إعداد مصفوفات 3D Decellularized من العضلات الهيكلية للفأر الجنيني لزراعة الخلايا
Summary
في هذا العمل ، تم تحسين بروتوكول إزالة الخلايا للحصول على مصفوفات منزوعة الخلايا لعضلات الهيكل العظمي للفأر الجنيني. يمكن للخلايا العضلية C2C12 استعمار هذه المصفوفات والتكاثر والتمايز. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر لدراسة سلوك الخلية في سياق أمراض العضلات الهيكلية مثل ضمور العضلات.
Abstract
تلعب المصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا مهما في توفير الدعم الهيكلي للخلايا ونقل الإشارات المهمة لمختلف العمليات الخلوية. تبالغ نماذج زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) في تبسيط التفاعلات المعقدة بين الخلايا و ECM ، حيث أن عدم وجود دعم ثلاثي الأبعاد (3D) كامل يمكن أن يغير سلوك الخلية ، مما يجعلها غير كافية لفهم العمليات في الجسم الحي . تعد أوجه القصور في تكوين ECM وتفاعلات الخلايا ECM من المساهمين المهمين في مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة.
أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل العضلي الخلقي LAMA2 (LAMA2-CMD) ، حيث يمكن أن يؤدي غياب أو تقليل اللامينين الوظيفي 211 و 221 إلى نقص شديد في التوتر ، يمكن اكتشافه عند الولادة أو بعدها بفترة وجيزة. يشير العمل السابق باستخدام نموذج فأر للمرض إلى أن ظهوره يحدث أثناء تكوين عضل الجنين. تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير نموذج 3D في المختبر يسمح بدراسة التفاعلات بين خلايا العضلات وعضلة الجنين ECM ، ومحاكاة البيئة المكروية الأصلية. يستخدم هذا البروتوكول عضلات الظهر العميقة التي تم تشريحها من أجنة الفئران E18.5 ، ومعالجتها بمخزن مؤقت منخفض التوتر ، ومنظف أنيوني ، و DNase. احتفظت المصفوفات الناتجة عن إزالة الخلايا (dECMs) بجميع بروتينات ECM التي تم اختبارها (laminin α2 ، و laminins الكلي ، و fibronectin ، والكولاجين I ، والكولاجين IV) مقارنة بالأنسجة الأصلية.
عندما تم زرع الخلايا العضلية C2C12 فوق هذه dECMs ، اخترقت واستعمرت dECMs ، مما دعم انتشارها وتمايزها. علاوة على ذلك ، أنتجت خلايا C2C12 بروتينات ECM ، مما ساهم في إعادة تشكيل مكانتها داخل dECMs. يوفر إنشاء هذه المنصة في المختبر نهجا واعدا جديدا لكشف العمليات التي ينطوي عليها ظهور LAMA2-CMD ، ولديه القدرة على التكيف مع أمراض العضلات الهيكلية الأخرى حيث تساهم أوجه القصور في الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية في تطور المرض.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي مكون رئيسي للأنسجة ، تمثل مكونها غير الخلوي. لا يوفر هذا الهيكل ثلاثي الأبعاد (3D) الدعم المادي للخلايا فحسب ، بل يلعب أيضا دورا حاسما في العمليات الكيميائية الحيوية التي ينطوي عليها تطور الكائناتالحية 1. يحدث تكوين ECM خاص بالأنسجة أثناء التطور ، نتيجة للتفاعلات المعقدة بين الخلايا ومنافذها ، والتي تتأثر بمحفزات مختلفة داخل وخارج الخلية. ECM هو هيكل ديناميكي للغاية يخضع لإعادة ترتيب كيميائية وميكانيكية بطريقة زمنية مكانية ويؤثر بشكل مباشر على مصير الخلية2. واحدة من أبرز خصائص ECM هي تنوعها الوظيفي ، حيث يعرض كل نسيج ECM مزيجا فريدا من الجزيئات التي توفر طوبولوجيا وخصائص مختلفة مصممة خصيصا للخلايا التي تحتوي عليها1.
تعد إشارات ودعم ECM أمرا بالغ الأهمية للتطور والتوازن ، وعندما تتعطل يمكن أن تؤدي إلى حالات مرضية متعددة 3,4. أحد الأمثلة على ذلك هو الحثل الخلقي الناقص LAMA2 (LAMA2-CMD) ، وهو الشكل الأكثر شيوعا للضمور العضلي الخلقي. يشفر جين LAMA2 لسلسلة laminin α2 ، الموجودة في laminin 211 و laminin 221 ، وعندما يتحور يمكن أن يؤدي إلى LAMA2-CMD 5. Laminin 211 هو الشكل المتماثل الرئيسي الموجود في الغشاء القاعدي المحيط بألياف العضلات الهيكلية. عندما يكون laminin 211 غير طبيعي أو غائب ، يتم تعطيل الرابط بين الغشاء القاعدي وخلايا العضلات ، مما يؤدي إلى ظهور المرض6. يظهر المرضى الذين يعانون من LAMA2-CMD نمطا ظاهريا خفيفا إلى شديد اعتمادا على نوع الطفرة في جين LAMA2.
عندما تتأثر وظيفة بروتين laminin α2 ، يمكن للمرضى تجربة نقص التوتر العضلي الشديد عند الولادة وتطوير التهاب مزمن وتليف وضمور العضلات ، مما يؤدي إلى انخفاض متوسط العمر المتوقع. حتى الآن ، لم يتم تطوير أي علاجات مستهدفة وتقتصر الأساليب العلاجية على تخفيف أعراض المرض7. لذلك ، فإن فهم الآليات الجزيئية الأساسية التي ينطوي عليها ظهور هذا المرض أمر بالغ الأهمية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية المناسبة 6,8. يشير العمل السابق باستخدام فأر dyW 9 ، وهو نموذج ل LAMA2-CMD ، إلى أن ظهور المرض يبدأ في الرحم ، وتحديدا أثناء تكوين عضل الجنين10. إن الفهم الأفضل لكيفية ظهور عيب تكوين عضل الجنين سيكون بمثابة تغيير لقواعد اللعبة في توليد مناهج علاجية جديدة ل LAMA2-CMD.
توفر الأنظمة في المختبر بيئة خاضعة للرقابة لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM ، لكن نماذج ثقافة 2D تفتقر إلى تعقيد الأنسجة الأصلية. ينتج عن إزالة الخلايا من الأنسجة سقالات ECM غير الخلوية الخاصة بالأنسجة ومرحلة النمو والتي تحاكي بدقة أكبر البيئة الدقيقة للخلايا الطبيعية مقارنة بنماذج 2D والسقالات الهندسية / الاصطناعية. المصفوفات منزوعة الخلايا (dECMs) لديها القدرة على الحفاظ على الإشارات الجزيئية والميكانيكية للأنسجة المضيفة ، مما يجعلها نماذج بديلة أفضل لفهم العمليات في الجسم الحي 11.
هناك العديد من التقنيات والكواشف والظروف التي يمكن استخدامها لإزالة الخلايا12,13. في هذه الدراسة ، تم تكييف بروتوكول إزالة الخلايا لقلب فأر الجنين ، الذي وصفه Silva et al.14،15 ، مع العضلات الهيكلية للفأر الجنيني ووجد أنه يحتفظ بجميع مكونات ECM المختبرة (laminin α2 ، الصفيحات الكلية ، الفبرونيكتين ، الكولاجين I ، والكولاجين IV). يتضمن البروتوكول ثلاث خطوات: تحلل الخلايا عن طريق الصدمة التناضحية (العازلة منخفضة التوتر) ، وانحلال غشاء البلازما وتفكك البروتين (0.05٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]) ، والتدمير الأنزيمي للحمض النووي (علاج DNase). على حد علمنا ، هذا هو أول بروتوكول تم إنشاؤه لإزالة الخلايا من العضلات الهيكلية الجنينية للفأر.
لاستخدام هذا النظام ثلاثي الأبعاد في المختبر لدراسة LAMA2-CMD ، من الضروري الحفاظ على سلسلة laminin α2 بعد إزالة الخلايا. لذلك ، تم تنفيذ بروتوكول التحسين حيث تم اختبار المنظفات المختلفة (SDS و Triton X-100) والتركيزات (0.02٪ و 0.05٪ و 0.1٪ و 0.2٪ و 0.5٪) (البيانات غير معروضة). تم العثور على الخيار الأمثل لإزالة الخلايا والحفاظ على بروتين laminin α2 ليكون 0.05 ٪ SDS. تم استخدام خلايا C2C12 ، وهي خط خلايا عضلية راسخة16,17 ، لزرع dECMs. تغزو هذه الخلايا dECM ، وتتكاثر ، وتتمايز داخل هذه السقالات ، وتوليف بروتينات ECM جديدة. يوفر الإنتاج الناجح لهذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر نهجا جديدا لفهم العمليات الجزيئية والخلوية التي ينطوي عليها تكوين عضل الجنين ، وبداية LAMA2-CMD ، ويمكن أن يمتد إلى أمراض العضلات الأخرى حيث يتم تعطيل الاتصال بين ECM وخلايا العضلات الهيكلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ECM عبارة عن شبكة معقدة من الجزيئات الكبيرة الموجودة في جميع الأنسجة وتلعب دورا حاسما في تنظيم سلوك الخلية ووظيفتها2. يعمل ECM بمثابة سقالة مادية للخلايا للالتصاق بها ويوفر إشارات تعدل بنشاط العمليات الخلوية مثل الانتشار والحركة والتمايز وموت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، فإن ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الفرنسية لمكافحة الاعتلال العضلي (AFM-Téléthon ؛ عقد رقم 23049) ، ومشروع MATRIHEALTH ، وتمويل وحدة cE3c UIDB / 00329/2020. نود أن نشكر المتبرع هنريك ميريليس الذي اختار دعم مشروع MATRIHEALTH. استفاد هذا العمل من البنى التحتية لمرفق الفحص المجهري بكلية العلوم ، وهو عقدة تابعة للمنصة البرتغالية للتصوير الحيوي (المرجع PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) ، ونشكر لويس ماركيز على مساعدته في الحصول على الصور ومعالجتها. أخيرا ، نشكر مارتا بالما على الدعم الفني وفريق البحث لدينا على مساهماتهم السخية.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
- Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
- Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142 (2020).
- Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l’Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9 (2011).
- van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
- Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59 (2020).
- Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
- Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
- McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436 (2022).
- Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924 (2019).
- Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
- Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769 (2015).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
- Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
- Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
- Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101 (2017).
- Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).
