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Abstract
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Protocol
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Biologie

Transfecção escalável de protoplastos de mesofilo de milho

Published: June 23, 2023
doi:
10.3791/64991
, , , ,
1Genome Sciences Department,University of Washington

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para transfectar transitoriamente milhões de protoplastos de milho para testar grandes bibliotecas de plasmídeos em células do mesofilo do milho.

Abstract

A transfecção de células do mesofilo de milho geralmente envolve a digestão das paredes celulares das plantas para criar protoplastos e, em seguida, a inserção de DNA via eletroporação ou polietilenoglicol (PEG). Métodos anteriores foram desenvolvidos para produzir dezenas de milhares de protoplastos transfectados de uma só vez. Aqui, descrevemos um método simples para isolar e transfectar milhões de protoplastos de mesofilo foliar em milho (Zea mays L .). Esse processo simplificado remove certas etapas comuns de protoplast, como a lavagem em W5. Além disso, etapas como centrifugação, transfecção mediada por PEG e incubação foram modificadas para trabalhar com um maior número de protoplastos. A capacidade de expressar grandes bibliotecas de construções de plasmídeos permite experimentos em escala genômica, como ensaios de repórteres massivamente paralelos em milho.

Introduction

A expressão gênica transitória é uma ferramenta poderosa na biologia vegetal. No entanto, as células vegetais são difíceis de transfectar porque estão rodeadas por uma parede celular. Essa barreira à entrada do DNA não está presente em outros tipos celulares comumente estudados, como células de mamíferos ou insetos. Pesquisas anteriores abordaram esse desafio empregando protoplastos: células vegetais cujas paredes celulares foram digeridas e removidas. Ao contrário do tecido foliar não processado, os protoplastos vegetais são fáceis de trabalhar em suspensão e passíveis de técnicas de transfecção mediadas por eletroporação ou polietilenoglicol (PEG)1. As células vegetais mantêm grande parte de sua funcionalidade mesmo após a remoção da parede celular. Assim, os protoplastos são utilizados em uma variedade de plantas para estudar a função gênica e proteica2,3, entender a transdução de sinal4 e identificar possíveis alvos para o melhoramento de plantas5. Os protoplastos também são um veículo conveniente para a triagem de construções de edição do genoma em diversas espécies de culturas, incluindo trigo e batata 6,7. Em suma, ensaios transitórios em protoplastos são indispensáveis para a biotecnologia agrícola.

O milho (Zea mays L.) é a principal cultura mundial de cereais em tonelagem; como tal, é um dos principais focos de pesquisa básica e aplicada em fitotecnia8. No entanto, ao contrário de plantas-modelo como Nicotiana tabacum9, a expressão transgênica transitória em folhas intactas de milho não é realizada rotineiramente. A protoplastificação tem sido utilizada na obtenção e transfecção de células do mesofilo foliar de milho10,11. Métodos anteriores alcançaram eficiências de transfecção de até 75% usando eletroporação e produziram protoplastos transfectados na escala de dezenas de milhares10,15.

Este protocolo detalha como protoplastar milhões de células do mesofilo de milho e transfectá-las com uma eficiência comparável aos métodos anteriores. As principais etapas são o cultivo de mudas de milho etioladas, a colheita do tecido foliar, a digestão da parede celular da planta e a entrega de DNA plasmidial nas células usando PEG. A principal contribuição deste protocolo é a capacidade de aumentar a transfecção de protoplastos, mantendo a viabilidade celular necessária para ensaios funcionais. Isso permite o uso de experimentos em escala genômica, como ensaios paralelos massivos, que podem testar a função de centenas de milhares de regiões em todo o genoma do milho. Este método tem sido recentemente utilizado para investigar grandes bibliotecas de elementos do DNA cis-regulatório, incluindo potencializadores e promotores12,13,14.

Protocol

1. Crescimento do material vegetal Lave os grãos de milho duas vezes com água da torneira. Mergulhe os grãos em água da torneira durante a noite à temperatura ambiente. No dia seguinte, encha uma bandeja inicial de sementes de 72 células com vermiculita 1:1 molhada:musgo de turfa. Enxágue os grãos uma vez e plante-os com tampa de ponta para baixo, um grão por célula. Crescer em condições de dias longos (16 h claro, 8 h escuro) a 25 °C durante 3 dias. Transfira para a escuridão constante a 25 °C e cresça por 9-11 dias. 2. Isolamento de plasmídeos Transformar E. coli comercialmente competente quimicamente com o(s) plasmídeo(s) de interesse de acordo com as instruções do fabricante. Cultivar a E. coli transformada em 50 mL de meio LB líquido com antibióticos apropriados durante a noite a 37 °C com agitação. Pellet a E. coli por centrifugação por 10 min a 3.000 x g à temperatura ambiente. Extrair os plasmídeos usando um kit de isolamento de DNA plasmidial midiprep disponível comercialmente. Estimar a concentração de DNA plasmidial usando um espectrofotômetro de microvolume.NOTA: O material adequado para transfecção deve ter uma concentração de ≥800 ng/μL e um A260/A280 de ≥1.8. 3. Isolamento de protoplastos Preparar 20 ml de solução enzimática.Adicionar 2,18 g de manitol, 0,30 g de celulase R-10 e 0,06 g de macerozima R-10 a um tubo de centrífuga de 50 mL. Inverta para misturar os pós. Adicionar H2O deionizado a 15 mL. Adicionar 200 μL de 1 M MES, pH 5,7. Vórtice para misturar. Aquecer a solução a 55 °C durante 10 min. Arrefecer à temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar 20 μL de CaCl2 1 M, 0,02 g de albumina de soro bovino e 100 μL de 1 M β-mercaptoetanol. Encher até 20 mL com H2O. Deite num copo de 250 ml embrulhado em papel alumínio. Tire as mudas de milho do escuro. Corte-os alguns centímetros acima do solo usando uma nova lâmina de barbear. Coloque as pontas cortadas em água. Mantenha-os no escuro à temperatura ambiente enquanto não estiver em uso. Selecione a segunda e a terceira folhas de cada muda, tomando o cuidado de excluir folhas com áreas marrons ou danificadas. Selecione 12-16 folhas. Corte ~1 cm da ponta de cada folha e descarte. Em seguida, corte uma seção de 10 cm de cada folha.NOTA: Se for necessário mais tecido, utilize um volume adicional de 20 ml de solução enzimática num copo adicional de 250 ml. O excesso de material foliar em uma determinada quantidade de solução enzimática pode diminuir a viabilidade. Empilhe as seções foliares umas sobre as outras com as extremidades basais juntas. Aperte o feixe na extremidade basal usando um clipe aglutinante. Coloque o feixe de folhas em um pedaço de papel branco. Segure as folhas a ~1 cm da extremidade distal. Usando uma nova lâmina de barbear, corte as folhas da extremidade distal perpendicular às nervuras em fatias finas (0,5-1 mm). Evite cortar direto, mas faça fatias curtas e para frente através do tecido.Troque as lâminas de barbear sempre que o resíduo visível começar a ser depositado no papel. Resíduo visível indica esmagamento do tecido devido a uma lâmina opaca ou má técnica. Após o corte de ~2 cm do comprimento do feixe foliar, transfira prontamente as fatias para o copo da solução enzimática. Não deixe o material secar, pois isso reduzirá o número de protoplastos obtidos. Agite suavemente a solução enzimática para molhar o material.Coloque uma tampa de papel alumínio sobre o copo para bloquear a luz. Repita o processo de fatiamento e transferência até que todo o pacote seja cortado próximo ao clipe do fichário. Transfira o copo da solução enzimática para um frasco de sino. Infiltrado de vácuo entre −50,8 kPa e −67,7 kPa em relação à pressão ambiente por 3 min à temperatura ambiente. Transfira o copo para um agitador de mesa. Agitar a 40 RPM durante 2,5 h à temperatura ambiente. Gire suavemente o copo com a mão. Quando totalmente digerida, a solução enzimática aparecerá ligeiramente leitosa. Se a solução ainda estiver clara, continue agitando a 40 RPM por até mais uma hora. Não exceda 3,5 h. Durante a digestão, faça uma solução de manitol + MES + MgCl2 (MMG), uma solução de polietilenoglicol (PEG) e uma solução de incubação.MMG: Adicionar 5,47 g de manitol, 200 μL de 1 M MES, pH 5,7 e 750 μL de 1 M MgCl2 a um tubo de centrífuga de 50 mL. Encher até 50 mL com H2O. Vortex destilado para dissolver. Coloque no gelo. Solução de incubação: Adicionar 5,47 g de manitol, 200 μL de 1 M MES a pH 5,7 e 200 μL de 1 M KCl a um tubo centrífugo de 50 ml. Encher até 50 mL com H2O. Vortex destilado para dissolver. Coloque no gelo. Solução de PEG: Adicionar 0,44 g de manitol, 1,0 g de PEG e 400 μL de CaCl2 1 M a um tubo de centrífuga de 15 mL. Encher até 4 mL com H2O. Vortex destilado para misturar. Incubar a 37 °C com agitação durante 30 minutos até dissolver completamente. Manter à temperatura ambiente. Agitar a solução enzimática a 80 RPM durante 10 minutos à temperatura ambiente. Coloque o copo com a solução enzimática sobre gelo. Não remova a cobertura de papel alumínio. Adicionar 20 ml de MMG gelado à solução enzimática. Filtrar através de um filtro celular de 40 μm para um tubo de centrífuga de 50 mL.NOTA: Mantenha todas as soluções no gelo para as etapas seguintes até a adição do PEG. Mantenha os protoplastos cobertos com papel alumínio para minimizar a exposição à luz. Dividir o filtrado em volumes iguais de 10 ml cada. Despeje cada volume em um tubo de centrífuga de vidro de fundo redondo e gire para baixo por 4 minutos a 100 x g à temperatura ambiente. Eliminar o sobrenadante e adicionar 1 ml de MMG gelado a cada tubo. Ressuspenda os pellets girando suavemente e batendo os tubos. Combine as amostras em um único tubo de centrífuga de vidro de fundo redondo. Adicionar MMG a um volume total de 5 mL. Gire para baixo por 3 min a 100 x g à temperatura ambiente. Lavar com 5 mL de MMG e girar para baixo por 3 min a 100 x g à temperatura ambiente. Repetir a lavagem com 5 mL de MMG e girar para baixo por 3 min a 100 x g à temperatura ambiente. Depois de girar a segunda lavagem, observe se o sobrenadante está claro. Se permanecer nublado, realize uma terceira lavagem. Ressuspender os protoplastos em 1 mL de MMG. Cubra frouxamente com papel alumínio e mantenha no gelo. Determinar o rendimento de protoplastos e verificar a viabilidade.Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, juntar 4 μL de protoplastos e 72 μL de MMG. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicione 1 μL de solução estoque de diacetato de fluoresceína (FDA) a 0,5% a 49 μL de MMG para fazer uma solução funcional de 20x. Adicione 4 μL de solução de trabalho FDA ao tubo com os protoplastos diluídos. Incubar durante 5 minutos no escuro à temperatura ambiente. Carregar 11 μL da mistura de protoplastos em um hemocitômetro. Coloque sob um microscópio de luz de campo claro. Confirme visualmente que as células não possuem paredes celulares. Em seguida, conte o número de protoplastos. Use esta contagem para estimar o número total de protoplastos obtidos. Em seguida, conte o número de protoplastos que fluorescem verde sob luz UV quando corados com FDA. Isolamentos bem-sucedidos de protoplastos produzem uma viabilidade de 70%-90%. 4. Transfecção mediada por PEG Começando com a concentração estimada de protoplastos a partir do passo 3.17, ajuste para ~10.000 protoplastos/μL. Se a concentração for baixa, centrifugar por 3 min a 100 x g e ressuspender em MMG até uma concentração de ~10.000 protoplastos/μL. Misture ~1.000.000 protoplastos com 15 μg de DNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Completar a mistura com MMG para 114,4 μL e incubar no gelo por 30 min. Ressuspenda os protoplastos batendo na lateral do tubo. Adicionar 105,6 μL de solução de PEG a 25% aos protoplastos para atingir um peso/volume final de 12% de PEG. Misture suavemente invertendo 5-10 vezes. Os protoplastos em solução de PEG são frágeis; Não agite o tubo. Incubar durante 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.NOTA: A transfecção pode ser ampliada em múltiplos dos volumes dados nas etapas 4.2 e 4.3. Por exemplo, 10 milhões de protoplastos e 150 μg de DNA podem ser suspensos em 1.444 μL de MMG e tratados com 1.056 μL de solução de PEG em um tubo centrífugo de 50 mL. Diluir com 5 volumes de solução de incubação. Misture delicadamente por inversão. Gire para baixo por 4 min a 100 x g à temperatura ambiente.NOTA: Se aumentar a escala, divida os protoplastos em vários tubos de vidro de fundo redondo contendo no máximo 10 mL cada para garantir a peletização completa. Aumentar proporcionalmente o volume da solução de incubação utilizada para lavagem. Remova o sobrenadante por pipetagem. Lavar com 1-5 ml de solução de incubação e girar para baixo durante 3 minutos a 100 x g à temperatura ambiente. Ressuspender os protoplastos na solução de incubação até uma concentração de 500-1.000 células/μL. Incubar os protoplastos no escuro durante a noite (~16 h) à temperatura ambiente. 5. Recuperação de protoplastos e verificação de expressão Gire os protoplastos por 4 min a 100 x g à temperatura ambiente. NOTA: Se aumentar a escala, divida os protoplastos em vários tubos de vidro de fundo redondo contendo no máximo 10 mL cada. Lavar com 1-5 ml de solução de incubação e girar para baixo durante 3 minutos a 100 x g à temperatura ambiente. Ressuspenda e combine em 1-5 mL de solução de incubação. Se os protoplastos forem transfectados com um gene repórter fluorescente (por exemplo, GFP), tome uma alíquota para verificar a eficiência da transfecção. Usando um hemocitômetro, primeiro conte o número total de protoplastos usando microscopia de luz de campo claro. Em seguida, conte a fração de protoplastos fluorescentes sob luz UV. Centrifugar os protoplastos durante 3 min a 100 x g à temperatura ambiente.NOTA: Os protoplastos estão agora prontos para aplicações a jusante, tais como a extracção de ARN com fenol e isotiocianato de guanidina.

Representative Results

O tecido mais indicado para o isolamento dos protoplastos é a segunda e a terceira folhas de plântulas com 10-11 dias de idade (Figura 1). Neste trabalho, obtivemos aproximadamente 10 milhões de protoplastos de 16 cortes foliares, cada um com 10 cm de comprimento. O número de protoplastos isolados é dependente da massa do material foliar e da largura dos cortes foliares que são digeridos na solução enzimática. Sob um microscópio de luz de campo claro, protoplastos não danificados aparecem aproximadamente esféricos, com plastídios salpicando a superfície (Figura 2A). Antes de proceder à transfecção, a viabilidade pode ser verificada pela coloração de uma pequena alíquota de protoplastos com diacetato de fluoresceína (FDA). Protoplastos corados pelo FDA que fluorescem sob luz UV são considerados viáveis (Figura 2B,C). Nem todos os protoplastos que aparecem intactos ainda são viáveis, e alguns protoplastos viáveis podem estar em processo de morte por evacuação (Figura 2C). Nessas células, o vacúolo está inchando e acabará sendo ejetado da membrana celular. A Figura 3 mostra os protoplastos transformados com pJT01, um plasmídeo de expressão de milho de 4,3 kb derivado de CD3-911 (ABRC)15. A transfecção resulta na expressão de sGFP marcada com um sinal de localização nuclear C-terminal de c-Myc (Figura 3A). A proporção de protoplastos que expressam sGFP foi medida em múltiplos experimentos usando um hemocitômetro. A mediana da eficiência transfectiva alcançada por esse método foi de 40% após incubação noturna (n = 9, Figura 4, Tabela 1), comparável aos métodos publicadosanteriormente15. Dependendo da aplicação experimental, se a biblioteca de plasmídeos ou plasmídeos não tiver um repórter fluorescente, recomenda-se incluir um controle positivo para confirmar a transfecção. Figura 1: Mudas representativas de milho cultivadas no escuro por 10 dias após a germinação. As setas indicam a segunda e a terceira folhas, que são mais adequadas para a protoplastagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Microscopia de fluorescência da viabilidade dos protoplastos após o isolamento. (A) Imagem de campo claro dos protoplastos imediatamente após o isolamento. (B) O sinal de fluorescência dos protoplastos corados pelo FDA. (C) Sobreposição de campo claro e fluorescência mostrando os protoplastos viáveis. A seta mostra um protoplasto passando por evacuação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Microscopia de fluorescência dos protoplastos transfectados com sGFP. (A) Imagem de campo claro dos protoplastos após a transfecção. (B) O sinal de fluorescência dos protoplastos transfectados no canal de GFP. (C) Sobreposição de campo claro e fluorescência mostrando os protoplastos transformados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Porcentagem de protoplastos mostrando fluorescência da GFP após 16 h de incubação. A eficiência da transfecção variou entre os ensaios independentes, sendo a menor em torno de 20% e a maior próxima a 50%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Julgamento Células GFP contadas Total de células contadas Porcentagem de GFP 1 104 261 39.8 2 148 298 49.5 3 84 258 32.6 4 137 271 50.6 5 127 299 42.5 6 107 235 45.5 7 83 360 23.1 8 134 549 24.4 9 61 201 30.3 Significar 109 304 36 Desvio padrão 29 102 10 Tabela 1: Eficiência representativa da transfecção de protoplastos. Dados de nove ensaios recentes de protoplasting em nosso laboratório. Arquivo suplementar 1: arquivo de texto formatado pelo GenBank com a sequência de pJT01. Um plasmídeo de expressão de sGFP de 4,3 kb serve como controle positivo em protoplastos de milho transfectados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Como relatado anteriormente, a qualidade do material vegetal utilizado para protoplastos é essencial para a obtenção de protoplastos de alta qualidade16,17,18. É crucial selecionar folhas saudáveis e imaculadas. Este trabalho utilizou a cultivar de milho de pesquisa popular B73. Não testamos outras cultivares. As mudas de milho utilizadas para este protocolo foram cultivadas no escuro, pois as folhas etioladas produzem protoplastos com maior viabilidade 16 h após a transfecção em comparação com os protoplastos de folhas verdes. Para aplicações que não requerem incubação durante a noite, o uso de material de folhas verdes ou esverdeadas seria possível.

Uma etapa crítica é cortar corretamente o material foliar em fatias finas antes da digestão enzimática. Esse processo aumenta a área superficial para que as células do mesofilo sejam expostas à solução enzimática, o que aumenta o número de protoplastos recuperados. As pontas distais das folhas são descartadas, e fatias finas (≤1 mm) são cortadas com novas lâminas de barbear, que são trocadas imediatamente quando começam a embotar. Para uma determinada quantidade de tecido, cortes mais finos produzem mais protoplastos, desde que a técnica correta seja empregada para minimizar o esmagamento das folhas.

Lavar corretamente os protoplastos também é importante, pois eles são bastante delicados após passarem pela remoção da parede celular. Após a digestão, todas as soluções são mantidas no gelo, e os protoplastos cultivados no escuro são protegidos da luz. A osmolaridade e o pH são tamponados, realizando-se as lavagens em solução de MMG. Para isolar os protoplastos dos debris celulares menos densos, a centrifugação ocorre a 100 x g. Protoplastos centrifugados a 200 x g apresentam viabilidade semelhante após o isolamento, mas menor viabilidade no dia seguinte, e transformam aproximadamente metade também. Recomenda-se verificar a viabilidade dos protolastos pela coloração com FDA (diacetato de fluoresceína) imediatamente após o isolamento; A viabilidade normal varia entre 70%-90%. Protoplastos com viabilidade inferior a 40% após o isolamento produzem poucos transformantes.

A peletização e a lavagem são mais fáceis quando se trabalha com muitos protoplastos porque um pellet claramente visível é obtido após a transfecção. Por esse motivo, a transfecção é realizada com 1 milhão ou mais de protoplastos. Ao escalar o protocolo, um recipiente de tamanho adequado deve ser selecionado para as etapas de incubação (tubo de centrífuga de 1,5 mL, 15 mL ou 50 mL), e o volume de solução usado para as etapas de lavagem deve ser dimensionado de acordo. Em qualquer caso, é benéfico centrifugar em alíquotas de ≤10 mL para garantir que os protoplastos não permaneçam no sobrenadante. Uma inovação desse protocolo é a retirada da etapa de incubação e lavagem de 1 h em solução W5 que está listada em outros protocolos14,19, que se mostrou desnecessária em nossas mãos.

Como visto em outros estudos, a quantidade e a qualidade do DNA são críticas para o sucesso da transfecção19. Para plasmídeos na faixa de 4-6 kb, são utilizados 15 μg de DNA por 1 milhão de protoplastos. Preparações de DNA de baixa qualidade podem resultar em viabilidade reduzida após a transfecção, por isso recomendamos o uso de um kit comercial de extração de DNA ao isolar plasmídeos de bactérias. A incubação dos protoplastos durante a noite é feita à temperatura ambiente no escuro para permitir a transcrição da biblioteca de plasmídeos ou plasmídeos, minimizando o estresse. Após a incubação durante a noite, aproximadamente metade do número de protoplastos originalmente transfectados é recuperado. Os protoplastos são diluídos a uma concentração de 500-1.000 células/μL para incubação noturna. Os protoplastos deixados para incubar durante a noite em concentrações superiores a 1.000 células/μL têm menores taxas de recuperação e menor viabilidade. Em concentrações mais elevadas, detritos de protoplastos danificados e mortos podem contribuir para a morte de protoplastos vizinhos. Lavar os protoplastos após a incubação durante a noite serve tanto para remover esses detritos quanto para remover o excesso de plasmídeo.

Protocolos como esses têm a limitação de que nem todas as espécies de plantas ou tipos de tecidos são passíveis de protoplastação. Além disso, diferenças na expressão gênica podem ser induzidas pelo processo de protoplastagem.

Em resumo, detalhamos um protocolo simples e escalável para isolar e transfectar milhões de protoplastos viáveis da cultura agrícola básica Z. mays. Este método pode transfectar muito mais protoplastos usando PEG, com uma eficiência de transformação quase tão alta quanto os métodos baseados em eletroporação15. O maior número líquido de transformantes permite testar centenas ou milhares de construtos em experimentos de larga escala, como ensaios de repórteres massivamente paralelos12,13. Futuros experimentos em escala genômica em milho permitirão aos cientistas entender melhor a expressão gênica e a regulação gênica do milho.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo National Human Genome Research Institute Interdisciplinary Training in Genomic Sciences (T32 training grant no. HG000035 to J.T.) e pelo National Institute of Health (NIGMS 1R35GM139532 to C.Q.) e pela National Science Foundation (RESEARCH-PGR IOS-1748843 e PlantSynBio 2240888 to CQ). Agradecemos a Andrea Gallovatti, da Universidade Rutgers, pela doação das sementes de milho.

Materials

1.5 mL graduated microcentrifuge tubes VWR 490004-444
15 mL Falcon conical centrifuge tube Corning 05-527-90
250 mL Pyrex glass beaker Fisher 50-121-5005
40 um nylon mesh cell strainer Fisher 22363547
50 mL Falcon tube Corning 14-432-22
72 cell propagation tray T.O. Plastics 725607C
Aluminum foil VWR 89107-732
Bell jar Bel-Art F42022-0000
Benchtop centrifuge Eppendorf 5424-R
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-250ML Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Calcium chloride dihydrate (CaCl2*2H2O) PhytoTech Labs C135 Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.
Cellulase Onozuka R-10 Duchefa Biochemie C8001.0010
D-Mannitol PhytoTech Labs M562
Dissecting scope Reichert Microstar IV
Fluorescein Diacetate (FDA) Thermofischer Scientific F1303 Dissolve in acetone at 0.5% weight/volume to make a 1000X stock solution. Protect from light and store at -20 °C.
Fluorescence Illumination Systems Prior Lumen200
Fluorescence microscope Leica MDG36
High-capacity centrifuge Eppendorf 5810 R
Macerozyme Duchefa Biochemie M8002.0005
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M292-1KG Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.
Maize seeds B73 USDA-ARS https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473
Medium binder clip Uline S-24649
MES Sigma-Aldrich M5287-250G Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Adjust pH to 5.7 using KOH. Protect from light and store at room temperature.
Micropipette 20-200 uL Gilson F123601G
Nanodrop microvolume spectrophotometer Thermofischer Scientific ND-1000
NEB 5-alpha competent E. coli New England BioLabs C2987H
Neubauer hemocytometer Daigger Scientific EF16034F
No. 9 Single-edge razor blade Excel 20009
Orbital shaker VWR 89032-104
Poly(ethylene) glycol 4,000 Sigma-Aldrich 81240-1KG
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541-1KG Dissolve in ultrapure H2O to make a 1M stock solution. Store at room temperature.
Professional Grade Vermiculite NK Lawn & Garden G208
Round-bottom glass centrifuge tube 30 mL Kimble Chase 45500-30
Rubber adapter for Corex centrifuge tubes Corning CLS8445AO
Sphagnum peat moss Premier Horticulture 0128P
TRIzol Reagent Thermofischer Scientific 15596018
Tygon vacuum tubing VWR 76336-844
Vacuum gauge Wika 4269978
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References

  1. Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -. L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
  2. Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
  3. Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
  4. Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
  5. Tan, M. -. L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
  6. Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769 (2020).
  7. Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110 (2019).
  8. OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations. OECD-FAO Agricultural Outlook 2021-2030. OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2021).
  9. Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
  10. Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
  11. Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
  12. Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
  13. Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
  14. Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
  15. Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
  16. Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
  17. Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
  18. Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015 (2021).
  19. Yoo, S. -. D., Cho, Y. -. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).

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Tonnies, J., Mueth, N. A., Gorjifard, S., Chu, J., Queitsch, C. Scalable Transfection of Maize Mesophyll Protoplasts. J. Vis. Exp. (196), e64991, doi:10.3791/64991 (2023).
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