3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

참고: 모든 세포 조작과 배양 접시 및 배지 준비는 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 층류 후드는 사용 전과 가공 후에 모든 표면을 70% 에탄올로 닦아 철저히 청소해야 합니다. 설명된 프로토콜은 CERO 3D 인큐베이터 및 바이오리액터(이하 벤치탑 바이오리액터라고 함)의 신경 분화에 최적화되어 있습니다. 이 탁상용 바이오리액터는 각각 최대 용량이 50mL인 특수 바이오리액터 튜브를 위한 4개의 슬롯을 제공합니다. 온도 및CO2 수준은 연속적으로 제어되고, 배양 파라미터(예를 들어, 회전 속도 및 시간)는 각 튜브에 대해 독립적으로 조절된다. 모든 흡인 단계는 달리 명시되지 않은 경우 흡인 피펫과 진공 펌프를 사용하여 수행되었습니다. 1. hiPSC의 배양 및 확장 참고: 엔지니어링된 독시사이클린 유도성 NGN2 hiPSC 라인 BIONi010-C-13이 이 프로토콜에 사용됩니다. 여기에 제공된 확장 프로토콜은 6cm 페트리 접시에 최적화되어 있지만 원하는 경우 대체 배양 형식을 사용할 수 있습니다. 차가운 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)/F12(-/-)에 최종 농도 0.083mg/mL/10cm2로 희석한 기저막 매트릭스로 6cm 페트리 접시를 코팅합니다. 코팅된 접시를 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.참고: 기저막 매트릭스 용액 준비에 대한 자세한 프로토콜은 제조업체의 지침에서 찾을 수 있습니다. hiPSC는 확장을 위해 대체 세포외 매트릭스에서 배양할 수 있습니다. EBiSC 세포주 사용자 프로토콜21 에 따라 냉동보존된 hiPSC를 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + 10μM ROCK 억제제(Y-27632)에서 해동합니다. 60mm 접시 당 1 ×10 6 개의 생존 가능한 세포의 파종 밀도가 권장됩니다. 다음날 배지를 ROCK 억제제가 없는 피더가 없는 iPSC 유지 배지로 변경하고 매일 배지 교체를 수행합니다. hiPSC 배양이 60%-80%의 합류점에 도달하면 계대배양을 시작합니다. 차별화된 영역을 확인하고 면적이 5%를 초과하는 경우 콜로니를 수동으로 청소합니다.참고: 미분화 hiPSC는 두드러진 핵소체와 더 적은 세포질을 가진 둥근 세포로 나타납니다. 평평하고 빽빽하게 채워진 식민지는 해동 또는 통과 후 일찍 형성됩니다. hiPSC 배양의 예시적인 명시야 이미지는 그림 1에 나와 있습니다. 추가 정보는 EBiSC 세포주 사용자 프로토콜21에 제공됩니다. 통과를 위해 기저막 매트릭스 코팅 접시와 피더가 없는 iPSC 유지 관리 매체를 준비합니다. hiPSC 배양물로부터 배지를 흡인하고, Ca 2+ 및 Mg2+가 없는 1x 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS) 중의 0.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 세포를 2배 헹굽니다(DPS [-/-], 재료 표 참조). 상층액을 제거하고 2cm 페트리 접시에 0.5x DPBS(-/-)에 1mM EDTA 6mL를 추가합니다. 세포를 인큐베이터에서 3분 동안 37°C에서 인큐베이션한다. EDTA 용액 1.5mL를 흡인하고 3-5분 동안 계속 배양합니다. 세포 분리를 용이하게 하기 위해 접시를 부드럽게 두드리십시오.알림: 시각적 평가로 분리를 확인하십시오. hiPSC 콜로니는 5분 후에 분리되기 시작해야 하지만 더 높은 융합 hiPSC 배양에서는 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다. 콜로니가 분리되지 않으면 배양 시간을 10분까지 늘리되 이 시간을 초과하지 마십시오. 5mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지를 6cm 페트리 접시에 추가하고 10mL 혈청학적 피펫 또는 광구경 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 2배 부드럽게 재현탁합니다. 세포를 15mL 튜브로 옮깁니다.참고: hiPSC는 기계적 응력에 매우 민감합니다. 따라서 여러 번 다시 일시 중단하는 것은 피해야 합니다. 최종 세포 현탁액은 작은 콜로니 단편 (50-200 μm)으로 구성되어야합니다. 코팅된 배양 접시에서 상층액을 흡인하고 6cm 접시당 4mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지를 준비합니다. 작은 콜로니 조각을 1:10에서 1:40의 분할 비율로 갓 준비된 배양 접시에 옮기고 매일 배지를 교체하면서 37°C 및 5%CO2 에서 배양합니다.참고: 작은 집락은 통과 후 1-2시간 이내에 부착해야 합니다. 그림 1: 인간 유도 만능 줄기 세포 배양의 형태. (A,B) 균질한 형태와 정의된 가장자리를 가진 압축된 hiPSC 콜로니를 보여주는 다양한 합류점의 양질의 hiPSC 배양. (c) 콜로니 가장자리 주위에 분화된 세포의 신흥 클러스터가 있는 hiPSC 배양(흰색 점선). 스케일 바 = 200 μm. 약어: hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 2. 벤치탑 바이오리액터 시스템에서 hiPSC의 사전 배양(2일차) 참고: hiPSC 배양이 60%에서 80% 사이의 합류점에 도달하면 사전 배양을 시작합니다. 차별화된 영역에 대한 hiPSC 콜로니를 확인합니다. 이 재배 전 단계에서 hiPSC는 피더가 없는 iPSC 유지 배지에서 2일 동안 유지됩니다. 피더가 없는 iPSC 유지 배지와 10μM ROCK 억제제(Y-27632)로 구성된 배양 배지를 준비합니다. hiPSC에서 배지를 완전히 흡인하고 1x DPBS(-/-)로 세포를 두 번 부드럽게 헹굽니다. 예열된 트립신-EDTA 용액 2.0mL를 6cm 페트리 접시에 넣고 배양기에서 37°C에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 세포 분리를 용이하게 하기 위해 접시를 부드럽게 두드리거나 1-2분 더 배양합니다. 접시당 5mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + ROCK 억제제에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 세포 특이화를 보장합니다. 앞서 설명한 바와 같이 자동 세포 계수기를 사용하여 100 μL의 세포 현탁액에서 세포 번호를 결정하십시오20. 바이오리액터 튜브당 15 ×10 6 셀에 해당하는 부피를 50 mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡인하고 2mL의 피더가 없는 iPSC 유지 배지 + ROCK 억제제에 세포를 재현탁합니다. 각 50mL 튜브에 18mL의 배지(세포 파종 밀도 0.75 × 106 cells/mL)를 채웁니다. 세포 현탁액을 생물반응기 튜브(튜브당 20mL)에 분주합니다. 튜브를 생물 반응기 시스템에 넣습니다. 다음 배양 파라미터를 설정한다: 2초 회전 주기, 60 rpm 회전 속도, 교반 휴지 없음, 37°C, 및 무제한 지속 시간동안 5%CO2 20. 바이오리액터 디스플레이를 통해 배양 프로그램을 시작합니다. 다음날 미디어를 교체하십시오. 응집체가 ~5분 동안 생물반응기 튜브에 가라앉도록 합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오.알림: 응집체가 서로 달라붙어 이질적인 골재 현탁액을 만들 수 있으므로 10분 이상 침전시키지 마십시오. 생물 반응기 튜브에 ~5mL의 배양 배지를 그대로 두는 것이 좋습니다. 튜브당 ROCK 억제제가 없는 신선한 피더가 없는 iPSC 유지 배지 15mL를 추가하고 벤치탑 바이오리액터에서 24시간 동안 배양을 계속합니다. 3. hiPSC의 초기 뉴런으로의 분화(0일) 신경기저 배지(NBM) 준비: 안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 포함된 50% DMEM/F-12, 50% 신경기저 배지, 0.5x 무혈청 보충제(50x), 0.5x 무혈청 보충제 보텐슈타인의 N-1 제형(100x), 0.5x 안정화된 L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 0.5x MEM 비필수 아미노산 용액(100x), 500nM 피루브산나트륨(100mM), 50nM 2-메르캅토에탄올(50mM), 0.025% 인간 인슐린 용액 및 5U/mL 페니실린-스트렙토마이신.알림: NBM은 4°C에서 보관해야 하며 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. hiPSC 배양에 독시사이클린(DOX)을 추가하여 신경 분화를 시작합니다. 이를 위해 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하십시오. 튜브에 ~5mL를 남기고 세포에서 상층액을 조심스럽게 흡인하고 NBM과 2μg/mL DOX로 구성된 신경 유도 배지(NIM) 35mL를 추가합니다.알림: DOX는 빛에 민감하므로 작업 중에는 조명을 끄는 것이 좋습니다. 튜브를 벤치탑 생물반응기에 다시 넣고 배양을 계속합니다. 3.2단계에 설명된 대로 2일 동안 매일 미디어 변경을 수행합니다.참고: 현탁 배양에서 4일 후, 응집체는 해리될 수 있고, 초기 뉴런은 냉동 보존되거나 말단 성숙을 위해 직접 재도금될 수 있습니다. 4. 초기 뉴런의 냉동보존(2일차) 참고: 냉동 보존은 분화 과정에 필요하지 않으며 중요하지도 않지만 후속 성숙 및 분석을 위해 초기 뉴런의 대량 생산 및 저장이 가능하므로 적극 권장됩니다. 응집체가 생물 반응기 튜브에 침전되도록하십시오. 앞서 설명한 대로 상층액을 흡인합니다. 응집체를 멸균된 15mL 또는 50mL 튜브로 옮기고 1x DPBS(-/-)로 응집체를 2배 부드럽게 헹굽니다. 응집체를 방해하지 않고 가능한 한 상층액을 조심스럽게 흡인하십시오. 펠릿 크기에 따라 예열된 세포 해리 효소 2-5mL를 첨가하고 수조에서 37°C에서 약 10분 동안 세포를 배양합니다. 응집체가 해리될 때까지 2분마다 침전된 골재를 부드럽게 다시 부유시킵니다.참고: 배양 7-10분 후에 거의 균질한 세포 현탁액을 얻어야 합니다. 예열된 NBM 배지의 3배 부피를 추가하고 세포 특이화를 보장하기 위해 세포를 조심스럽게 재현탁합니다. 세포 번호를 결정하고 냉동 보존을 위해 해당 부피를 15mL 또는 50mL 튜브에 옮깁니다.알림: 동결 배지의 5-10 ×10 6 cells/mL의 세포 밀도가 권장됩니다. 세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 흡인하고 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 함유하는 해당 부피의 동결 배지에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 냉동 보존에 적합한 바이알(1mL/바이알)에 세포 현탁액을 분취합니다. 바이알을 즉시 2-프로판올로 채워진 사전 냉장된 저속 냉동 용기로 옮기고 용기를 -80°C에서 밤새 두십시오. 장기 보관을 위해 다음날 바이알을 -150°C에 두십시오.알림: 액체 2-프로판올은 가연성이 높으며 접촉 시 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 열을 피하고 보호 장갑과 안경을 착용하십시오. 5. 단층 배양에서 hiPSC 유래 뉴런의 성숙 hiPSC 유래 뉴런의 장기 배양을 위해 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅 배양 접시를 준비합니다.폴리-L-오르니틴 원액을 1x DPBS(-/-)에서 0.001%로 희석하고 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 접시를 코팅합니다. 폴리-L-오르니틴 용액을 흡인하고 플레이트를 1x DPBS(-/-)로 한 번 세척합니다. 라미닌 용액을 1x DPBS(-/-)에 최종 농도 10μg/mL로 희석하고 접시를 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.알림: 코팅 절차에는 cm2당 0.1-0.15mL의 부피가 권장되고 모든 세척 단계에는cm2당 0.2mL가 권장됩니다. 대체 코팅 기질을 사용할 수 있지만 세포 부착 및 성숙에 대한 잠재적 영향을 평가해야 합니다. 냉동보존된 세포를 해동합니다. 이를 위해 극저온 오빌을 수조(37°C로 설정)에 넣고 냉동 세포 현탁액의 작은 덩어리가 남을 때까지 약 1분 동안 소용돌이칩니다. 세포 현탁액을 10mL의 예열된 NBM으로 준비된 15mL 튜브에 조심스럽게 적가합니다. 1mL의 NBM으로 극저온 난을 헹구고 세포 현탁액을 동일한 15mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 NIM 1-2mL를 추가합니다. 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁하고 세포 번호를 결정하십시오. 코팅된 세포 배양 접시에서 남은 라미닌 용액을 흡인하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 NIM에서 1× 5 cells/cm2 의 파종 밀도로 세포를 시딩합니다. 24시간 후 배지를 ROCK 억제제 없이 NIM으로 전환합니다. 4 일 동안 매일 매체 변경을 수행하십시오. NGN2 유도의 초기 단계 후, DOX를 생략하고 원하는 성숙 단계에 도달할 때까지 일주일에 2회 하프 배지를 교체하면서 NBM에서 세포를 배양합니다.참고: iNGN2 뉴런과 성상교세포의 공배양은 세포 생존, 부착, 성숙 및 전기적 활동을 증가시키는 것이 좋습니다13,22. 6. hiPSC 유래 뉴런의 특성화 참고: 뉴런 유도체로의 분화는 다음 기술로 평가할 수 있습니다. 면역세포화학 및 이미징hiPSC 유래 뉴런에서 배지를 흡인하고Ca2+ 및 Mg2+ (+/+)가 있는 1x DPBS로 세포를 한 번 세척합니다.알림: 세포가 표면에서 매우 쉽게 분리될 수 있으므로 우선적으로 웰 가장자리에 조심스럽게 피펫을 끼우십시오. 0.2x DPBS(+/+)로 세포의 완전한 커버리지를 보장하기 위해 모든 세척 단계에 cm2 당 2mL의 부피가 권장됩니다. 상온(RT)에서 15분 동안 DPBS 중 4% 파라포름알데히드(+/+)를 함유한 고정 용액을 사용하여 신경세포를 고정한다. cm2 당 0.1mL의 부피가 권장됩니다.참고: DPBS의 파라포름알데히드(4%)는 급성 독성 및 잠재적인 발암성이 있는 유해하고 피부 자극적인 용액입니다. 열을 피하고 보호 장갑과 안경을 착용하고 흡입을 피하고 통풍이 잘되는 환경에서만 용액을 사용하십시오. 세포를 1x DPBS(+/+)로 2배 부드럽게 헹구고 염색을 진행합니다.알림: 고정 셀은 추가 처리가 있을 때까지 최대 4개월 동안 1°C에서 DPBS(+/+)에 보관할 수 있습니다. 샘플에서 DPBS(+/+)를 흡인합니다. RT에서 60분 동안 1% BSA 및 0.2% Triton-X-100을 포함하는 1x DPBS(+/+)로 세포를 투과시키고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.참고: cm2 당 0.2mL의 부피를 권장합니다. 상청액을 제거하고, 각각의 1차 항체를 염색 완충액(1% BSA를 함유하는 1x DPBS[+/+])에 희석하여 4°C에서 밤새 세포를 인큐베이션한다( 물질 표 참조). 세포가 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 부피가 권장됩니다. 염색 완충액을 흡인하고 세포를 1x DPBS(+/+)로 3배 헹굽니다. 해당 2차 항체( 재료 표 참조)를 염색 완충액에 1:1,000의 최종 농도로 희석합니다. 어둠 속의 RT에서 1시간 동안 희석된 항체 용액에서 세포를 배양합니다. 세포가 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 부피가 권장됩니다. 2차 항체 용액을 흡인하고 세포를 1x DPBS(+/+)로 2배 헹굽니다. RT에서 5분 동안 DPBS(+/+)로 희석한 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 핵을 반대 염색합니다.참고: cm2 당 0.1-0.15mL의 작업 부피가 권장됩니다. 세포를 2x DPBS(+/+)로 1배 헹굽니다. 이미징될 때까지 4°C에서 DPBS(+/+)에 세포를 보관합니다.참고: 명시야 영상은 형태학적 변화와 신경돌기 성장을 추적하는 데 적합합니다. 또한, 입체형 마커 발현은 형광 현미경에 의해 평가될 수 있다. 미분화 hiPSC는 OCT 3/4 및 NANOG를 발현하지만 베타-III-튜불린(TUBB3) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2)는 신경돌기 및 축삭을 시각화하기 위한 신경 마커 역할을 할 수 있습니다. 신경돌기 네트워크는 명시야 또는 형광 이미지에서 신경돌기 길이를 결정하여 추가로 평가할 수 있습니다. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)에 의한 유전자 발현 분석배지를 흡인하고 세포를 1x DPBS(-/-)로 한 번 헹굽니다.참고: cm2 당 0.2mL의 부피를 권장합니다. 차가운 RNA 용해 완충액을 추가하고 긁어서 세포를 수확합니다. 적합한 컬럼 기반 키트를 사용하여 RNA를 분리하고, UV 광분광법으로 RNA 농도를 결정한다. 총 RNA 250ng과 역전사에 적합한 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다. 2.5ng의 cDNA를 이중으로 포함하는 분자 비콘 qPCR 반응을 준비합니다. 적절한 마스터 믹스 및 해당 프라이머 분석(20 )을 사용한다( 재료 표 참조). 60°C에서 20초 동안 프라이머 어닐링과 함께 45 사이클을 적용하여 qPCR을 실행합니다. 상대적 유전자 발현 수준을 하우스키핑 유전자 GAPDH, HPRT1 및 GUSB의 평균으로 정규화합니다. 미분화 hiPSC를 교정기로 사용하여 ΔΔCt 방법23을 적용합니다.