옥수수 중엽 원형질체의 확장 가능한 형질감염

1. 식물 재료의 성장 옥수수 알갱이를 수돗물로 두 번 헹굽니다. 커널을 실온에서 밤새 수돗물에 담그십시오. 다음날, 72 셀 종자 스타터 트레이에 젖은 1 : 1 질석 : 이탄 이끼를 채 웁니다. 커널을 한 번 헹구고 셀당 하나의 커널을 끝 캡을 아래로 심습니다. 25 °C의 장시간 조건(16시간 조명, 8시간 어둠)에서 3일 동안 성장시킵니다. 25 °C의 일정한 어둠으로 옮기고 9-11일 동안 자랍니다. 2. 플라스미드 분리 상업적으로 화학적으로 유능한 E. coli 를 제조업체의 지침에 따라 관심 있는 플라스미드로 변형합니다. 형질전환된 대장균 을 적절한 항생제와 함께 50 mL의 액체 LB 배지에서 37°C에서 하룻밤 동안 진탕하면서 성장시킨다. 상온에서 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 대장균을 펠렛화한다. 시판되는 midiprep 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드를 추출한다. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 플라스미드 DNA 농도를 추정합니다.참고: 형질주입에 적합한 물질은 ≥800ng/μL의 농도와 A260/A280이 ≥1.8이어야 합니다. 3. 원형질체 분리 효소 용액 20mL를 준비합니다.만니톨 2.18g, 셀룰라아제 R-10 0.30g, 마세로자임 R-10 0.06g을 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 분말을 혼합하기 위해 뒤집습니다. 탈이온화된H2O15 mL를 첨가한다. 200μL의 1M MES, pH 5.7을 추가합니다. 소용돌이 섞는다. 용액을 55°C에서 10분 동안 가열합니다. 실온에서 10분간 식힌다. 1MCaCl2 20μL, 소 혈청 알부민 0.02g, 1M β-메르캅토에탄올 100μL를 추가합니다. 탈이온화된 H 2O로 20mL를 채우고호일로 감싼 250mL 비커에 붓습니다. 어둠 속에서 옥수수 묘목을 꺼내십시오. 새 면도날을 사용하여 토양 위로 몇 센티미터 자릅니다. 절단 끝을 물에 넣으십시오. 사용하지 않을 때는 실온의 어두운 곳에 보관하십시오. 각 묘목의 두 번째 및 세 번째 잎을 선택하고 갈색 또는 손상된 부분이있는 잎을 제외하도록주의하십시오. 12-16 잎을 선택하십시오. 각 잎의 끝에서 ~ 1cm를 잘라내어 버립니다. 그런 다음 각 잎에서 10cm 부분을 자릅니다.알림: 더 많은 조직이 필요한 경우 추가 20mL 비커에 250mL 용량의 효소 용액을 추가로 사용하십시오. 주어진 양의 효소 용액에 잎 물질이 너무 많으면 생존력이 떨어질 수 있습니다. 기초 끝을 함께 사용하여 잎 부분을 서로 겹쳐 쌓습니다. Clamp 바인더 클립을 사용하여 베이스 끝에서 번들을 함께 고정합니다. 흰 종이 위에 나뭇잎 묶음을 놓습니다. 말단부에서 ~1cm 떨어진 곳에 나뭇잎을 잡습니다. 새 면도날을 사용하여 정맥에 수직 인 말단부에서 잎을 얇은 (0.5-1mm) 조각으로 자릅니다. 똑바로 자르지 말고 조직을 통해 짧고 앞으로 슬라이스하십시오.눈에 보이는 잔여물이 종이에 쌓이기 시작할 때마다 면도날을 교체하십시오. 눈에 보이는 잔류 물은 무딘 칼날이나 열악한 기술로 인해 조직이 으깬 것을 나타냅니다. 잎 다발 길이의 ~2cm를 자른 후 즉시 슬라이스를 효소 용액 비커로 옮깁니다. 재료가 마르지 않도록하면 얻은 원형질체의 수가 줄어들 수 있습니다. 효소 용액을 부드럽게 소용돌이 치면서 재료를 적십니다.빛을 차단하기 위해 비커 위에 호일 뚜껑을 놓습니다. 전체 번들이 바인더 클립 가까이에서 절단될 때까지 슬라이스 및 이송 과정을 반복합니다. 효소 용액 비커를 벨 항아리에 옮깁니다. 실온에서 3분 동안 주변 압력에 대해 -50.8kPa에서 -67.7kPa 사이의 진공 침투. 비커토를 탁상용 셰이커로 옮깁니다. 실온에서 40RPM으로 2.5시간 동안 흔들어 줍니다. 손으로 비커를 부드럽게 휘젓습니다. 완전히 소화되면 효소 용액이 약간 유백색으로 보입니다. 용액이 여전히 맑으면 40RPM에서 최대 1시간 동안 계속 흔들어줍니다. 3.5 시간을 초과하지 마십시오. 소화하는 동안 만니톨 + MES + MgCl2 (MMG) 용액, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 및 배양 용액을 만듭니다.MMG: 5.47 mL의 만니톨, 200 μL의 1 M MES, pH 5.7 및 750 μL의 1 MMgCl2 를 50 mL 원심분리 튜브에 넣는다. 증류된H2O로 50 mL를 채우고 Vortex를 용해시킨다. 얼음 위에 놓습니다. 배양 용액: 5.47 mL 원심분리기 튜브에 만니톨 5.47 g, pH 5.7에서 1 M MES 200 μL, 1 M KCl 200 μL를 추가합니다. 증류된H2O로 50 mL를 채우고 Vortex를 용해시킨다. 얼음 위에 놓습니다. PEG 용액: 0.44g의 만니톨, 1.0g의 PEG 및 400μL의 1MCaCl2 를 15mL 원심분리기 튜브에 추가합니다. 증류된H2O로 4 mL를 채우고 Vortex를 혼합합니다. 완전히 용해될 때까지 30분 동안 진탕하면서 37°C에서 배양합니다. 실온에서 보관하십시오. 효소 용액을 실온에서 80RPM으로 10분 동안 흔든다. 효소 용액이 담긴 비커를 얼음 위에 놓습니다. 호일 덮개를 제거하지 마십시오. 효소 용액에 얼음처럼 차가운 MMG 20mL를 넣습니다. 40μm 셀 스트레이너를 통해 50mL 원심분리기 튜브로 여과합니다.알림: PEG가 추가될 때까지 다음 단계를 위해 모든 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 빛 노출을 최소화하기 위해 원형질체를 호일로 덮으십시오. 여과액을 각각 10mL의 동일한 부피로 나눕니다. 각 부피를 둥근 바닥 유리 원심분리기 튜브에 붓고 실온에서 100 x g 에서 4분 동안 회전시킵니다. 상층액을 버리고 각 튜브에 얼음처럼 차가운 MMG 1mL를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 휘젓고 두드려 펠릿을 다시 매달아 놓습니다. 샘플을 하나의 둥근 바닥 유리 원심분리기 튜브에 결합합니다. MMG를 총 부피 5mL에 추가합니다. 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 회전합니다. 5mL의 MMG로 세척하고 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 5mL의 MMG로 세척을 반복하고 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 두 번째 세척을 한 후 상층액이 깨끗한지 관찰합니다. 계속 흐리면 세 번째 세탁을 수행하십시오. 원형질체를 MMG 1mL에 재현탁합니다. 호일로 느슨하게 덮고 얼음 위에 보관하십시오. 원형질체 수율을 결정하고 생존력을 확인하십시오.1.5mL 미세원심분리기 튜브에 4μL의 원형질체와 72μL의 MMG를 함께 추가합니다. 1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 0.5% 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 원액 1μL를 MMG 49μL에 넣어 20배 작업 용액을 만듭니다. 희석된 원형질체가 있는 튜브에 4μL의 FDA 작업 용액을 추가합니다. 실온의 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다. 원형질체 혼합물 11μL를 혈구계에 로드합니다. 명시야 현미경 아래에 놓습니다. 세포에 세포벽이 없는지 육안으로 확인하십시오. 그런 다음 원형질체의 수를 세십시오. 이 개수를 사용하여 얻은 원형질체의 총 수를 추정합니다. 그런 다음 FDA로 염색할 때 자외선 아래에서 녹색으로 형광을 발하는 원형질체의 수를 계산합니다. 성공적인 원형질체 분리는 70%-90%의 생존율을 산출합니다. 4. PEG 매개 형질감염 3.17단계에서 추정된 원형질체 농도부터 시작하여 ~10,000 원형질체/μL로 조정합니다. 농도가 낮으면 100 x g에서 3분 동안 원심분리하고 MMG에서 ~10,000 protoplasts/μL의 농도로 재현탁합니다. 1,000,000 mL 미세 원심 분리기 튜브에서 ~ 15 μg의 DNA와 1.5 개의 원형질체를 혼합합니다. 혼합물을 MMG로 114.4μL로 채우고 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 튜브의 측면을 두드려 원형질체를 다시 일시 중단합니다. 105.6 μL의 25 % PEG 용액을 원형질체에 첨가하여 12 % PEG의 최종 중량 / 부피에 도달합니다. 5-10회 뒤집어서 부드럽게 섞습니다. PEG 용액의 원형질체는 깨지기 쉽습니다. 튜브를 흔들지 마십시오. 실온의 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다.참고: transfection은 4.2단계와 4.3단계에서 제공된 볼륨의 배수로 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 1,000만 개의 원형질체와 150μg의 DNA를 1,444μL의 MMG에 현탁하고 50mL 원심분리기 튜브에서 1,056μL PEG 용액으로 처리할 수 있습니다. 5 부피의 배양 용액으로 희석하십시오. 반전으로 부드럽게 혼합하십시오. 실온에서 100 x g에서 4분 동안 회전합니다.알림: 스케일 업하는 경우 원형질체를 각각 10mL 이하가 포함된 여러 개의 둥근 바닥 유리관으로 분할하여 완전한 펠릿화를 보장합니다. 세척에 사용되는 배양 용액 부피를 비례적으로 늘립니다. 피펫팅으로 상청액을 제거합니다. 1-5 mL의 배양 용액으로 세척하고 실온에서 100 x g 에서 3 분 동안 회전시킨다. 배양 용액에서 원형질체를 500-1,000 cells/μL의 농도로 재현탁합니다. 원형질체를 실온에서 하룻밤(~16시간) 어둠 속에서 배양합니다. 5. 원형질체 회수 및 발현 확인 실온에서 100 x g에서 4분 동안 원형질체를 회전시킵니다. 알림: 스케일 업하는 경우 원형질체를 각각 10mL 이하가 들어 있는 여러 개의 둥근 바닥 유리관으로 나눕니다. 1-5 mL의 배양 용액으로 세척하고 실온에서 100 x g 에서 3 분 동안 회전시킨다. 재현탁하고 1-5mL의 배양 용액에 결합합니다. 원형질체가 형광 리포터 유전자(예: GFP)로 형질감염되는 경우, 형질주입 효율을 확인하기 위해 분취량을 취합니다. 혈구계를 사용하여 먼저 명시야 광 현미경을 사용하여 원형질체의 총 수를 계산합니다. 그런 다음 자외선 하에서 형광 원형질체의 비율을 계산합니다. 원형질체를 실온에서 100 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.참고: 원형질체는 이제 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트를 사용한 RNA 추출과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 되었습니다.