Preparación de matrices descelularizadas 3D a partir de músculo esquelético fetal de ratón para cultivo celular
Summary
En este trabajo, se optimizó un protocolo de descelularización para obtener matrices descelularizadas del músculo esquelético fetal del ratón. Los mioblastos C2C12 pueden colonizar estas matrices, proliferar y diferenciarse. Este modelo in vitro se puede utilizar para estudiar el comportamiento celular en el contexto de enfermedades del músculo esquelético, como las distrofias musculares.
Abstract
La matriz extracelular (ECM) juega un papel crucial en proporcionar soporte estructural para las células y transmitir señales que son importantes para diversos procesos celulares. Los modelos de cultivo celular bidimensionales (2D) simplifican en exceso las complejas interacciones entre las células y la ECM, ya que la falta de un soporte tridimensional completo (3D) puede alterar el comportamiento celular, haciéndolos inadecuados para comprender los procesos in vivo . Las deficiencias en la composición de la ECM y las interacciones célula-ECM son contribuyentes importantes a una variedad de enfermedades diferentes.
Un ejemplo es la distrofia muscular congénita LAMA2 (LAMA2-CMD), donde la ausencia o reducción de laminina funcional 211 y 221 puede conducir a hipotonía severa, detectable en o poco después del nacimiento. Trabajos previos utilizando un modelo de ratón de la enfermedad sugieren que su inicio ocurre durante la miogénesis fetal. El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un modelo 3D in vitro que permitiera el estudio de las interacciones entre las células musculares y la ECM del músculo fetal, imitando el microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos de la espalda diseccionados de fetos de ratón E18.5, tratados con un tampón hipotónico, un detergente aniónico y DNasa. Las matrices descelularizadas resultantes (dECM) retuvieron todas las proteínas ECM probadas (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV) en comparación con el tejido nativo.
Cuando los mioblastos C2C12 se sembraron sobre estos dECM, penetraron y colonizaron los dECM, lo que apoyó su proliferación y diferenciación. Además, las células C2C12 produjeron proteínas ECM, contribuyendo a la remodelación de su nicho dentro de las dECM. El establecimiento de esta plataforma in vitro proporciona un nuevo enfoque prometedor para desentrañar los procesos involucrados en la aparición de LAMA2-CMD, y tiene el potencial de adaptarse a otras enfermedades del músculo esquelético donde las deficiencias en la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético contribuyen a la progresión de la enfermedad.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) es un componente importante de los tejidos, que representa su componente no celular. Esta estructura tridimensional (3D) no solo proporciona soporte físico a las células, sino que también desempeña un papel crucial en los procesos bioquímicos involucrados en el desarrollo de los organismos1. La formación de una ECM específica del tejido ocurre durante el desarrollo, como resultado de las complejas interacciones entre las células y sus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra y extracelulares. La ECM es una estructura altamente dinámica que sufre reordenamientos químicos y mecánicos de manera temporal-espacial e impacta directamente en el destino celular2. Una de las características más notables de la ECM es su diversidad funcional, ya que cada ECM tisular muestra una combinación única de moléculas que proporcionan diferentes topologías y propiedades que se adaptan a las células que contiene1.
La señalización y el apoyo de la ECM son cruciales para el desarrollo y la homeostasis, y cuando se interrumpen pueden conducir a múltiples condiciones patológicas 3,4. Un ejemplo es la distrofia congénita deficiente en LAMA2 (LAMA2-CMD), que es la forma más común de distrofia muscular congénita. El gen LAMA2 codifica para la cadena α2 de laminina, que está presente en la laminina 211 y la laminina 221, y cuando está mutada puede conducir a LAMA2-CMD 5. La laminina 211 es la principal isoforma que se encuentra en la membrana basal que rodea las fibras del músculo esquelético. Cuando la laminina 211 es anormal o está ausente, el vínculo entre la membrana basal y las células musculares se interrumpe, lo que lleva a la aparición de la enfermedad6. Los pacientes con LAMA2-CMD muestran un fenotipo de leve a grave dependiendo del tipo de mutación en el gen LAMA2.
Cuando la función de la proteína laminina α2 se ve afectada, los pacientes pueden experimentar hipotonía muscular severa al nacer y desarrollar inflamación crónica, fibrosis y atrofia muscular, lo que lleva a una esperanza de vida reducida. Hasta la fecha, no se han desarrollado tratamientos dirigidos y los enfoques terapéuticos se limitan a aliviar los síntomas de la enfermedad7. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes involucrados en la aparición de esta enfermedad es crucial para el desarrollo de estrategias terapéuticas apropiadas 6,8. Trabajos previos con el ratón dyW 9, un modelo para LAMA2-CMD, sugieren que el inicio de la enfermedad comienza en el útero, específicamente durante la miogénesis fetal10. Una mejor comprensión de cómo surge el defecto de miogénesis fetal sería un cambio de juego en la generación de nuevos enfoques terapéuticos para LAMA2-CMD.
Los sistemas in vitro proporcionan un entorno controlado para estudiar las interacciones célula-célula y célula-ECM, pero los modelos de cultivo 2D carecen de la complejidad de los tejidos nativos. La descelularización de los tejidos produce andamios de ECM acelulares específicos para el tejido y la etapa de desarrollo que imitan con mayor precisión el microambiente celular natural en comparación con los modelos 2D y los andamios diseñados / sintéticos. Las matrices descelularizadas (dECMs) tienen el potencial de preservar las señales moleculares y mecánicas del tejido huésped, convirtiéndolas en mejores modelos alternativos para la comprensión de los procesos in vivo 11.
Existen diversas técnicas, reactivos y condiciones que pueden ser utilizadas para la descelularización12,13. En este estudio, un protocolo de descelularización para el corazón fetal del ratón, descrito por Silva et al.14,15, se adapta al músculo esquelético fetal del ratón y se encuentra que retiene todos los componentes de la ECM probados (laminina α2, lamininas totales, fibronectina, colágeno I y colágeno IV). El protocolo incluye tres pasos: lisis celular por choque osmótico (tampón hipotónico), disolución de la membrana plasmática y disociación de proteínas (dodecil sulfato de sodio al 0,05% [SDS]) y destrucción enzimática del ADN (tratamiento con DNasa). Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo establecido para descelularizar el músculo esquelético fetal del ratón.
Para utilizar este sistema 3D in vitro para estudiar LAMA2-CMD, es crucial mantener la cadena α2 de laminina después de la descelularización. Por lo tanto, se implementó un protocolo de optimización donde se probaron diferentes detergentes (SDS y Triton X-100) y concentraciones (0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% y 0.5%) (datos no mostrados). Se encontró que la opción óptima para la eliminación celular y la preservación de la proteína laminina α2 era 0.05% SDS. Se utilizaron células C2C12, una línea celular de mioblastos bien establecida16,17, para sembrar los dECM. Estas células invaden la dECM, proliferan y se diferencian dentro de estos andamios, sintetizando nuevas proteínas ECM. La producción exitosa de este modelo 3D in vitro ofrece un nuevo enfoque para comprender los procesos moleculares y celulares involucrados en la miogénesis fetal, el inicio de LAMA2-CMD, y puede extenderse a otras enfermedades musculares donde se interrumpe la comunicación entre la ECM y las células del músculo esquelético.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ECM es una red compleja de macromoléculas que está presente en todos los tejidos y desempeña un papel crucial en la regulación del comportamiento y la función celular2. La ECM actúa como un andamio físico para que las células se adhieran y proporciona señales que modulan activamente los procesos celulares como la proliferación, la motilidad, la diferenciación y la apoptosis. Por lo tanto, la formación y el mantenimiento adecuados de la MCE son esenciales tanto para el desarrollo com…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Asociación Francesa contra las Miopatías (AFM-Téléthon; contrato no. 23049), el proyecto MATRIHEALTH y la unidad de financiación del cE3c UIDB/00329/2020. Nos gustaría agradecer a nuestro donante Henrique Meirelles que eligió apoyar el Proyecto MATRIHEALTH. Este trabajo se benefició de las infraestructuras de la Instalación de Microscopía de la Facultad de Ciencias, un nodo de la Plataforma Portuguesa de BioImagen (referencia PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), y agradecemos a Luís Marques por su ayuda con la adquisición y procesamiento de imágenes. Finalmente, agradecemos a Marta Palma por el apoyo técnico y a nuestro equipo de investigación por sus generosas contribuciones.
Materials
| 12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21021 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Merck | D8417 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 4561093 | |
| 48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21023 | |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, Sterile | Abdos Labware | P21024 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V | NZYtech | MB04601 | |
| BX60 fluorescence microscope | Olympus | ||
| Cryostat CM1860 UV | Leica | ||
| Dithiothreitol | ThermoFisher | R0862 | |
| DMEM high glucose w/ stable glutamine w/ sodium pyruvate | Biowest | L0103-500 | |
| DNase I | PanReac AppliChem | A3778 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | 108418 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1560-500 | |
| Fine tip transfer pipette | ThermoFisher | 15387823 | |
| Goat serum | Biowest | S2000-100 | |
| Hera Guard Flow Cabinet | Heraeus | ||
| Heracell 150 CO2 Incubator | Thermo Scientific | ||
| HiMark Pre-stained Protein Standard | Invitrogen | ||
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050122 | |
| HRP-α- Rabbit IgG | abcam | ab205718 | |
| HRP-α- Rat IgG | abcam | ab205720 | |
| HRP-α-Mouse IgG | abcam | ab205719 | |
| ImageJ v. 1.53t | |||
| Methyl Green | Sigma-Aldrich | 67060 | |
| MM400 Tissue Lyser | Retsch | ||
| NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 043368-9M | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | GRiSP | GTC05.0100 | |
| Phalloidin Alexa 488 | Thermo Fisher Sci. | A12379 | |
| Polystyrene Petri dish 60x15mm with vents (sterile) | Greiner Bio-One | 628161 | |
| Qubit dsDNA HS kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| Qubit™ 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | |
| S6E Zoom Stereo microscope | Leica | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck | 11667289001 | |
| SuperFrost® Plus adhesion slides | Thermo Scientific | 631-9483 | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 15626144 | |
| TCS SPE confocal microscope | Leica | ||
| Tris-(hidroximetil) aminometano (Tris base) ≥99% | VWR Chemicals | 28811.295 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) in DPBS (1X) | GRiSP | GTC02.0100 | |
| TWEEN 20 (50% Solution) | ThermoFisher | 3005 | |
| WesternBright PVDF-CL membrane roll (0.22µm) | Advansta | L-08024-001 | |
| α-Collagen I | abcam | ab21286 | |
| α-Collagen IV | Millipore | AB756P | |
| α-Collagen IV | Santa Cruz Biotechnology | sc-398655 | |
| α-Fibronectin | Sigma | F-3648 | |
| α-Laminin α2 | Sigma | L-0663 | |
| α-MHC | D.S.H.B. | MF20 | |
| α-Mouse Alexa 488 | Molecular Probes | A11017 | |
| α-Mouse Alexa 568 | Molecular Probes | A11019 | |
| α-pan-Laminin | Sigma | L- 9393 | |
| α-phospho-histone 3 | Merk Millipore | 06-570 | |
| α-Rabbit Alexa 568 | Molecular Probes | A21069 | |
| α-Rabbit Alexa 488 | Molecular Probes | A11070 | |
| α-Rat Alexa 488 | Molecular Probes | A11006 |
References
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