İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Tüm hayvan bakım protokolleri, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine uygun olarak British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Mikroglia izolasyonu için beyin sindirimi Şekil 1: Protokolün basit akış şeması. Fareler önce HBSS ile transkardiyal olarak perfüze edilir ve beyin diseke edilir. Beyin daha sonra tek bir hücre homojenatı ile sonuçlanmak için kimyasal sindirim ve mekanik bozulma yoluyla ayrışır. Bağışıklıkla zenginleştirilmiş fraksiyon, süreksiz yoğunluk gradyanı yoluyla toplanır, ardından hücreler P2RY12 için boyanır. Boyanmış hücreler ya 1) RNA analizine ya da aşağı akış protein analizine yol açmak için floresan aktif hücre sınıflandırması (FACS) yoluyla sıralanır ve/veya 2) intranükleer proteinler için sabitlenir, geçirgen hale getirilir ve boyanır. Protein seviyesi, akış sitometrisi ile belirlenen ilgili kanaldaki medyan floresan yoğunluğu ile ölçülür. Mavi renkli kutular protokol adımının bir parçasıdır 1) Mikroglia izolasyonu için beyin sindirimi. Kırmızı renkli kutular protokol adımının bir parçasıdır 2) Protein ekspresyon analizi için intranükleer akış boyama. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Reaktiflerin hazırlanmasıNOT: HPTM analizi için hem RNA hem de hücreleri toplamak üzere bir ekstraksiyon planlıyorsanız, transkripsiyon ve translasyon inhibitörlerini içerecek modifikasyonlar için bölüm 1.7.1’e bakın. Bununla birlikte, hücreler buz üzerinde tutulduğunda büyük ölçüde hareketsiz olduğu için sadece protein sinyalini değerlendiriyorsanız bu gerekli değildir.Floresanla aktive edilmiş hücre ayırma (FACS) tamponu (numune başına 20 mL): % 2’lik bir BSA çözeltisi oluşturmak için sığır serum albüminini (BSA) 1x Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde çözün. EDTA’yı %2 BSA çözeltisi içinde 1 mM’lik nihai konsantrasyona çözün. Filtre, 0,2 μm’lik bir filtre kullanarak sterilize edin ve kullanımdan önce 1 haftaya kadar 4 °C’de saklayın. Sindirim tamponu (numune başına 1 mL): HBSS’de bir papain şişesini, 0.5 mM EDTA ile 1 mM L-sistein içinde 20 U / mL’lik bir nihai konsantrasyona yeniden sulandırın. 37 °C’de en az 10 dakika veya dokuyu sindirmeye hazır olana kadar etkinleştirin. Kullanımdan hemen önce, 200 U / mL’lik bir nihai konsantrasyona kadar aktif papain çözeltisine DNaz I ekleyin. Bunu deney gününde hazırlayın ve saklamayın. İzotonik yoğunluk gradyan çözeltisi (numune başına 5.5 mL): Soğuk yoğunluk gradyan ortamına 10x HBSS’yi 1x HBSS’lik bir nihai konsantrasyona ekleyin, bu da 1.117 g/mL’lik bir nihai yoğunlukla sonuçlanır. Kullanmadan önce en az 30 saniye karıştırmak için vorteks. Kullanana kadar buzun üzerine koyun. yoğunluk gradyan çözeltisi (numune başına 4 mL): 1.043 g/mL nihai yoğunluk ile ‘lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1x HBSS’ye izotonik yoğunluk gradyanı ekleyin. Katmanlama sırasında görselleştirme için pembe bir çözelti oluşturmak için her mL yoğunluk gradyanı için 20 μL fenol kırmızısı ekleyin. Kullanmadan önce en az 30 saniye vorteksleyin. Kullanana kadar buzun üzerine koyun. yoğunluk gradyan çözeltisi (numune başına 2 mL): 1.082 g/mL’lik bir nihai yoğunluk ile ‘lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1x HBSS’ye izotonik yoğunluk gradyanı ekleyin. Katmanlama sırasında görselleştirme için mavi bir çözelti oluşturmak için her mL yoğunluklu ortam için 5 μL tripan mavisi ekleyin. Kullanmadan önce en az 30 saniye vorteksleyin. Kullanana kadar buzun üzerine koyun. Perfüzyon ve beyin diseksiyonuNOT: Perfüzyon protokolü, fare torakotomisi, transkardiyal perfüzyon ve beynin çıkarılmasının video tasvirini içeren Posel ve ark.21. Burada yetişkin C57BL/6J erkek ve dişi fareler (10-15 haftalık, 20-30 g) kullanıyoruz, ancak bu protokol herhangi bir fare için torakotomi yapmak için kullanılabilir. Tüm hayvan prosedürleri, deneyler yapılmadan önce kurumsal etik kurul tarafından onaylanmalıdır.Fare anestezisi: Fareleri% 100 oksijen içinde% 4 İzofluran ile cerrahi anestezi düzlemini geçene kadar uyuşturun, bu bir ayak parmağı tutamıyla veya farenin ayağını sıkıca sıkıştırdıktan sonra refleks eksikliği ile doğrulanabilir. Fareyi sırt üstü yatırın ve dört pençesini plastik bir tepsiye eğik olarak yerleştirilmiş cerrahi diseksiyon tahtasına sıkıca sabitleyin ve burnun izofloran burun konisine sabitlendiğinden emin olun. Transferden sonra, devam etmeden önce hayvanın hala cerrahi anestezi düzlemini geçtiğinden emin olun. Fare torakotami: Forseps kullanarak karın derisini tutup kaldırın ve inen aort veya altta yatan herhangi bir organa zarar vermeden ksifosi ortaya çıkarmak için deriden ve karın duvarından sığ bir kesi yapın. Ksifos’u forseps ile kavrayın ve diyaframı ve karaciğeri ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin altında yanal kesiler yapın. İnce makas kullanarak göğüs kafesinin uzunluğu boyunca diyaframdan ve doku makası kullanarak göğüs kafesinden dikkatli sığ kesimler yapın ve kalbi ve akciğerleri transkardiyal perfüzyon için ortaya çıkarmak için sternumu farenin başının yakınındaki cerrahi istasyona sabitleyin. Transkardiyal perfüzyon: Bir peristaltik perfüzyon pompası hazırlayın ve borunun bir ucuna 26.5G’lik bir iğne takın. Borunun bir ucunu soğuk 1x HBSS şişesine sokarak ve boruyu 1x HBSS ile tamamen doldurmak için pompayı açarak boruyu prosedür için hazırlayın. Kalbi künt forseps ile tutarken, perfüzyon tüpü takılı 26.5G’lik bir iğnenin ucunu kalbin sol karıncığına sokun ve sağ kulakçıkta küçük bir kesi yapın. Fareyi en az 2-4 mL soğuk 15x HBSS ile ~20-1 mL/dk hızında dikkatlice perfüze etmek için perfüzyon pompasını açın.NOT: Tam bir perfüzyon genellikle karaciğer kanı temizlemeye başladığında ve kalple aynı renge geldiğinde endikedir. Beyin çıkarma: Doku diseksiyon makası kullanarak farenin kafasını kesin ve kafa derisinde boyundan buruna orta hat kesisi yapın. Kafatasını ortaya çıkarmak için deri kanatlarını yanlara doğru soyun ve kafatasının kuyruk ucundaki fazla doku ve kemikleri diseksiyon makasıyla çıkarın. Makasın bir bıçağını kafatasının altına, keskin tarafı kemiğe bakacak şekilde foramen magnumun içine dikkatlice kaydırın ve orta çizgiyi dikkatlice buruna doğru kesin. Diseksiyon makası kullanarak hem kafatasının tabanında hem de burnun yakınında yanal kesimler yapın. İnce forseps kullanarak, kafatası parçalarını kırmak ve beyni ortaya çıkarmak için kafatasını orta hattan dışa doğru canlandırın. Beyni bir spatula ile nazikçe kaldırın ve diseksiyon leke kağıdına yerleştirin. Beyin diseksiyonu: Beyni, buzla dolu kapalı bir Petri kabının üzerine 1x HBSS ile ıslatılmış bir parça diseksiyon leke kağıdına yerleştirin. Beyincik çıkarın ve temiz bir tıraş bıçağı kullanarak beyin yarım kürelerini ikiye bölün. Hipokampus ve üst üste binen korteksi sağlam tutarken beyin sapını, striatumu ve beyaz maddeyi her yarım küreden çıkarın. İzole korteks ve hipokampal doku içeren hemisferleri 5 mL soğuk 1x HBSS ile 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun.NOT: Diseksiyonların mümkün olduğunca çabuk yapılması önemlidir, böylece doku dekapitasyon ile diseke edilen dokunun buz üzerine 1x HBSS’ye son yerleştirilmesi arasında en fazla 2 dakika olacak şekilde soğuk kalır. Mikroglia’yı birden fazla hayvandan izole edersek, beyinler, sindirim vb. için tüm hayvan kohortunu işlemeye devam etmeden önce ~ 1 saat boyunca 1x HBSS’de buz üzerinde saklanabilir. Beyin sindirimi ve homojenizasyonuMekanik ve kimyasal ayrışma: Her fareden alınan beyin dokusunu ve 1 mL sindirim tamponunu buz üzerindeki ayrı Petri kaplarına yerleştirin. Temiz bir neşter bıçağı kullanarak beyni küçük parçalara (<1 mm) iyice doğrayın. Plastik bir transfer pipetinin ucunu kesin ve kıyılmış beyinlerin her birini buz üzerinde 24 oyuklu bir plaka içinde ayrı kuyucuklara dikkatlice aktarın. Plakayı şeffaf esnek filmle örtün ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.NOT: Doğru doğrandığında, beyin dokusu iyi kıyılmış sarımsağı andırır. Dounce homojenizasyonu: Sindirilmiş beyin solüsyonunu her bir kuyucuktan ayrı ayrı 7 mL cam dounce homojenizatörlere aktarın ve her biri 5 mL soğuk FACS tamponu ile doldurulmuş buz üzerinde homojenizatörler. Tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar her beyni gevşek havaneli (A) ile yaklaşık 30-40 kez hafifçe vurun. A tokmağı ile çırpındıktan sonra, tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için sıkı havaneli (B) ile 3-4 kez hafifçe hafifçe vurun.NOT: Homojenizatörün altındaki dokunun ezilmesini önlemek için tokmağı 3/4’ünden fazla aşağı itmeyin. Nihai çözelti opak ve sütlü olmalıdır.NOT: Tek bir deneyde birden fazla beyin sindiriliyorsa, beyin sindiriminin FACS tamponuna aktarılmasını zamanlayın, böylece her numune sadece 30 dakika boyunca sindirim tamponunda kalır. Aşırı sindirim, yüzey proteinlerinin bölünmesine neden olarak aşağı akış antikor bağlanmasını ve sinyalini azaltabilir. Bağışıklıkla zenginleştirilmiş fragman elde etmekYoğunluk gradyanının oluşturulması: Homojenatı her beyinden ayrı 15 mL polipropilen tüplere aktarın ve yoğunluk gradyanının nihai konsantrasyonunu elde etmek için her biri için 2.125 mL izotonik yoğunluk gradyanı ekleyin ve FACS tamponu ile 8.5 mL’ye ekleyin. İyice karıştırmak için 15 ml’lik tüpleri 20x yavaşça ters çevirin. Dar dereceli bir transfer pipeti kullanarak, temiz katmanlar oluşturmaya çok dikkat ederek her tüpe 4 mL yoğunluk gradyanını nazikçe yerleştirin. Transfer pipetlerini değiştirin ve 2 mL yoğunluk gradyanını nazikçe altına yerleştirin (Şekil 2A). 4 °C’ye soğutulmuş bir santrifüje aktarın ve frenleme rampası sıfıra ayarlandığında 20 dakika boyunca 500 x g’de döndürün. Bağışıklıkla zenginleştirilmiş parçanın toplanması: Temiz transfer pipetleri kullanarak, temiz bir transfer pipeti kullanarak miyelini 15 mL’lik tüpteki hacmin üstünden nazikçe aspire edin ve atın. Yoğunluk gradyanının üst parçasını bir transfer pipeti kullanarak 15 mL’lik temiz bir polipropilen tüpe dikkatlice toplayın. Bağışıklıkla zenginleştirilmiş fragmanı ( ve yoğunluk gradyan katmanlarının birleştiği yerin 1,5 mL üstünde ve 1,5 mL altında) 15 mL’lik yeni bir polipropilen tüpe dikkatlice toplayın (Şekil 2B). Yoğunluk gradyan ortamını seyreltmek için bağışıklıkla zenginleştirilmiş numuneye 10 mL FACS tamponu ekleyin ve iyice karıştırmak için tüpü hafifçe 20x ters çevirin.NOT: Hücreler tüpün kenarlarına yapışma eğiliminde olduğundan, sıvıyı toplarken pipeti tüpün kenarları boyunca yavaşça dolaştırarak toplama adımları sırasında numunedeki tüm hücrelerin toplandığından emin olun. Yokuş aşağı rampa freni sıfıra ayarlıyken 15 mL’lik tüpleri 4 °C’lik bir santrifüjde 500 x g’de 10 dakika santrifüjleyerek bağışıklıktan zenginleştirilmiş numunedeki hücreleri peletleyin. Sıkmanın hemen sonunda, süpernatanı dikkatlice çıkarın, 15 mL’lik tüpte yaklaşık 300 μL sıvı bırakın, peleti rahatsız etmemeye dikkat edin (görünmeyebilir). Hücrelerin spinde peletlendiğinden emin olmak için süpernatanı başka bir 15 mL’lik tüpte toplayın (yeniden süspanse edilen peletin hücre sayımları ile doğrulama yapıldıktan sonra bu fraksiyonu atın). Hücre peletini bir P1000 pipeti kullanarak 300 μL hacimde yeniden süspanse ettikten sonra, toplam hücre verimini tahmin etmek için hücreleri bir hemasitometre ile sayın. Şekil 2: Süreksiz yoğunluk gradyanı ile bağışıklıkla zenginleştirilmiş fragmanın elde edilmesi. (A) Beyin homojenatı yoğunluklu ortama yapılır, fenol kırmızısı ile pembe renkli 4 mL yoğunluklu orta renkli ve tripan mavisi ile 2 mL yoğunluklu orta renkli mavi altlığa sahiptir. (B) Santrifüjlemeyi takiben, fraksiyonlar ayrılmıştır. Mikroglia, ve yoğunluklu ortam parçalarının arayüzünde durur. Miyelin fragmanı 15 mL’lik tüpün tepesindedir ve atılacaktır. Spinin başarısız olması durumunda üst parça yedek olarak toplanır ve hiçbir hücre kurtarılmaz. Böyle bir durumda, gradyan bu kesir kullanılarak tekrarlanabilir. Bağışıklıkla zenginleştirilmiş fraksiyon aşağı yönde toplanır. Herhangi bir kırmızı kan hücresi içeren alt kısım tüpte kalır ve atılır. (C) Tüm katmanları gösteren örnek şekil. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Hücre dışı antikor boyamaEngelleme: Hücreleri buz üzerinde yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve hücreleri peletlemek için frenle 500 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için plakayı hafifçe vurarak lavabodaki süpernatanı hızla çıkarın ve hücre peletini kuyunun dibinde bozulmadan bırakın. Antikorların monositlere veya diğer FcR taşıyan hücrelere spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bir P200 pipeti (son konsantrasyon 10 μg/mL, seyreltme faktörü 1:50) kullanarak anti-fare CD16/32 FC-Reseptör bloke edici reaktif ile hücreleri 50 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Antikor boyama: P2RY12- Allophycocyanin (APC; seyreltme faktörü 1:50, 1:100 nihai kuyu konsantrasyonu için konsantrasyon 4 μg/mL, konsantrasyon 2 μg/mL) ve menekşe 525 canlı ölü boyama (1:100 nihai kuyu konsantrasyonu için seyreltme faktörü 1:50) içeren 2x ana karışımın uygun hacmini hazırlayın. Hücre süspansiyonuna 50 μL boyama ana karışımı ekleyin (bölüm 1.5.1’de bloke edildikten sonra elde edilir) ve plakayı karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.NOT: Bu protokol için hücrelerin P2RY12 ile boyanmasını öneriyoruz. İlk olarak, P2RY12, belirli hastalık bağlamlarında aşağı regüle edilebilen mikroglia için homeostatik bir belirteçtir. Örneğin, 5XFAD Alzheimer model fareleri, P2RY12 seviyelerini düşürmüştür ve bu da onları tanımlamayı zorlaştırabilir22. İzolasyon için kullanılabilecek alternatif boyalar arasında Tmem119, Cd11b ve CD4523 bulunur. İkinci olarak, konjuge florokrom APC, istenen antikor paneline uyacak şekilde ayarlanabilir. Bununla birlikte, APC veya PE gibi parlak bir florokromun seçilmesi, pozitif ve negatif popülasyonların kolayca ayırt edilebilir olmasını sağlamaya yardımcı olacaktır24. Boyamadan sonra, hücreleri yıkamak için her bir oyuğa doğrudan 200 μL FACS tamponu ekleyin. Süpernatanı hafifçe vurarak çıkarmak için 4 °C’de 500 x g’de döndürün. Hücreleri bir P200 pipeti ile 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin, 4 °C’de 500 x g’da döndürün ve tamponu kuyulardan çıkarmak için plakayı hafifçe vurun. Akış kontrollerinin hazırlanması: Boyamadan önce, gerekli akış kontrolleri için adım 1.5.1’de bloke ettikten sonra her numuneden gerekli hacimlerde hücreleri ayırın.NOT: Kapıları oluşturmak için her deney için akış kontrolleri gereklidir. Akış kontrolleri, ek bir hayvandan veya deney kuyularının her birinin bir kısmından alınabilir. Hücreleri bölerken, yüksek güvenle kapılar oluşturmak için kontrol başına 10.000-30.000 hücre gerektiğinden, kontrol başına yeterli hücre atadığınızdan emin olun.Üç ilgili akış kontrolü vardır: leke yok, canlı ölü ve P2RY12 izotip kontrolü. Leke kontrolü için herhangi bir antikor eklemeyiniz. P2RY12 izotip kontrolünde, hücreleri canlılık boyası (1:100) ve APC’ye (1:100) konjuge edilmiş bir izotip kontrol antikoru ile tedavi edin. Canlı ölü kontrolünü hazırlamak için, hücreleri ayrı bir kuyucuğa alın ve hücre hacminin yarısını 500 μL’lik bir tüpe taşıyın. 500 μL’lik tüpü 5 dakika boyunca -80 ° C dondurucuya koyun, ardından hücreleri öldürmek için 37 ° C inkübatöre 5 dakika yerleştirin. Ölü hücrelerin alikotunu canlı ölü kontrol kuyusuna geri koyun ve ölü hücreleri işaretlemek için menekşe 525 (seyreltme faktörü 1:100) üzerinde bir amin bağlayıcı canlılık boyası ile boyayın.NOT: Protokol, süpernatantın çıkarılması için bir fiske yöntemiyle plaka boyama için yazılmıştır. Bununla birlikte, bu, süpernatantın dönüşün tamamlanmasından hemen sonra çıkarılmasını gerektirir ve topağı bozmadan süpernatanı hızlı bir şekilde çıkarmak için hareketin yeterli kuvvetle yapılması gerekir. Alternatif olarak, boyama için aşağıdaki modifikasyonlarla 1.5 mL RNAse/DNaz içermeyen tüpler kullanılabilir: Hücreleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C’de 5 dakika boyunca 800 x g’da pelet yapın. Süpernatantı pipetlerle aspire edin. İpucu: Hız için, P200 uçlu 5 mL’lik bir transfer pipeti, süpernatanı hızlı ve doğru bir şekilde aspire edebilir. Aspirasyon yaparken peleti kontrol edin. Pelet görünmüyorsa, 50 μL süpernatan bırakın ve hesaplamaları buna göre ayarlayın. Antikorları yıkarken, süpernatantın eksik çıkarılmasını hesaba katmak için antikorların seyreltilmesini (200 μL yerine 1000 μL) artırmak için ek FACS ekleyin. Sitometreye bağlı olarak, sıralama için 1,5 mL’lik tüpleri kullanın ve gerekli malzeme miktarını azaltın. Mikroglia için FACS sıralamasıHazırlık: Her bir kuyucuğu bir P200 pipeti ile 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve etiketli akış sıralama tüplerine aktarın ve mL başına yaklaşık 5 x 105 olaylık bir konsantrasyon için toplam 500 μL’ye FACS tamponu ekleyin. Analize kadar karanlıkta buz üzerinde saklayın. 1.5 mL RNAse içermeyen tüplerdeki hücreler için bir yastık olarak 100 μL FACS tamponu ekleyerek sıralama sonrası tüpleri hazırlayın. Sitometre ayarları: Hücreleri, 100 μm nozül ile ayarlanmış bir akış sitometrisi hücre sıralayıcısında sıralayın. Hücreleri 18-20 psi kullanarak sıralayın. Geçitleme: Sitometrede, döküntüleri ayırt etmeye yardımcı olmak için leke kontrolü kullanmayan yan saçılma (SSC) alanı ve ileri saçılma (FSC) yüksekliği kullanarak hücre boyutu için geçit, bir hücre popülasyonunu görselleştirmek için SSC-A’yı bir kütük eksenine yerleştirin ve hücreleri seçmek için yakından kapı (kapı S1; Şekil 3). Herhangi bir çifti çıkarmak için, FSC-H ile FSC-W’yi çizin ve herhangi bir kalıntı ve çifti (kapı S2) kaldırarak hücre popülasyonunun etrafını yakından geçin. P2RY12 izotip kontrolünü kullanarak, APC kanalındaki hücreleri inceleyin ve P2RY12+ hücrelerini belirlemek için otofloresan kapısını ayarlayın. Leke yok ve canlı ölü kontrollerini kullanarak, menekşe 525 nm’de floresan olmayan hücreleri canlı hücreler olarak geçit edin. Sıralama: Menekşe 525 nm’ye karşı APC’yi çizin ve P2RY12+ olan ve FMO’lara (MG) göre yaşayan popülasyonu belirleyin. Bu hücreleri etiketli sıralama sonrası tüpüne sıralayın (Şekil 3). Nihai sıralama yüzdesi, toplam olayların yaklaşık ‘sidir ve olay toplam kaybının çoğunluğu S1 kapısında kaldırılan enkazdır (olayların ~’i hücrelerdir; Tablo 1). RNA izolasyonu ve analiziTranskripsiyon ve translasyon inhibitörleri: RNA ekstraksiyonu planlıyorsanız, izolasyonla ilişkili transkriptomik imzalar riskini ortadan kaldırmak için, tampon adımlarına translasyon ve transkripsiyon inhibitörlerini dahil edin. İnhibitör kokteylini Marsh ve ark. aktinomisin D, anizomisin ve triptolid25 dahil.İnhibitör hazırlama: İnhibitör stoklarını sulandırın ve aşağıdaki gibi saklayın: Aktinomisin D’yi dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 5 mg / mL’ye kadar sulandırın ve -20 ° C’de saklayın. Triptolidi DMSO’da 10 mM’ye kadar sulandırın ve -20 °C’de ışıktan koruyarak saklayın. Anizomisin’i DMSO’da 10 mg / mL’ye sulandırın ve ışıktan koruyarak 4 ° C’de saklayın. Tüm inhibitör stoklarını sulandırıldıktan sonra en fazla 1 ay saklayın. Tampon modifikasyonları: Protokoldeki dört farklı tampona aşağıdaki gibi inhibitörler ekleyin: Transkardiyal perfüzyonu gerçekleştirirken, HBSS’yi aktinomisin D (5 μg / mL, stoktan 1:1000) ve triptolid (10 μM, stoktan 1:1000) ile hazırlayın. Perfüzyonu takiben, beyinleri aktinomisin D (5 μg / mL, stoktan 1:1000), triptolid (10 μM, stoktan 1:1000) ve anizomisin (27.1 μg / mL, stoktan 1:368.5) içeren HBSS’de laboratuvara taşıyın. Aktinomisin D (5 μg/mL, stoktan 1:1000), triptolid (10 μM, stoktan 1:1000) ve anizomisin (27.1 μg/mL, stoktan 1:368.5) ile FACS tamponu hazırlayın. Aktinomisin D (5 μg/mL, stoktan 1:1000), triptolid (10 μM, stoktan 1:1000) ve anizomisin (27.1 μg/mL, stoktan 1:368.5) içeren sindirim tamponu hazırlayın. Aktinomisin D (5 μg/mL, stoktan 1:1000), triptolid (10 μM, stoktan 1:1000) ve anizomisin (27,1 μg/mL, stoktan 1:368,5) içeren HBSS ile sıralama sonrası yıkama tamponu hazırlayın.NOT: İnhibitörleri eklerken, kullanımdan hemen önce eklediğinizden emin olun ve kullanım sırasında hazırlanan tamponları ışıktan koruyun. Stok çözeltilerinin dondurulmasını önleyin. Sıralama sonrası yıkamalar: Hücreler, RNA izolasyonuna müdahale edecek FACS tamponunda 1.5 mL RNaz içermeyen tüplere ayrıldığından, hücrelerin yıkanması gerekir. Hücreleri 5 dakika boyunca 4 ° C’de 1000 x g’de döndürün ve yaklaşık 50 μL sıvı bırakarak süpernatanı çıkarın. Aktinomisin D (5 μg/mL, stoktan 1:1000), triptolid (10 μM, stoktan 1:1000) ve anizomisin (27.1 μg/mL, stoktan 1:368.5) içeren 200 μL 1x HBSS ekleyin ve iyice karıştırın. Sıkma işlemini tekrarlayın ve 50 μL sıvı bırakarak süpernatanı çıkarın (yıkama 1). 200 μL yıkama sonrası yıkama tamponu ekleyin, iyice karıştırın ve sıkma işlemini tekrarlayın ve 25 μL sıvı bırakarak süpernatanı çıkarın (yıkama 2). RNA ekstraksiyonu: Mikroglial hücrelerden RNA izolasyonu için, yüksek ve tutarlı RNA verimleri ve 9’un üzerinde RIN skorları için düşük girdili bir RNA izolasyon kiti kullanın (ürün önerileri için aşağıya ve Malzeme Tablosuna bakın). Hücre peletine, önerilen kit + β-merkaptoetanolden (1:100) 350 μL lizis tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.NOT: Gerekirse, protokol bu noktada askıya alınabilir. Numuneler, RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C’de lizis tamponunda saklanabilir. Depolamadan sonra RNA’yı çıkarıyorsanız, lizatı buz üzerinde çözün ve izolasyon için kite özel talimatlarla devam edin. Lizatı kolon tabanlı hücre parçalayıcıya aktarın (ürün önerileri için Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 dakika boyunca 2 ° C’de maksimum hızda santrifüjleyin. En az 14 μL RNaz içermeyen suda elute edin ve konsantrasyonu uygun şekilde belirleyin. RNA, bu noktadan sonra herhangi bir aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Şekil 3: Akış sıralaması için geçit stratejisi. Olaylar, SSC-A ve FSC-H (S1) üzerinde hücre boyutu için geçitlidir. Daha sonra, hücreler FSC-H ve FSC-W (S2) üzerinde tekiller olacak şekilde kapılanır. Singlet hücreleri, P2RY12-izotip kontrolü kullanılarak Comp-FL8-A::405-526-52 (mor 525 canlı ölü leke) üzerinde negatifse canlı ve Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) üzerinde pozitifse P2RY12+ olarak sıralanır. Hücreler MG olarak etiketlenir ve hem canlı hem de P2RY12+ ise sıralanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. GÜVENLIKLI NÜFUS Ebeveyn Sıklığı Toplam Frekans Saymak S1 68.10% 68.10% 162186 S2>S1 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ (670+) > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 Canlı (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 MG (P2RY12+ Canlı) >S2>S1 78.96% 50.30% 119794 Tablo 1: Geçit yüzdeleri ve beklenen olay numaralarını içeren örnek örnek köken tablosu. 2. Protein ekspresyon analizi için intranükleer akış boyama NOT: Bu noktada diğer hücre tipleri başlatılabilir, bu protokol HEK293 hücreleri, BV2 mikroglia benzeri hücreler ve insan IPSC’den türetilmiş mikroglia dahil olmak üzere kültürlenmiş hücrelerle test edilir. Hücrelerin sabitlenmesi ve boyanmasıNOT: Aşağıdaki protokol için, nükleer boyama için optimize edilmiş bir hücre içi boyama kiti kullanın. Görmek Malzeme Tablosu ürün önerileri için.Bölüm 1.5.2’den 96 oyuklu plakaya (5 x 104- 1 x 106 hücre) hücre dışı boyanmış hücreler. Hücreleri 4 °C’de 500 x g’de 5 dakika döndürün ve FACS tamponunu çıkarmak için hafifçe vurun.NOT: Medyan seviyelerin yüksek güvenilirliğine sahip veriler elde etmek için, oyuk başına en az 10.000 hücre kullanılmalıdır. Önerilen bir maksimum değer olmasa da, farklı varyasyon katsayılarının (CV) önemli bir etkisi olmadığından emin olmak için deney boyunca hücre sayısını tutarlı tutmak en iyisidir. Fiksasyon ve geçirgenleştirme: 200 μL 1x fiks konsantresi ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için P200 pipet ile hafifçe karıştırın. Karanlıkta 45-60 dakika inkübe edin. Plakayı oda sıcaklığında (RT) 500 x g’da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atmak için hafifçe vurun.NOT: Gerekirse, protokol bu noktada askıya alınabilir. Süpernatanı attıktan sonra, bağışıklık hücreleri için uzun süreli depolama tamponunda hücreleri yeniden askıya alın (ürün önerileri için Malzeme Tablosuna bakın). Numuneler 4 °C’de 12-18 saat saklanabilir, ışıktan korunabilir ve tampon buharlaşmasını önlemek için şeffaf filmle kaplanabilir. Her kuyucuğa 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin ve karıştırmak için bir P200 ile pipetleyin. RT’de 500 x g’de 5 dakika santrifüj plakası ve süpernatanı atmak için hafifçe vurun. Geçirgenleştirme tamponunu toplam 3 kez yıkayın. Akış kontrollerinin hazırlanması: Gerekli akış kontrolleri için her numuneden hücre hacmini bölün (kontrol kuyusu başına 10.000-30.000 hücre yeterlidir).Leke kontrolünü hazırlamak için, lekesiz hücreleri sıralamadan veya boyanmamış hücrelerden herhangi bir antikor almayacak ayrı bir kuyucuğa sabitleyin. Floresan eksi bir (FMO) kontrolünü hazırlamak için, o kanaldaki antikor hariç, paneldeki antikorların her biri için alikot hücreleri. İlgili kanallar için, geçit için FMO’ya izotip kontrol antikorunu ekleyin. Örneğin, P2RY12-APC ve H3K27Ac-AlexaFluor568 içeren bir panelde iki FMOS olmalıdır: (1) sadece H3K27Ac-AlexaFluor568 ve P2RY12 izotip kontrol antikoru içeren APC-FMO ve (2) sadece P2RY12-APC ve izotip kontrol primeri ve 568 sekonder içeren 568-FMO.NOT: Bu protokol, tek bir HPTM’yi test etmek için sunulmuştur, ancak farklı floroforlara konjuge edilmiş birçok HPTM içeren paneller oluşturulabilir. Primer antikor boyama: Her oyuğa uygun primer antikor konsantrasyonu ile 50 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin. Karanlıkta RT’de 30 dakika inkübe edin. 2x’i 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ile yıkayın.NOT: Her HPTM için kullanılan antikor konsantrasyonu Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Konsantrasyon, dramatik bir artışa neden olacak bir uyarıcı ile muamele edilen kültürlenmiş hücreler üzerindeki antikorların farklı konsantrasyonlarının test edilmesiyle belirlenir, ör., asetilasyon işaretleri için bir HDAC inhibitörü ve hem tedavi edilmemiş hem de tedavi edilmiş hücrelerin tespit aralığında olduğundan emin olun (izotip kontrolünün üstünde ve sitometrenin maksimum tespit aralığının altında). HPTM’ler için optimal antikor konsantrasyonu, florofor kanalında 5 x 104 ile 1 x 105 arasında bir ortalama medyan floresan yoğunluğuna sahip olmalıdır. İkincil antikor boyama: RT’de 10 dakika boyunca% 2 normal eşek serumu (NDS) ile 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ile bloklayın. RT’de 500 x g’de 5 dakika döndürün ve süpernatanı çıkarmak için hafifçe vurun. % 2 NDS ve uygun ikincil antikor konsantrasyonu ile 50 μL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin ve karanlıkta RT’de 30 dakika inkübe edin. Seyreltmek için kuyucuklara 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ekleyin, plakayı RT’de 500 x g’de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atmak için hafifçe vurun. Hücreleri 200 μL 1x geçirgenlik tamponu ile 2x yıkayın.NOT: Gerekirse, bu noktada protokolü askıya alın. P200 pipeti ile bağışıklık hücreleri için 200 μL uzun süreli depolama tamponunda hücreleri yeniden süspanse edin (öneriler için Malzeme Tablosuna bakın) ve ışıktan korunarak 12-24 saat boyunca 4 ° C’de saklayın. Akış sitometrisi için hazırlanma: RT’de 500 x g’de 5 dakika santrifüj plakası ve süpernatanı atmak için hafifçe vurun. Akış sitometrisi için bir P200 pipeti kullanarak hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Sitometreye taşımak için şeffaf film ile kapatın. Akış sitometrisiÖnerilen antikor panelini analiz etmek için, sitometrenin mor (405 nm), mavi (488 nm), sarı (561 nm) ve kırmızı (633 nm) dahil olmak üzere en az dört lazerle donatıldığından emin olun. Sitometre, FITC (mavi-525 nm), KRO (mor-525 nm), PE (sarı-585 nm) ve APC’yi (kırmızı-660 nm) tespit etmek için filtrelere ihtiyaç duyar. Seçilen sitometreye bağlı olarak ek antikorlar ekleyin. Kalibrasyon ve standardizasyon: Her deneyin başlangıcında, gökkuşağı floresan boncuklarını çalıştırın ve boncuk tepe noktaları önceki deneyler için çalıştırılan hedef değerlerle karşılaştırılabilir olana kadar fotoçoğaltıcı tüp (PMT) voltajını ayarlayın. Bu standardizasyon yöntemi, zaman içinde ekipman sürüklenmesinin yerleştirilmesine izin verir. Kompanzasyon: Deney için PMT voltajı ve kazancı ayarlandıktan sonra, antikor paneli için kompanzasyon matrisini oluşturmak için antikor yakalanan kompanzasyon boncuklarını kullanın. Bu hesaplama, floroforların diğer kanallardaki sinyal değişikliklerine katkıda bulunmamasını sağlayacaktır. Bu, çoklu antikorları çoğaltırken giderek daha gerekli hale gelir. Boyut geçidi: Bir nokta grafiğinde, SSC-A’yı günlükte ve FSC-H’yi doğrusal olarak çizin. Enkazı kapatın ve S1 kapısını kullanarak hücre boyutunu seçin. FSC-W ve FSC-H nokta grafiğindeki tekli hücreleri seçin ve S2 olarak geçin. (Şekil 4). Florofor kapılarının oluşturulması: Her bir florofor kanalı için ilgili FMO’yu kullanarak, tek parametreli histogramlar kullanarak her kanalda pozitif sinyalin ne olduğunu belirlemek için kapıları oluşturun (Şekil 4). Numunelerin ölçülmesi: Belirlenen geçit stratejisini kullanarak numuneleri dikkatlice kaydedin. P2RY12+ sinyalini kullanarak mikrogliayı tanımlayın, yalnızca mikroglia için ilgili kanallardaki proteinin ekspresyonunu belirleyin. Akış sitometrisi veri analiziAnaliz kapılarının oluşturulması: Analiz yazılımı kullanıcı arayüzünde sitometre için yukarıdaki adımları kullanarak, analiz için kayıt için kullanılan kapıların aynısını kullanın. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak MFI değerlerini elde edin (öneriler için Malzeme Tablosuna bakın): Akış analizi için sitometre geçit stratejisini özetleyin. İstatistik ekle işlevini kullanarak, telafi edilen kanal yüksekliğinde ilgilenilen popülasyon için medyan seçin (örneğin, 568+). İstatistiksel analize devam etmek için tablo düzenleyiciyi kullanarak, ilgili kanalların medyan floresan yoğunluğu (MFI) değerlerini bir elektronik tabloya aktarın (Tablo 2).NOT: Ek Dosya S1 , lipopolisakkarit (LPS) ve fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edilen farelerden örnek veriler ve geçit stratejisi ve MFI değerlerini içeren örnek bir analiz dosyası içerir. MFI değerlerinin protein kat değişimine göre analiz edilmesi: MFI değerlerini elde ettikten sonra, MFI’nin kontrol veya işlenmemiş popülasyona göre kat değişimini hesaplayın (Denklem 1). MFI kat değişimi, protein seviyelerindeki kat değişikliğini yansıtır. Katlama değişim değerlerini kullanarak, ifadedeki değişikliği değerlendirin ve bir t-testi veya ANOVA kullanarak istatistiksel anlamlılığı hesaplayın.Denklem 1 Şekil 4: Protein MFI değerlendirmesi için geçit stratejisi. Olaylar ilk olarak SSC-A ve FSC-H (S1) üzerinde hücre boyutu için geçitlenir. Hücreler daha sonra FSC-H ve FSC-W (S2) üzerindeki tekiller için kapılanır. Singlet hücreler daha sonra P2RY12-APC sinyali (APC+) ile mikroglia olarak tanımlanır ve bir izotip kontrol antikoru içeren bir APC-FMO kontrolünde floresansa dayalı olarak kurulan kapı ile tanımlanır. Hücreler daha sonra Comp-FL5-A::Y610-mCherry üzerinde H3K27Ac-AlexaFluor568 sinyali için geçitlenir. 610+ hücrenin floresan yoğunluğu, protein ekspresyonu için bir vekil olarak belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.