液器（将70%乙醇储存在流动柜中直至使用）。切割两个P1，000尖端的末端以创建不同的孔尺寸;确保孔足够大，使肌肉通过而不会阻塞移液管。将切割端穿过火焰，使它们变得光滑。 按照其他地方32所述准备Sylgard菜肴，并提前用70%乙醇消毒，以便在隔离期间用于固定爪子和肌肉。注意：用去离子水和70%乙醇彻底清洁后，可以重复使用Sylgard培养皿。 在分离程序之前准备以下溶液：解剖培养基，纤维蛋白培养基和肌肉消化培养基（见 表1）。注意：肌肉消化培养基应使用0.22μm过滤器进行过滤灭菌。所有制备的溶液应在使用前在37°C和5%CO 2的标准细胞培养箱中平衡至少30分钟。 肌肉消化后，准备以下溶液来浇铸水凝胶：细胞混合物和基质混合物（见 表2）。以 1：1 的比例混合细胞混合物和基质混合物，最终纤维蛋白浓度为 2.5 mg/mL。注意：在冰上制备基质，并使用预冷的移液器吸头以防止基底膜基质过早聚合。这里使用的凝血酶：纤维蛋白原比例为1：10（单位/毫克纤维蛋白原），已针对30分钟的聚合时间进行了优化。如果凝胶在30分钟内聚合，则应使用较低的凝血酶浓度。有关详细信息，请参阅讨论。 2. FDB肌肉解剖 通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死。用70%的酒精消毒后肢。 切掉脚踝以上的后腿小腿。切开脚背侧朝向脚趾的皮肤。注意：在踝关节处切断小后腿，以防止在以后需要时损坏下肢肌肉和胫骨。 小心地将皮肤剥向脚趾。注意不要损伤肌肉。FDB是足腹侧最浅的肌肉。 将解剖的脚放入带有10mL预热解剖培养基的Sylgard培养皿中，温度为37°C。 将脚穿过仍然附着在脚趾上的皮肤，并将小腿固定在脚踝之外。 小心地去除肌肉顶部的结缔组织。切掉脚跟处的肌腱，然后用肌腱将肌肉抬起。 通过结缔组织在肌肉旁边和下方切开。继续切割，直到脚趾肌腱暴露出来。 当三根肌腱的一半长度暴露出来时，切断肌腱，并从脚上释放肌肉。可选：修剪第四外侧肌腱及其肌肉纤维。 清除肌肉上的结缔组织，并转移到装有预热解剖介质的管中。 3. FDB肌肉消化 根据 表1制备肌肉消化培养基。 使用血清移液管将FDB肌肉转移到肌肉消化培养基中。在37°C和5%CO2 的组织培养箱中孵育80分钟。注意：此时间应针对每个胶原酶批次进行优化。当肌肉开始磨损并看起来变大时，消化就完成了。有关消化时间的优化，请参阅讨论。 消化后，将肌肉转移到含有 3 mL 解剖培养基的 15 mL 管中，并在研磨前孵育 30 分钟。 4. FDB肌肉磨合和重力沉降 使用先前准备好的研磨吸头（步骤1.1）通过移液肌肉来研磨肌肉，从最大到最小尺寸。如果此步骤花费超过5分钟，请将肌肉放入培养箱中5分钟以使其休息。 研磨直到肌纤维大部分从肌腱上脱落，肌腱可以通过 P200 尖端。去除肌腱。 将解离的FDB纤维加入含有10mL解剖培养基的15 mL管中，并使纤维在培养箱中沉降20分钟。观察形成的颗粒。 可选：从顶部取出 10 mL 培养基，然后重复步骤 4.3。此步骤有助于去除多余的碎片和相关单核细胞。 5. FDB光纤嵌入 小心地从纤维颗粒顶部取出所有培养基。将细胞重悬于每块FDB肌肉的875μL细胞混合物中（冰上）。注意：一块FDB肌肉产生足够的纤维用于24孔板的七个孔。该密度可以根据实验的需要进行调整。以下凝胶体积（250 μL）针对24孔规格进行了优化，但可以针对其他规格进行相应缩放。 将 125 μL 细胞混合物等分到单个微量离心管中。 一次一个孔，将 125 μL 基质混合物加入细胞悬液等分试样中，并通过小心地上下移液进行混合，避免形成气泡。 立即将最终混合物转移到孔中。注意：确保将混合物移入孔中间。对每个孔重复步骤5.3和步骤5.4。 将凝胶在培养箱中固化30-45分钟。凝固后，小心地将培养基加入孔中。注意：快速移液可以将水凝胶从孔中分离出来。从这一点开始，可以刺激和测量纤维。然而，根据我们的经验，让纤维适应培养条件24小时可能会提高纤维的收缩力。 对于较长的培养时间，每2天更换一次半次培养基。为此，请去除一半的培养基，并用等量的新鲜培养基代替。 6. 基于光学的收缩测量 打开基于光学的收缩测量系统（见材料表）、荧光灯、电池起搏器和计算机。将电刺激器设置为 1.0 Hz、10.0 V，脉冲持续时间为 5.00 毫秒，以刺激孤立的肌肉纤维。 将板插入测量系统。将起搏器连接到起搏插入物，然后将其插入培养板中。 打开程序 IonWizard，然后单击“文件”（屏幕左上角）打开一个新 文件 | 新。 检查程序是否在正确的实验上，骨骼肌节，通过单击新建 |收集实验。要更改实验，请单击所需的实验，然后按添加。对于骨骼肌节实验，应用以下设置：Sarc 20x、平均线、单 FFT、250 Hz 采样率和 10 秒的采集时间。注意：实验设置应在实验前准备好。可以根据实验的需要调整设置。 将测量系统的温度调整为25°C。单击工具栏下的打开单元格查找器，然后等待弹出新屏幕。在此屏幕的右上角，选择板类型和活动孔。注意：测量在25°C下进行，以降低快速抽搐的FDB肌纤维的收缩速度，从而防止收缩事件的欠采样。 通过调整 焦点滑块使光纤聚焦。或者，使用 W 键和 S 键 进行此对焦功能。 启用起搏以开始电刺激。观察纤维现在开始抽搐。注意：如果没有光纤抽搐，请确保所有电线都已连接并且起搏器完全浸没。如果在此之后仍然没有运动，则由于研磨过程中过度消化或过度损伤，纤维可能没有反应。 将测量区域聚焦在光纤末端，使肌节垂直运行。确保肌节清晰可见。如果肌节聚焦，则工具栏中可以看到单个峰。在收缩期间，随着肌节缩短，该峰值将向右移动。注意：紫色测量区域可以在开始实验之前进行调整。为确保正确测量，请包括~20个肌节。如果该峰在收缩过程中改变形状，这可能表明肌节在收缩期间被遮挡或失焦，从而引入噪音。 通过单击工具栏中的“开始 ”开始 实验。按 Q 键开始测量，然后等待程序测量 10 个收缩瞬变。如果四个以上的瞬变看起来没有噪声，请按 Z键接受 测量。如果瞬变噪声太大，请按 X 键拒绝测量。 每种条件测量 10 根纤维到 20 根纤维。先前测量的光纤的位置被保留。 可选：添加化合物，之后可以在此时重新测量纤维。 实验完成后，按下下方工具栏中的 停止 按钮关闭细胞查找器窗口。保存文件，然后启动一个新文件。 要分析数据，请打开程序“细胞溶解器桌面”。单击 导入，然后选择要分析的文件。 程序完成分析后，查找蓝色、红色和灰色峰。蓝色峰值是程序接受的瞬态。红色峰是程序拒绝的瞬态，灰色峰是用户拒绝的瞬态。注意：可以在分析软件中调整剔除标准。通常，如果值超过最大导数限制，则拒绝这些值，并且根据曲线拟合 R2 值 <0.95 拒绝瞬态。 单击 导出。勾选以下框： 平均瞬态数据 并 导出到 excel。 完成后，关闭所有计算机。取出培养板，并处理掉。用去离子水和70%乙醇清洁起搏器电极。