胆道閉鎖症研究のための慢性肝線維症のマウスモデル

この研究は、すべての動物実験が行われた広州永奴生物医学動物センターの施設動物管理および使用委員会(IACUC-AEWC-F2208020)によって承認されました。 1. 慢性線維性BAマウスモデルの樹立 注:すべての動物を同じ部屋の特定の病原体フリー(SPF)環境で飼育し、実験は従来の環境で実施しました。妊娠12.5日目のBALB/cマウス(生後10-12週、体重35-40g)を、特定の病原体のない部屋で25°C、12時間の暗/明サイクルで飼育し、オートクレーブした餌と水に自由にアクセスできました。新生児マウスを、生後24時間以内に(平均体重:1.5-1.6g)、マウスBAモデル用に選択した。 以前に報告されたようにRRVを準備する16.注:モデルマウスの生存状態が悪いため、同じケージ内の他のマウスに噛まれたり殺されたりしないように、21日齢で分離する必要があります。 新生児マウスを対照群、RRV群、RRV+抗Ly6G群の3群に分ける。生後24時間以内に、新生児マウスに20 μLのRRV(力価:1.5 x 106 PFU / mL)(RRV群)または生理食塩水(対照群)を腹腔内注射します。Gr-1+ 細胞を枯渇させるには、RRV注射の4時間前に5μgの抗Ly6G抗体の腹腔内注射で各マウスを前処理します。注:抗Ly6G抗体溶液は2〜8°Cで保存され、凍結しないでください。使用前に抗体を取り出し、室温で30分間置いて温めます。 RRV注射後12日目まで、3日ごとに10μgの抗Ly6G抗体をマウスの腹部に注射します(図1A)。 すべてのマウスの外観、体重、生存率を毎日確認して記録します。 2.マウスの腹腔内注射 ケージから生まれたばかりのマウスを取り除きます。1 mLのインスリンシリンジを使用して、20 μLのRRV溶液または50 μLの抗Ly6G抗体溶液を注入します。片方の手の人差し指と親指で若いマウスの首の皮膚をつまみ、薬指と尾指でマウスの後足をそっと持ち、腹部を露出させます。 針を上向きに持ち上げます。マウスの右後脚の中央大腿部に針を皮膚に対して15°の角度で挿入します。針がマウスの右肋骨端に達するまで皮下経路に沿って移動した後、針を下向きにして腹腔内に向ける。次に、マウスの肝臓の下に液体を注入します。注:生まれたばかりのマウスは、左腹部に胃と脾臓を持っています。左側に針を挿入すると、胃を刺したり、脾臓出血を起こしやすくなります。 注射直後に針を抜き、注射部位の出血や漏れを観察します。ある場合は、オートクレーブ綿で拭いてください。マウスを母親のケージに戻します。注意: 注射中の液体漏れが実験結果に与える影響を減らすために、注射動作が穏やかであることを確認し、ゆっくりと針を外し、綿棒で注射部位を30秒間押します。 3.サンプル組織の収集 12日目に、4%イソフルラン吸入でマウスに麻酔をかけ、顕微鏡下で解剖する。1 mLのインスリン注射器を心臓の左心室に挿入して採血します。採血後、4%イソフルランを10分間吸入してマウスを安楽死させる。血液を400 × g で室温で5分間遠心分離し、肝機能測定のために血清を分離します。注:採血はマウスが生きている間に行わなければなりません。マウスが死亡した場合、血液は血管に保持され、収集できなくなります。 肝臓と胆管の一般的な外観を撮影します。続いて、マウスの肝臓と脾臓をハサミとピンセットで周囲の組織から解剖します。注:肝臓およびその他の組織は、RNAおよびタンパク質抽出のために-80°Cで収集および保存されるか、組織学的標本の調製のために10%ホルマリンに浸されます。 4.肝外胆管のフルオレセイン血管造影 マウスを安楽死させた後、ハサミと綿棒で肝臓、胆嚢、肝外胆管を完全に露出させます。 姿勢顕微鏡で観察し、蛍光色素ローダミン123(20mg/mL)を5-10μLのインスリン注射器で胆嚢に注入し、写真を撮ります。このプロセスは、以前の16で報告されたものと同じです。注:同じグループの異なるマウスが、サンプル組織収集および蛍光血管造影に使用される。 5. H&E染色 新鮮なマウス肝臓組織を10%ホルマリンに24時間浸します。 組織をパラフィンに包埋した後、パラフィンミクロトームを使用してパラフィンブロックを厚さ4μmの切片に切断し、同じスライド上に2つの連続した切片を配置します。経験豊富な担当者は、指の切断を避けるために操作を標準化する必要があります17。 スライスをスライスラックに入れ、キシレンで脱ワックスし、無水エタノール、95%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、蒸留水で順次水和し、それぞれに5分間浸します。 切片をヘマトキシリン溶液で5分間染色し、1%塩酸と75%アルコールに5秒間浸します。切片をきれいな水ですすぎ、エオジン溶液で1分間染色します。 6. CK19およびF4/80免疫組織化学染色 最初の3つのステップは、H&E染色セクションでの組織の埋め込み、切片作成、および脱ろうの手順と同じです。 Tris-EDTAバッファー(10 mmol/L Tris塩基、1 mmol/L EDTA溶液、pH 9.0)で抗原修復を行い、切片を95°Cの電子レンジで10分間加熱した後、取り出して室温まで自然冷却します。 組織切片を3%過酸化水素水に10分間入れて、内因性ペルオキシダーゼを除去します。 スライスを5%ヤギ血清で処理して、非特異的結合をブロックします。 初代ラット抗マウスサイトケラチン19またはラット抗マウスF4/80モノクローナル抗体を切片に加え、4°Cで一晩インキュベートします。 切片を適切な二次抗体とともに室温で30分間インキュベートします。 発色剤として3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)を使用し、顕微鏡下で発色反応を観察します。 スライスを40倍の顕微鏡で観察して写真を取得し、必要に応じて分析します。 7.シリウスレッド染色 H&E染色のセクションで説明したように、組織の埋め込み、切片作成、および脱ろうの最初の3つのステップを実行します。 組織切片をヘマトキシリンで対比染色した後、各組織を50 μLのシリウスレッド色素溶液で室温で1時間覆います。 スライドを室温で4時間自然乾燥させ、各スライドに中性ガムを一滴加え、カバーガラスを使用して組織をゆっくりと覆い、気泡を防ぎます。スライドを室温で24時間放置して、ニュートラルガムを固化させます。 偏光コントラスト光顕微鏡を使用して、コラーゲン沈着の詳細を観察します。鮮明で適切な視野を選択し、顕微鏡の視野の明るさとホワイトバランスを調整します。画像を取得し、必要に応じて40倍の顕微鏡で分析します。