我们提出了一种用于转座酶可访问染色质的高通量测序(ATAC-seq)测定的方案,专门针对脂肪细胞,使用细胞核分选,从具有核荧光标记的转基因报告小鼠中分离的脂肪组织。
转座酶可接近染色质的高通量测序 (ATAC-seq) 检测是一种强大的技术,可实现全基因组染色质可及性分析。该技术有助于理解一系列生物过程中基因表达的调控机制。尽管ATAC-seq已针对不同类型的样品进行了修改,但尚未对脂肪组织的ATAC-seq方法进行有效修改。脂肪组织面临的挑战包括复杂的细胞异质性、高脂质含量和高线粒体污染。为了克服这些问题,我们开发了一种协议,通过采用荧光激活的细胞核分选与来自转基因报告基因核标记和翻译核糖体亲和纯化(NuTRAP)小鼠的脂肪组织,允许脂肪细胞特异性ATAC-seq。该协议以最少的测序读数浪费产生高质量的数据,同时减少了细胞核输入和试剂的数量。本文为ATAC-seq方法提供了详细的分步说明,该方法验证了使用从小鼠脂肪组织中分离的脂肪细胞核。该协议将有助于研究脂肪细胞在各种生物刺激下的染色质动力学,这将允许新的生物学见解。
脂肪组织专门用于以脂质分子的形式储存多余的能量,是代谢调节的关键器官。严格控制脂肪细胞的形成和维持对脂肪组织功能和全身能量稳态至关重要1.许多转录调节因子在控制脂肪细胞分化、可塑性和功能方面起着关键作用;其中一些调节因子与人类代谢紊乱有关2,3。用于基因表达和表观基因组分析的高通量测序技术的最新进展进一步促进了脂肪细胞生物学分子调节因子的发现4。由于脂肪组织的异质性,使用脂肪组织的分子分析研究具有挑战性。脂肪组织主要由负责脂肪储存的脂肪细胞组成,但也包含各种其他细胞类型,如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞5。此外,脂肪组织的细胞组成响应于病理生理变化(例如温度和营养状况)而发生显着改变6。为了克服这些问题,我们之前开发了一种转基因报告小鼠,名为核标记和翻译核糖体亲和纯化(NuTRAP),它以Cre重组酶依赖的方式产生GFP标记的核糖体和mCherry标记的生物素化细胞核7。双标记系统使人能够对组织进行细胞类型特异性转录组学和表观基因组学分析。使用NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系(Adipoq-NuTRAP)杂交,我们先前表征了体内纯脂肪细胞群的基因表达谱和染色质状态,并确定它们在肥胖期间如何改变7,8。以前,NuTRAP小鼠与棕色和米色脂肪细胞特异性Ucp1-Cre系(Ucp1-NuTRAP)杂交,使我们能够表征罕见的产热脂肪细胞群体米色脂肪细胞的表观基因组重塑,以响应温度变化9。
ATAC-seq是一种广泛使用的分析方法,用于评估全基因组染色质的可及性。ATAC-seq 中使用的超反应性 Tn5 转座酶允许通过在细胞核 10 的染色质可及区域中标记测序接头来鉴定开放的染色质区域。ATAC-seq是一种简单的方法,但它提供了可靠的结果,即使对于低输入样品也非常高效。因此,它已成为最流行的表观基因组分析方法之一,并有助于理解不同生物学背景下基因表达的调控机制。自创建原始ATAC-seq协议以来,已经进一步开发了各种ATAC-seq衍生技术,以修改和优化各种类型的样品的协议。例如,Fast-ATAC设计用于分析血细胞样本11,Omni-ATAC是冷冻组织样本12的优化方案,MiniATAC-seq对早期胚胎分析有效13。然而,将ATAC-seq方法应用于脂肪细胞,特别是来自组织样本的脂肪细胞,仍然具有挑战性。除了脂肪组织的异质性外,即使在细胞核分离后,其高脂质含量也可能干扰Tn5转座酶的有效重组反应。此外,脂肪细胞中的高线粒体含量,特别是在棕色和米色脂肪细胞中,导致线粒体DNA污染高和测序读数浪费。本文描述了使用Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪细胞特异性ATAC-seq方案(图1)。通过利用荧光标记的细胞核分选,该协议允许收集远离其他混杂细胞类型的纯脂肪细胞核群,并有效去除脂质、线粒体和组织碎片。因此,与标准方案相比,该协议可以生成特定于细胞类型的高质量数据,并最大限度地减少线粒体读取的浪费,同时使用更少的输入和试剂量。
在本文中,我们提出了一种优化的ATAC-seq协议来评估 体内脂肪细胞特异性染色质的可及性。该ATAC-seq方案使用Adipoq-NuTRAP小鼠成功生成了脂肪细胞特异性染色质可及性图谱。成功和可重复的ATAC-seq实验的最关键因素是细胞核质量。至关重要的是立即将解剖的脂肪组织快速冷冻在液氮中,并将其安全地储存在-80°C下,而无需解冻直至使用。在细胞核分离和分选过程中防止脂肪细胞核损伤也很重?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了IUSM Showalter研究信托基金(致H.C.R.),IUSM糖尿病和代谢疾病中心试点和可行性资助(致H.C.R.),国家糖尿病,消化和肾脏疾病研究所(R01DK129289至H.C.R.)和美国糖尿病协会初级教师奖(7-21-JDF-056至H.C.R.)的支持。
Animals | |||
Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
Reagents & Materials | |||
1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
DTT | Sigma | D9779 | |
DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
Instruments | |||
Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio 5 |