在三维悬浮生物反应器中产生人神经原蛋白2诱导神经元

注意：所有细胞操作以及培养皿和培养基制剂应在无菌条件下进行。层流罩应在使用前和加工后用70%乙醇擦拭所有表面彻底清洁。所描述的协议针对CERO 3D培养箱和生物反应器（在下文中称为台式生物反应器）中的神经元分化进行了优化。该台式生物反应器提供四个用于专用生物反应器管的插槽，每个插槽的最大容量为 50 mL。连续控制温度和CO2 水平，并独立调节每个试管的培养参数（例如，转速和时间）。除非另有说明，则所有抽吸步骤均使用吸液管和真空泵进行。 1. hiPSC的培养和扩增 注意：本协议中使用工程多西环素诱导的NGN2 hiPSC系BIONi010-C-13。此处提供的扩增方案针对 6 cm 培养皿进行了优化，但如果愿意，可以使用替代培养形式。 用基底膜基质涂覆6厘米培养皿，在冷Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）/ F12（-/-）中稀释，最终浓度为0.083mg / mL / 10cm2。将包衣培养皿在37°C孵育至少30分钟。注意：制备基底膜基质溶液的详细方案可以在制造商的说明中找到。hiPSCs可以在替代的细胞外基质上培养以进行扩增。 根据EBiSC细胞系用户协议21 在无饲养层iPSC维持培养基+ 10μM ROCK抑制剂（Y-27632）中解冻冷冻保存的hiPSC。建议接种密度为每60 mm培养皿1×106 个活细胞。 第二天将培养基更换为不含ROCK抑制剂的无饲养层iPSC维持培养基，并每天更换培养基。 当hiPSC培养物达到60%-80%的汇合度时开始传代。检查不同的区域，如果面积超过5%，请手动清洁菌落。注意：未分化的hiPSC表现为圆形细胞，具有突出的核仁和较少的细胞质。扁平且紧密堆积的菌落在解冻或传代后早期形成。hiPSC培养物的示例明场图像如图 1所示。更多信息在EBiSC细胞系用户协议21中提供。对于传代，准备基底膜基质包被的培养皿和无饲养层的iPSC维持培养基。 从hiPSC培养物中吸出培养基，并在不含Ca 2+和Mg2+的1x Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中用0.5mM乙二胺四乙酸（EDTA）冲洗细胞2x（DPS [-/-]，参见材料表）。 取出上清液，在 1x DPBS （-/-） 中加入 2 mL 0.5 mM EDTA 到 6 cm 培养皿中。将细胞在37°C下在培养箱中孵育3分钟。 吸出 1.5 mL EDTA 溶液并继续孵育 3-5 分钟。 轻轻敲击培养皿以促进细胞分离。注：通过目视评估检查脱离。hiPSC 菌落应在 5 分钟后开始分离，但对于融合度较高的 hiPSC 培养物，可能需要更长的孵育时间。如果菌落不分离，则将孵育时间增加到10分钟，但不要超过此时间范围。 将 5 mL 无饲养层 iPSC 维持培养基加入 6 cm 培养皿中，并用 10 mL 血清移液管或使用宽口径移液器吸头轻轻重悬菌落 2 倍。将细胞转移到 15 mL 管中。注意：hiPSC对机械应力高度敏感;因此，应避免多次重悬。最终细胞悬液应由小的菌落片段（50-200μm）组成。 从包被的培养皿中吸出上清液，每 6 cm 培养皿制备 4 mL 无饲养层 iPSC 维持培养基。 将小菌落片段以1：10至1：40的分流比转移到新鲜制备的培养皿中，并在37°C和5%CO2 下培养，每天更换培养基。注意：小菌落应在传代后 1 或 2 小时内附着。 图1：人诱导多能干细胞培养物的形态 。 （A，B）不同汇合度的高质量hiPSC培养物显示出具有均匀形态和明确边缘的致密hiPSC集落。（C）hiPSC培养，菌落边缘周围出现分化细胞簇（白虚线）。比例尺 = 200 μm。缩写：hiPSC = 人诱导多能干细胞。 请点击此处查看此图的大图。 2. 在台式生物反应器系统中预培养 hiPSC（第 2 天） 注意：当hiPSC培养物达到60%至80%之间的汇合度时，开始预培养。检查hiPSC菌落是否有不同的区域。在此预培养阶段，将hiPSC在无饲养层iPSC维持培养基中维持2天。 制备培养基，由无饲养层iPSC维持培养基和10μM ROCK抑制剂（Y-27632）组成。 从 hiPSC 中完全吸出培养基，并用 1x DPBS （-/-） 轻轻冲洗细胞两次。 向6cm培养皿中加入2.0mL预热的胰蛋白酶-EDTA溶液，并在培养箱中于37°C孵育细胞3分钟。 轻轻敲击培养皿以促进细胞分离，或孵育 1-2 分钟。 将细胞重悬于每培养皿 5 mL 无饲养层的 iPSC 维持培养基 + ROCK 抑制剂中。将细胞悬液转移到 15 mL 或 50 mL 管中，并通过移液轻轻混合以确保细胞单一化。 如前所述，使用自动细胞计数器确定 100 μL 细胞悬液中的细胞数20。将每个生物反应器管中 15 × 106 个细胞的相应体积转移到 50 mL 管中。 将细胞以300× g 离心3分钟。 吸出上清液并将细胞重悬于 2 mL 无饲养层的 iPSC 维持培养基 + ROCK 抑制剂中。 用 18 mL 培养基填充每个 50 mL 管（细胞接种密度为 0.75 × 106 个细胞/mL）。将细胞悬液分配到生物反应器管中（每管 20 mL）。 将管子放入生物反应器系统。设置以下培养参数：2 秒旋转周期，60 rpm 旋转速度，无搅拌暂停，37 °C 和 5% CO2 无限期20. 通过生物反应器显示屏 启动 培养程序。 第二天更换介质。让聚集体在生物反应器管中沉淀~5分钟。小心吸出上清液。注意：不要让聚集体稳定超过 10 分钟，因为它们可能会相互粘附并形成异质聚集悬浮液。建议在生物反应器管中留下~5mL培养基。 每管加入 15 mL 不含 ROCK 抑制剂的新鲜无饲养层 iPSC 维持培养基，并在台式生物反应器中继续培养 24 小时。 3. hiPSC 分化为早期神经元（第 0 天） 制备神经基础培养基 （NBM）：50% DMEM/F-12 与稳定的 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、50% 神经基础培养基、0.5x 无血清补充剂 （50x）、基于 Bottenstein N-1 配方的 0.5x 无血清补充剂 （100x）、0.5x 稳定的 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、0.5x MEM 非必需氨基酸溶液 （100x）、500 nM 丙酮酸钠 （100 mM）、50 nM 2-巯基乙醇 （50 mM）、0.025% 人胰岛素溶液和 5 U/mL 青霉素-链霉素。注意：NBM必须储存在4°C，最多可以使用2周。 通过在 hiPSC 培养物中添加多西环素 （DOX） 来开始神经元分化。为此，让聚集体在生物反应器管中沉淀下来。小心地从细胞中吸出上清液，在管中留下~5mL，并加入由NBM和2μg/ mL DOX组成的35mL神经诱导培养基（NIM）。注意：由于DOX对光敏感，建议在工作时关闭灯。 将试管放回台式生物反应器中并继续培养。 每天执行介质更换，持续 2 天，如步骤 3.2 中所述。注意：悬浮培养4天后，可以解离聚集体，并将早期神经元冷冻保存或直接重新铺板以进行终末成熟。 4. 早期神经元的冷冻保存（第 2 天） 注意：冷冻保存不是必需的，对分化过程并不重要，但强烈建议使用，因为可以产生和储存大量早期神经元，以供随后的成熟和分析。 让聚集体在生物反应器管中沉淀下来。如前所述吸出上清液。 将聚集体转移到无菌的 15 mL 或 50 mL 管中，并用 1x DPBS （-/-） 轻轻冲洗聚集体 2 倍。尽可能小心地吸出上清液，不要干扰聚集体。 根据沉淀大小，加入2-5mL预热的细胞解离酶，并将细胞在37°C的水浴中孵育约10分钟。每2分钟轻轻重悬沉淀的聚集体，直到聚集体解离。注意：孵育7-10分钟后应获得几乎均匀的细胞悬液。 加入三倍体积的预热NBM培养基，并小心地重悬细胞以确保细胞单一化。 确定细胞数量并将相应的体积转移到 15 mL 或 50 mL 管中以进行冷冻保存。注意：建议细胞密度为5-10×106 个细胞/ mL冷冻培养基。 将细胞以300 ×g 离心3分钟。 吸出上清液并将细胞沉淀轻轻重悬于含有10%二甲基亚砜（DMSO）的相应体积的冷冻培养基中。 将细胞悬液分装在合适的小瓶中进行冷冻保存（1 mL/小瓶）。 立即将小瓶转移到装有2-丙醇的预冷慢速冷冻容器中，并将容器置于-80°C过夜。第二天将小瓶置于-150°C进行长期储存。注意：液体2-丙醇是高度易燃的，接触时可能会造成眼睛损伤。远离热源，戴防护手套和眼镜。 5. hiPSC衍生神经元在单层培养物中的成熟 制备聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿，用于长期培养hiPSC衍生的神经元。将聚-L-鸟氨酸储备溶液在1x DPBS（-/-）中稀释至0.001%，并在4°C下包被培养皿过夜，或在37°C下涂覆4小时。 吸出聚-L-鸟氨酸溶液并用1x DPBS（-/-）洗涤板一次。 将层粘连蛋白溶液在1x DPBS（-/-）中稀释至终浓度为10μg/ mL，并将培养皿在4°C孵育过夜，或在37°C孵育4小时。注意：对于包衣程序，建议体积为每cm 2 0.1-0.15 mL，对于所有相关洗涤步骤，建议体积为每cm2 0.2 mL。可以使用替代涂层基材，但应评估对细胞附着和成熟的潜在影响。 解冻冷冻保存的细胞。为此，将冷冻管置于水浴（设置为37°C）中并旋转约1分钟，直到留下一小团冷冻细胞悬液。 小心地将细胞悬液滴入用 10 mL 预热的 NBM 制备的 15 mL 管中。用 1 mL NBM 冲洗冷冻管，并将细胞悬液转移到相同的 15 mL 管中。 将细胞以300× g 离心3分钟。 吸出上清液并加入 1-2 mL 补充有 10 μM ROCK 抑制剂的 NIM。 小心重悬细胞沉淀并确定细胞数量。 从包被的细胞培养皿中吸出剩余的层粘连蛋白溶液，并在补充有10μM ROCK抑制剂的NIM中以1×105 个细胞/ cm2的接种密度接种细胞。 24小时后将培养基切换到没有ROCK抑制剂的NIM。 每天更换培养基 4 天。 在NGN2诱导的初始阶段之后，省略DOX并在NBM中培养细胞，半培养基每周更换2次，直到达到所需的成熟阶段。注意：建议将iNGN2神经元与星形胶质细胞共培养，以提高细胞存活率，附着，成熟度和电活性13，22。 6. hiPSC衍生神经元的表征 注意：可以通过以下技术评估神经元衍生物的分化。 免疫细胞化学和成像从hiPSC衍生的神经元中吸出培养基，并用含有Ca 2+和Mg2+（+/+）的1x DPBS洗涤细胞一次。注意：小心移液，优先在孔边缘，因为细胞可能很容易从表面上分离。建议所有洗涤步骤的体积为 0.2 mL/cm 2 ，以确保 1x DPBS （+/+） 完全覆盖细胞。 在室温（RT）下，使用含有DPBS （+/ +）中4%多聚甲醛的固定溶液固定神经元细胞15分钟。建议体积为 0.1 mL/cm2 。注意：DPBS中的多聚甲醛（4%）是一种危险的皮肤刺激性溶液，具有急性毒性和潜在的致癌性。远离热源，戴防护手套和眼镜，避免吸入，仅在通风环境中使用溶液。 在 1x DPBS （+/+） 中轻轻冲洗细胞 2 次，然后继续染色。注意：固定细胞可以在4°C的DPBS（+/+）中储存长达1个月，直到进一步处理。 从样品中吸出DPBS （+/+）。透化细胞并用含有1%BSA和0.2%Triton-X-100的1x DPBS （+/ +）阻断非特异性结合位点，在室温下60分钟。注意：建议体积为每厘米 20.2 mL。 除去上清液并将细胞在4°C孵育过夜，将相应的一抗稀释在染色缓冲液（含有1%BSA的1x DPBS [+ / +]）中（参见 材料表）。确保细胞完全被溶液覆盖。注意：建议体积为每cm2 0.1-0.15 mL。 吸出染色缓冲液并在 1x DPBS （+/+） 中冲洗细胞 3 次。 在染色缓冲液中以1：1，000的终浓度稀释相应的二抗（参见 材料表）。 将细胞在稀释的抗体溶液中在室温下在黑暗中孵育1小时。确保细胞完全被溶液覆盖。注意：建议体积为每cm2 0.1-0.15 mL。 吸出二抗溶液，并在 1x DPBS （+/+） 中冲洗细胞 2 次。 用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核，在室温下用DPBS（+/+）稀释5分钟。注意：建议工作体积为每cm2 0.1-0.15 mL。 在 1x DPBS （+/+） 中冲洗细胞 2 次。 将细胞储存在4°C的DPBS（+/ +）中直至成像。注意：明场成像适用于跟踪形态变化和神经突生长。此外，刻板型标志物的表达可以通过荧光显微镜进行评估。虽然未分化的hiPSC表达OCT 3/4和NANOG，但β-III-微管蛋白（TUBB3）和微管相关蛋白2（MAP2）可作为可视化神经突和轴突的神经元标志物。可以通过确定明场或荧光图像中的神经突长度来进一步评估神经炎网络。 通过定量实时聚合酶链反应 （qPCR） 进行基因表达分析吸出培养基并在1x DPBS（-/-）中冲洗细胞一次。注意：建议体积为每厘米 20.2 mL。 加入冷RNA裂解缓冲液并通过刮擦收获细胞。 使用合适的基于色谱柱的试剂盒分离RNA，并通过紫外光光谱法测定RNA浓度。 使用 250 ng 的总 RNA 和合适的逆转录试剂盒生成 cDNA。 制备含有 2.5 ng cDNA 的一式两份的分子信标 qPCR 反应。使用适当的预混液和相应的引物测定20 （见 材料表）。 通过应用45个循环，引物在60°C下退火20秒来运行qPCR。 将相对基因表达水平标准化为管家基因GAPDH，HPRT1和GUSB的平均值。应用ΔΔCt方法23，使用未分化的hiPSC作为校准品。