הדמיה של מולקולה בודדת של תנועתיות צידית ופעילות תעלות יונים בשכבות שומנים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ TIRF כדי לעקוב אחר תעלות יונים בודדות ולקבוע את פעילותן בקרומי שומנים נתמכים, ובכך להגדיר את יחסי הגומלין בין תנועת הממברנה הצידית לתפקוד הערוץ. הוא מתאר כיצד להכין את הממברנות, לרשום את הנתונים ולנתח את התוצאות.
Abstract
טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה הראו כי תעלות יונים רבות אינן סטטיות, אלא נתונות לתהליכים דינמיים ביותר, כולל שיוך חולף של תת-יחידות יוצרות נקבוביות ותת-יחידות עזר, דיפוזיה צידית והתקבצות עם חלבונים אחרים. עם זאת, הקשר בין דיפוזיה צידית לתפקוד אינו מובן היטב. כדי לגשת לבעיה זו, אנו מתארים כיצד ניתן לנטר ולהתאים ניידות ופעילות צידית של ערוצים בודדים בקרומי שומנים נתמכים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). הממברנות מיוצרות על מצע הידרוג’ל דק במיוחד בטכניקת DIB (ראשי תיבות של droplet interface bilayer). בהשוואה לסוגים אחרים של ממברנות מודל, לממברנות אלה יש את היתרון של היותן חזקות מבחינה מכנית ומתאימות לטכניקות אנליטיות רגישות במיוחד. פרוטוקול זה מודד שטף יונים Ca 2+ דרך תעלות בודדות על ידי צפייה בפלואורסצנטיות של צבע רגיש Ca2+ בסמיכות לממברנה. בניגוד לגישות מעקב קלאסיות של מולקולות בודדות, אין צורך בחלבוני היתוך פלואורסצנטיים או בתוויות, שיכולים להפריע לתנועה הרוחבית ולתפקוד בקרום. שינויים אפשריים בשטף היונים הקשורים לשינויים קונפורמטיביים של החלבון נובעים רק מתנועה צידית של החלבון בקרום. תוצאות מייצגות מוצגות באמצעות ערוץ טרנסלוקציה של חלבון מיטוכונדריאלי TOM-CC וערוץ החיידקים OmpF. בניגוד ל-OmpF, ה-gating של TOM-CC רגיש מאוד לכליאה מולקולרית ולאופי הדיפוזיה הצידית. לפיכך, דו-שכבות נתמכות של ממשק טיפות הן כלי רב עוצמה לאפיון הקשר בין דיפוזיה צידית לבין תפקוד תעלות יונים.
Introduction
הפרוטוקול הנוכחי נועד לתאר כיצד לחקור את המתאם בין ניידות הממברנה לבין חדירות תעלות היונים של חלבוני ממברנה בממברנות דו-שכבתיות של ממשק טיפות (DIB) 1,2,3 הנתמכות על ידי פולימרים.
הטכניקה הנוכחית משלימה מערך מרשים של כלים אנליטיים אופטיים ופני שטח מתקדמים, כגון מעקב אחר חלקיקים בודדים 4,5, ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי6,7 ומיקרוסקופ כוח אטומי במהירות גבוהה 8,9,10. אלה מספקים תובנות חשובות לגבי ההרכב והמבנה הדינמיים של ממברנות המשפיעות על תגובות מבוססות קרום11,12,13. בעוד התנועה והדיפוזיה הצידית של חלבונים תלויה בצפיפות המקומית של חלבונים בקרום, מולקולות חלבון בודדות יכולות להילכד גם ברפסודות שומנים14 ובאינטראקציות חלבון-חלבון15,16. בהתאם לתחומי החלבונים הבולטים מהממברנה לסביבה החוץ תאית או הציטוזול, ניידות החלבונים יכולה להשתנות מניידות גבוהה לחוסר תנועה לחלוטין. עם זאת, בשל מורכבות הממברנה והמבנים ההיקפיים שלה, לעתים קרובות קשה לפענח את יחסי הגומלין בין אופי הניידות הצידית לבין תפקוד החלבונים17.
ממברנות DIB הוכיחו את עצמן כפלטפורמה יעילה לאנליזות ביופיזיקליות של מולקולות בודדות של חלבוני ממברנה 18,19,20,21,22. הם נוצרים על ידי הרכבה עצמית של שומנים באמצעות מגע של טיפות מימיות עם מצעים נתמכי הידרוג’ל בשלב שומנים/שמן. בדומה לדו-שכבות השומנים הנתמכות הנפוצות (SLBs)1,23,24,25, DIBs מאפשרים כוונון מקומי של הניידות הצידית על ידי קשירה זמנית או קבועה של חלבונים למטריצה הפולימרית כאשר הם מתפקדים עם ליגנדות מתאימות17. האחרון יכול לשמש מערכת מודל לתהליכים ביוכימיים בקרום התא עם התפלגות חלבון הטרוגנית10.
הגישה הניסויית המתוארת כאן מסתמכת על הפלואורסצנטיות של צבעים רגישים ל-Ca 2+ כדי למדוד את שטף היונים Ca 2+ דרך תעלות בודדות בסמיכות לממברנה 2,22 באמצעות מיקרוסקופ TIRF. גישה אופטית זו מגבילה את הארה של הדגימה למרחק קרוב לממברנה, אשר, בשל התכונות הפיזיות של אור העירור האוונסנטי, מוביל להפחתה משמעותית של הרקע הפלואורסצנטי. האחרון הוא תנאי מוקדם אם נדרשת רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה לזיהוי מולקולות בודדות. בניגוד לשיטות אלקטרופיזיולוגיות קלאסיות26,27, אין צורך במתחי ממברנה כדי לחקור שטף יונים דרך תעלות בודדות. יתר על כן, השיטה אינה דורשת סימון בצבעים פלואורסצנטיים או במולקולות שעלולות להפריע לתנועה הרוחבית של התעלות בקרום.
השיטה שימושית במיוחד לחקר תעלות חלבונים המשובצות בממברנה ברמת המולקולה הבודדת ללא שימוש באלקטרופיזיולוגיה קלאסית. באמצעות שימוש בערוץ מוליך חלבון מיטוכונדריאלי TOM-CC מ-Neurospora crassa28,29,30 ו-OmpF, התומך בדיפוזיה של מולקולות הידרופיליות קטנות על פני הממברנה החיצונית של Escherichia coli17,31, אנו מדגימים כיצד ניתן לחקור ולהתאים את ניידות הממברנה ופעילויות התעלה של שני החלבונים. אנו מציעים כי גישה זו, למרות שהיא מותאמת ל- TOM-CC ו- OmpF, יכולה להיות מיושמת בקלות על תעלות חלבון אחרות.
Protocol
1. ייצור חלבון הערה: סעיף זה מתאר את ההליך לבידוד OmpF מ- Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, אשר חסר LamB ו- OmpC, וקומפלקס ליבת TOM מ- Neurospora crassa (איור 1)28,29. האחרון דורש בידוד מיטוכונדריה מזן N. crassa 28 המכיל צורה מסומנת 6xHis של תת-היחידה Tom22 (איור 1A), שניתן לבודד כמתואר28. הפרוטוקולים הבאים מניבים בדרך כלל 1-2 מ”ג של N. crassa TOM-CC ו-10 מ”ג של E. coli OmpF. אם רוצים להתאים את הכמות, חשוב לשמור במדויק על יחסי חלבון/דטרגנט. אלא אם צוין אחרת, יש לבצע את כל השלבים בטמפרטורה של 4°C. בידוד של קומפלקס ליבת TOMמסיס N. crassa mitochondria מטוהר (2 גרם של חלבון) המתקבל על ידי שקיעה דיפרנציאלית מ כ 1.5 ק”ג (משקל רטוב) hyphae, על פי Bausewein et al.30, בריכוז חלבון של 10 מ”ג / מ”ל ב 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 1% (w / v) DDM, 20% (v/v) גליצרול, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, ו 1 mM phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) במשך 30 דקות ב 4 ° C.אזהרה: PMSF רעיל. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. מעבירים את המיטוכונדריה המסיסים לצינורות אולטרה-צנטריפוגות ומפרידים את הממברנות הלא מסיסות מחלבוני הממברנה המסיסים על ידי אולטרה-צנטריפוגה ב-130,000 x גרם למשך 40 דקות ב-4°C וסינון עם נייר סינון סטנדרטי. אזנו עמודת Ni-NTA ארוזה מראש (נפח של 5 מ”ל) עם כ-5 נפחי עמודות (CV) של חיץ A1 (טבלה 1) באמצעות מערכת אוטומטית לטיהור חלבונים. הפעל את עמודת Ni-NTA בקצב זרימה קבוע של 1 מ”ל/דקה במהלך כל השלבים. השתמשו בטור בנפח נמוך יותר (1 מ”ל) אם החלבונים בודדו מפחות מ-2 גרם מיטוכונדריה. יש להעמיס את דגימת החלבון המסיס על עמודת Ni-NTA בקצב זרימה של 1 מ”ל/דקה. שטפו את עמודת Ni-NTA עם 5 קורות חיים של חיץ A1 (טבלה 1) כדי להסיר חלבונים לא קשורים. הצטיידו ב-TOM-CC עם 30% חיץ A2 (טבלה 1; 300 מילימטר אימידזול) ואספו את שיא החלבון כפי שהוא מופיע בכרומטוגרמה של 280 ננומטר (איור 1B). לטיהור נוסף של TOM-CC, אזנו את עמודת חילופי האניון הארוזה מראש (1 מ”ל) עם 5 CV כל אחד של חיץ B1, B2 ו-B1 (טבלה 1) באמצעות מערכת טיהור החלבונים האוטומטית. הפעל את עמודת חילופי האניונים בקצב זרימה קבוע של 1 מ”ל/דקה במהלך כל השלבים. טען את שבר השיא של TOM-CC (שלב 1.1.6) בעמודת חילופי האניונים (קצב זרימה של 1 מ”ל/דקה). הסר את החלבונים הלא מאוגדים על-ידי שטיפת העמודה עם 5 CV של חיץ B1 (טבלה 1) ושיפוע מלח ליניארי של 0%-20% Buffer B2 (טבלה 1). Elute TOM-CC עם שיפוע מלח ליניארי של 20%-35% Buffer B2, ואסוף את מקטע שיא החלבון כפי שהוא מופיע בכרומטוגרמה של 280 ננומטר (איור 1C). הערך את טוהר הדגימה על-ידי SDS-PAGE (איור 1D) וקבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון זמינה מסחרית, בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). יש להקפיא את דגימות החלבון בחנקן נוזלי ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.אזהרה: יש לטפל בחנקן נוזלי באזורים מאווררים היטב. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. בידוד של OmpFיש לשחזר את זן E. coli BE BL21(DE3) omp6, חסר LamB ו-OmpC32, ממלאי גליצרול קפוא בתנאים סטריליים, ולפסוע על צלחת אגר לוריא-ברטאני (LB) (טבלה 2). לשם כך, פזרו בהדרגה את הדגימה באופן שווה על פני הצלחת כולה. תנו לדגימה להיספג באגר למשך 5 דקות, לפני שתהפכו את הצלחת כשהמכסה סגור ותדגרו למשך הלילה ב-37°C. בחר מושבת E. coli אחת, חסן 7.5 מ”ל של LB בינוני (טבלה 2) עם מושבה יחידה זו באמצעות קיסם סטרילי, ולהשאיר לגדול לילה (14 שעות) עם תסיסה (170 סל”ד) ב 37 ° C. C. להעביר 2 x 1 מ”ל של תאי E. coli עם פיפטות סטריליות לתוך 2 x 500 מ”ל של LB בינוני (טבלה 2), ולהשאיר לגדול לילה (~ 14 שעות) ב 37 ° C עם תסיסה (~ 170 סל”ד) בשייקר. קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 5,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C, הקפיאו את הגלולה בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש נוסף.הערה: המשקל הרטוב של גלולת התא הוא בדרך כלל 5 גרם לכל 1 ליטר של תרבית. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול. הפשירו והשהו מחדש את התאים (2 גרם) ב-20 מ”ל של חיץ ליזיס C1 (טבלה 2), והעבירו את המתלה שלוש פעמים ב-1,000 psi דרך מערכת שיבוש תאים בלחץ גבוה מקוררת מראש (4°C), עם נפח דגימה מרבי של 35 מ”ל, בהתאם להוראות היצרן.זהירות: השימוש בעיתונות צרפתית עלול להוביל לפציעות חמורות. לעולם אל תחרוג ממגבלת הלחץ של התא שבו נעשה שימוש. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. הסר תאים לא שבורים מהליזט על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15 דקות, ולאסוף את supernatant. לאסוף את הממברנות על ידי אולטרה צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 1 שעות. השהה מחדש את כדורית הממברנה ב- 10 מ”ל של חיץ C2 (טבלה 2), וערבב עם נפח שווה של חיץ SDS C3 (טבלה 2) באמצעות הומוגנייזר זכוכית נושא כדור.זהירות: β-מרקפטואתנול במאגר C3 הוא רעיל. יש לפעול בהתאם לכל תקנות הבטיחות הרלוונטיות. לדגור את התרחיף באמבט מים ב 50 ° C במשך 30 דקות. צנטריפוגה את הדגימה ב 100,000 x גרם ב 20 ° C במשך 1 שעות. השהה מחדש את כדורית הממברנה ב- 10 מ”ל של חיץ SDS C4 (טבלה 2) באמצעות הומוגנייזר זכוכית נושא כדור, ודגר על המתלה באמבט מים ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.הערה: אם לא ניתן להשעות מחדש את הכדור, הוסף מאגר SDS נוסף C4 עד לנפח של 20 מ”ל. צנטריפוגו את הדגימה בטמפרטורה של 100,000 x גרם בטמפרטורה של 20°C למשך 30 דקות, ואספו את הסופרנטנט. ערבבו את הסופרנאטנט עם אוקטיל פוליאוקסאתילן (אוקטיל POE) לריכוז סופי של 0.5% (w/v), ובצעו דיאליזה של הדגימה פעמיים כנגד חיץ C5 (טבלה 2) בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות. לשם כך יש להשתמש בצינורות דיאליזה בחיתוך של 20 kDa, בהתאם להוראות היצרן, ולהניח את הדגימה בצינורות או במכשיר הדיאליזה.הערה: יש להתאים את הניתוק של צינורות הדיאליזה במידה וחלבונים בעלי מסות מולקולריות אחרות יעברו דיאליזציה. הערך את טוהר הדגימה על ידי SDS-PAGE וקבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון זמינה מסחרית, בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלה של חומרים).הערה: דגימות מחוממות ל-95°C מציגות OmpF מונומרי. דגימות שאינן מחוממות מראות OmpF בצורתו הטרימרית (איור 1F). הקפאת זעזועים חייגה OmpF ב aliquots בחנקן נוזלי, ולאחסן ב -20 ° C עד לשימוש חדש.אזהרה: יש לטפל בחנקן נוזלי באזורים מאווררים היטב. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים. 2. הקלטה אופטית חד-ערוצית של תעלות יונים בקרומי DIB הערה: סעיף זה מתאר את ההליך להכנת ממברנות DIB בתאי פולימתיל מתקרילט מיקרו-מפוברק (PMMA)2 כדי לעקוב אחר תנועת חלבונים צידית ושטף יונים דרך תעלות יונים בודדות17. את המידות והשרטוטים המדויקים לייצור התא ניתן למצוא ב- Lepthin et al.2. איור 2 נותן סקירה כללית של הרכבת תא PMMA2 והיווצרות קרומי DIB. אלא אם צוין אחרת, כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר (RT). איור 3 מראה ייצוג סכמטי של קרום DIB וכיצד שטף Ca2+ דרך חלבון ערוץ יחיד משמש לניטור התנועה בממברנה והמצב הפתוח-סגור של התעלה. הכנת שומניםהסר את תמיסת מלאי השומנים המכילה 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (25 מ”ג/מ”ל DPhPC) מומס בכלורופורם מהמקפיא ב -20 ° C, וחם RT. לשם כך, זה בדרך כלל מספיק כדי לחמם את הדגימה לאט ביד במשך כמה דקות.אזהרה: כלורופורם רעיל. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים ולבצע את כל ההליכים הכוללים כלורופורם מתחת למכסה מנוע. העבר 380 מיקרוליטר של תמיסת מלאי DPhPC (25 מ”ג/מ”ל DPhPC) לבקבוקון זכוכית. הימנע פיפטות עם איטום גומי. במקום זאת, השתמש מזרקי זכוכית מיקרוליטר עם בוכנות נירוסטה. לאחר הטיפול בתמיסת מלאי השומנים, שכבו את תמיסת מלאי השומנים בגז Ar או N2 כדי למנוע חמצון שומנים. השתמש בזרימת הגז הנמוכה ביותר האפשרית כדי למנוע אידוי של הממס האורגני שבו השומנים מומסים או התזת תרסיסי הממס מהבקבוקון. ודא כי המכסים של בקבוקוני זכוכית המכילים שומנים עם ממס אורגני מצופים polytetrafluoroethylene (PTFE) מבפנים. יבש את דגימת השומנים (שלב 2.1.2) תחת זרם של N 2, והסר את הממס האורגני שנותר מדגימת השומנים למשך הלילה תחת ואקום (2.0 mbar) באמצעות משאבת ואקום נטולת שמן. ממיסים את יריעת השומנים בתמיסת שמן הקסדקנה/סיליקון על ידי הוספת נפחים שווים של הקסדקן ושמן סיליקון (500 מיקרוליטר כל אחד) באמצעות מזרק זכוכית מיקרוליטר לריכוז שומנים סופי של 9.5 מ”ג/מ”ל.הערה: תמיסת השומנים יציבה ב- RT במשך מספר שבועות. הכנת אגרוז הידרוג’להכינו כ-1 מ”ל של תמיסת אגרוז בהתכה נמוכה (0.75% [w/v]) במים דה-יוניים כפולים, וחממו ל-85°C בבלוק חימום למשך 20 דקות לשימוש בכיסויי זכוכית עם ציפוי מסתובב.הערה: ניתן לשמור את תמיסת האגרוז ב- RT למשך מספר שבועות וניתן לחמם אותה מחדש מספר פעמים. הכינו תמיסת אגרוז בהתכה נמוכה של 2.5% (w/v) ב-0.66 M CaCl 2 ו-8.8 mM HEPES (pH7.2 ), וחממו ל-85°C בבלוק חימום למשך 20 דקות. ודא כי agarose הוא נמס היטב.הערה: ניתן לשמור את תמיסת האגרוז למשך מספר שבועות ב-RT וניתן לחמם אותה מחדש מספר פעמים, בדיוק כמו האגרוז (שלב 2.2.1) המשמש לציפוי סיבוב. הרכבת תא פולימתיל מתקרילט (PMMA) והיווצרות חד-שכבתית של שומנים בממשק שמן הידרוג’ל הקסדקני/סיליקוןהניחו כמה כיסויי זכוכית (40 מ”מ x 24 מ”מ x 0.13 מ”מ) במחזיק כיסוי מפלדת אל-חלד, ונקו אותם בכוס זכוכית למשך 10 דקות עם אצטון בחומר ניקוי על-קולי. השתמשו בדיוק במספיק אצטון כדי לטבול את הכיסויים ולכסות את הכד באופן רופף עם צלחת זכוכית כדי ליצור מערכת סגורה ונטולת לחץ שממזערת את בריחת האדים במהלך תהליך הניקוי.זהירות: אצטון הוא ממס דליק מאוד עם נקודת הבזק נמוכה. תערובות אדים/אוויר הן נפיצות. הפעל את השואב האולטרסוני באזור מאוורר היטב. לבשו ציוד מגן אישי מתאים והקפידו על אמצעי זהירות רשמיים (למשל, ללא אש גלויה וללא ניצוצות). שטפו את כיסויי הזכוכית במים שעברו דה-יוניזציה כפולה וייבשו אותם תחת זרם של N2.הערה: ניתן לאחסן כיסויים שנוקו בדרך זו למשך מספר שבועות. יש לנקות ולבצע הידרופיליזציה נוספת בחומר ניקוי פלזמה עם חמצן (0.5 מיליבר) למשך 5 דקות.הערה: בצע שלב זה מיד לפני ציפוי הסחיטה בתמיסת אגרוז, מכיוון שההשפעה ההידרופילית של ניקוי פלזמה מתפוגגת עם הזמן. הרכיבו מכסה שטופל בפלזמה על מעיל מסתובב (איור 2, שלב 1). צפו את הכיסוי בשכבה תת-מיקרומטרית של אגרוז על-ידי הוספה איטית של 140 μL של אגרוז מחומם 0.75% (w/v) בהתכה נמוכה (שלב 2.2.1) ב-3,000 סל”ד למשך 30 שניות, באמצעות פיפטה של 200 μL (איור 2, שלב 1).הערה: ניתן לקבוע את עובי סרט האגרוז באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), כמתואר17. חבר מיד את הכיסוי המצופה בספין עם השכבה הדקה של הידרוג’ל האגרוז לחלק התחתון של תא PMMA2. ודאו שהידרוג’ל האגרוז מצביע כלפי מעלה (איור 2, שלב 2). קבע את קצוות הכיסוי להתקן PMMA במיקרו-מכונה באמצעות סרט הדבקה שקוף. הניחו את מכשיר ה-PMMA על פלטה חמה המחוממת ל-35°C (איור 2, שלב 3). שפכו בזהירות 200 μL של תמיסת אגרוז 2.5% (שלב 2.2.2) לתוך פתח התא עם פיפטה (איור 2, שלב 3), מבלי ליצור בועות אוויר, כך שההידרוג’ל הדק המיושם על-ידי ציפוי ספין יוכל להתאזן עם החיץ של תמיסת האגרוז 2.5% ולהישאר רווי מים. ודאו שתמיסת האגרוז 2.5% מפוזרת סביב הידרוג’ל האגרוז המצופה בספין אך לא מעליו (איור 3A), וניתן להימנע מכך על-ידי לחיצה עדינה של תא ה-PMMA על פלטת החימום. כסו מיד את הבארות של תא ה-PMMA (איור 2, שלב 4) בסך הכל 60 מיקרוליטר של תמיסת שומנים/נפט (שלב 2.1.5), כדי להתחיל היווצרות חד-שכבתית של שומנים בממשק אגרוז-שמן וכדי למנוע התייבשות של האגרוז מצופה הספין בבארות של תא ה-PMMA. שמור את המכשיר על צלחת חמה ב 35 ° C במשך כ 2 שעות.הערה: הבארות העגולות בתא PMMA הן בקוטר של 0.5 מ”מ ובעומק של 1.8 מ”מ, על פי עבודה2 שפורסמה בעבר. הכנת טיפות מימיות מצופות שומנים בתמיסת שמן הקסדקני/סיליקוןהניחו 20 מיקרוליטר של תמיסת שמן הקסדקאן/סיליקון ליפידי (שלב 2.1.5) לכל אחת מכמה בארות מיקרו-מפוברקות בתא דגירה טיפתי (איור 2, שלב 4). מיכלים מתאימים לתמיסת שמן הקסדקאן/סיליקון ליפידים הם גומחות קטנות של 40 מ”מ x 30 מ”מ x 3.5 מ”מ בלוח PMMA דק2. הכינו מחט זכוכית מיקרו-קפילרית בקוטר פתיחת קצה של 20 מיקרומטר באמצעות מושך מיקרופיפטה אנכי או אופקי (למשל, המשמש להכנת פיפטות טלאי או אלקטרודות זכוכית חדות). העריכו את קוטר הפתיחה של מחט הזכוכית המיקרוקפילרית תחת סטריאומיקרוסקופ דו-עיני בהגדלה נמוכה, בטווח זום בין 7.5x ל-35x.הערה: יש לקבוע מראש את ההגדרות למצב חימום מקדים לפני משיכת נימי הזכוכית, מצב החימום למשיכה וכוח המתיחה, בהתאם למפרט היצרן של מכשיר המשיכה וסוג הנימים. מלא את מחט הזכוכית המיקרו-קפילרית בתמיסת הזרקה מימית 5 μL המכילה 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl וקומפלקס ליבת TOM 30 ננומטר, או לחילופין OmpF 20 ננומטר באמצעות קצה פיפטה מיקרו-נימי. השתמשו רק במים מזוקקים פעמיים שטופלו בעבר בשרף כלאט הקושר יוני מתכת רב-ערכיים (Ca2+) להכנת תמיסת ההזרקה המימית. הרכיבו את מחט הזכוכית המיקרוקפילרית עם תמיסת ההזרקה המימית על ננו-מזרק מונע פיאזו. הזריקו 100-200 nL של טיפות מימיות (איור 2, שלב 4) המכילות 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl ו-30 nM TOM core complex (שלב 1.1.12), או לחלופין 20 nM OmpF (שלב 1.2.16) לתוך הבארות בתא הדגירה הטיפתי המלא בתמיסת שמן הקסדקאן/סיליקון ליפידי (ראו 2.1.5) באמצעות ננו-מזרק. ודא שהטיפות אינן נוגעות זו בזו על ידי הנחתן במרחק של כמה מילימטרים (>10 מ”מ) זו מזו לתוך הבארות. אחרת, אם מונושכבות שומנים עדיין לא נוצרו בממשק השמן/חיץ, הן יתמזגו לטיפות גדולות יותר.הערה: אם אין נימי מחלקה ואין ננו-מזרקים זמינים, ניתן לחלופין להכין את הטיפות באופן ידני עם פיפטות מיקרוליטר חד-ערוציות בנפחים שבין 0.1 μL ל-0.5 μL, כמתואר2. במקרה זה, לעומת זאת, נפחי הטיפות אינם מדויקים באותה מידה. אפשרו היווצרות של חד-שכבה שומנית בממשק טיפה/שמן למשך כשעתיים על-ידי שמירה על תאי הדגירה PMMA וטיפות (איור 2, שלב 4) על פלטה חמה המחוממת ל-35°C. הכנה והדמיה של תעלות יונים בודדות בקרומי DIBהעבירו ידנית טיפות מימיות בודדות מהבארות של תא הדגירה של הטיפות תחת סטריאומיקרוסקופ לתוך הבארות של תא PMMA (איור 2, שלב 5), באמצעות פיפטה מיקרוליטר חד-ערוצית עם קצה פוליפרופילן חד-פעמי של 10 מיקרוליטר. אפשרו לטיפות לשקוע על החד-שכבות השומניות שנוצרו בממשקי שמן ההידרוג’ל במשך כ-5 דקות וליצור דו-שכבה ליפידית (איור 3) בין הטיפות להידרוג’ל האגרוז. הרכיבו את תא ה-PMMA עם ממברנות DIB על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ אור הפוך והעריכו את היווצרות הממברנה באמצעות יעד ניגודיות אפנון הופמן 10x (איור 2, שלב 6). היווצרות קרום DIB מסומנת על-ידי טבעת לבנה שקופה בממשק שבין הטיפה להידרוג’ל (איור 4A). קרומי DIB שנשברו אינם מראים את הטבעת הזו (איור 4B).הערה: לחלופין, ניתן להמחיש את קרומי DIB בהגדלה של פי 10 באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה או ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC). אם נוצרו קרומי DIB, הרכיבו את תא ה-PMMA על מחזיק הדגימה של מיקרוסקופ TIRF (איור 2, שלב 7) המצויד במקור אור קונבנציונלי להארה אפיפלואורסצנטית, לייזר 488 ננומטר (Pmax = 100 mW) ומצלמת CCD מכפילת אלקטרונים עם תאורה אחורית (512 x 512 פיקסלים; >95% QE) כדי להשיג גודל פיקסלים של ~0.16 מיקרומטר. מקד את הקצה של קרום DIB עם יעד הגדלה של פי 10 תחת תאורה אפיפלואורסצנטית עם מקור אור בעוצמה גבוהה באמצעות ערכת מסנן GFP. מיקוד עדין באותו קצה של קרום DIB בהגדלה גבוהה עם מטרת TIRF של שמן אפוכרומט 100x/N.A. 1.49, שוב תחת הארה אפיפלואורסצנטית, עם מקור אור בעוצמה גבוהה באמצעות סט מסנן GFP המאפשר הדמיה של פלואורסצנטיות רקע חלשה של הצבע הפלואורסצנטי Fluo-8 בטיפה (איור 4C). שנה את הגדרת המסנן מ- GFP לערכת מסנני TIRF בעלת ארבעה פסים. הפעל את הלייזר 488 ננומטר והגדר את עוצמת הלייזר בעדשת האובייקט לערך בין 8 mW ל- 10 mW.הערה: מכיוון שלרוב אין מידע כמותי על עוצמת הלייזר בעדשת המטרה, יש לכייל מראש את הגדרות עוצמת הלייזר במדידות נפרדות בעדשה, עם מד עוצמת לייזר אופטי המצויד בחיישן פוטודיודה, בהתאם למפרט היצרן.זהירות: כדי להבטיח הפעלה בטוחה של הלייזר, על המפעיל להיות מודע לסכנות האפשריות של קרינת לייזר ולתקנות למניעת תאונות. כדי להמחיש ערוצי יונים בודדים, כוונן את זווית TIRF ואת הרווח של מצלמת EMCCD (לדוגמה, הגדרת מכפיל רווח EM: 285) כך שתעלות יונים פתוחות בממברנת DIB יופיעו ככתמים פלואורסצנטיים בעלי ניגודיות גבוהה על רקע כהה (איור 4D-G), ויחס האות לרקע, כאשר נבדק חזותית, יגיע למקסימום. ודא שהכתמים, המתאימים לשטף Ca2+ דרך תעלות יונים בודדות, נשארים בפוקוס ובעלי צורה עגולה, עם עוצמה גבוהה במרכז ויורדת בהדרגה לכיוון הפריפריה. ממברנות ללא תעלות מראות רק פלואורסצנטיות רקע (איור 4C). לפני רישום התנועה והפעילות הפתוחה-סגורה של תעלות בודדות לאורך זמן, בדקו שהכתמים הפלואורסצנטיים נמצאים בפוקוס, כדי לוודא שתעלות היונים נוצרו מחדש בקרומי DIB והן נעות לרוחב במישור הממברנה. אם זה לא המקרה, זה יכול להצביע על כך שמולקולה פלואורסצנטית טובלת פנימה והחוצה משדה האוונסצנטי שנוצר על ידי הלייזר ליד הממברנה. הקלט סדרה של תמונות ממברנה המאפשרת מעקב נאות אחר המיקום וניטור המצב הפתוח-סגור של תעלות היונים הבודדות. כדי לקבוע את סוג הניידות הרוחבית (למשל, תנועה חופשית לעומת עיגון ארעי [לעיון, ראה16]) ואת מצב פעילות הערוץ (למשל, פתוח או סגור), רכוש מסלולים ארוכים מספיק (למשל, 30 שניות עד דקה) ונדגמים היטב (למשל, קצב פריימים של 48 s-1).הערה: התצפית של דיפוזיה מתועלת, מוגבלת או דיפוזיה16 דורשת שקצב הדגימה יהיה מהיר מספיק כדי למדוד דיפוזיה בלתי מוגבלת בתוך גבולות מוגבלים. בנוסף, ודא שזמן דגימת הנתונים ארוך מספיק כדי למדוד את המעבר מדיפוזיה בלתי מוגבלת לדיפוזיה מוגבלת (לפרטים, ראו Jacobson et al.16). עיבוד תמונה ונתוניםהערה: ניתן להשתמש בחבילות עיבוד תמונה בקוד פתוח33 או שגרות בכתיבה עצמית17 המבוססות על חבילות תוכנה מסחריות כדי לנתח את הדינמיקה המרחבית-זמנית של תעלות יונים בודדות ב-DIBs. כדי להיות מסוגלים להתאים את ניידות הממברנה הצידית עם שטף היונים דרך הערוצים הבודדים, אין ליישם אלגוריתמי סינון.תיקון סדרות זמן תמונה להלבנה על ידי החלת נהלים סטנדרטיים34 באמצעות שגרות כתיבה עצמית, על ידי התאמת עוצמת המסגרת הממוצעת של התמונה המלאה ל- , כאשר t הוא אינדקס המסגרות (זמן) ו- kהוא פרמטרי ההתאמה. לאחר מכן, תקן את סדרת הזמן לפי , כאשר I(t) היא העוצמה. לחלופין, עבור ניתוח נתונים ראשוני, בצע תיקוני רקע באמצעות תוכנת קוד פתוח עם אלגוריתמים מיושמים של כדור מתגלגל33 ורדיוס כדור מתגלגל, בהתאם לנקודה ולגודל הפיקסלים של המצלמה (למשל, 50 פיקסלים). קבע את המיקומים המרחביים ואת המשרעת של נקודה פלואורסצנטית בתוך אזור עניין מוגדר (ROI) (לדוגמה, 30 x 30 פיקסלים), על ידי התאמת I(t) בזמן נתון t לפונקציה גאוסיאנית דו-ממדית עם הטיה מישורית המביאה בחשבון מעברי תאורה מקומיים אפשריים לפי . כאן, x = (x, y) הוא החזר ההשקעה עם מידע על עוצמת הפלואורסצנטיות, A ו- σ הם המשרעת והרוחב של גאוס, pk הם פרמטרים המאפיינים את עוצמת הרקע של החזר ההשקעה, ו- μ = (x 0, y 0) מגדיר את מיקום הגאוס. שטף היונים דרך תעלה בודדת נתון על ידי הפרמטר A. מסלול הערוץ נתון על ידי x, ומאפשר לקבוע את הניידות הרוחבית של הערוץ. לחלופין, ניתן לקבוע את המיקומים והעוצמות של נקודות בודדות באמצעות פלטפורמות קוד פתוח33 ותוספים כמתואר35,36. הערך את דיוק המיקום37 לאחר המרת קריאת מצלמת EMCCD למספרי פוטון38. התווה את המשרעת הפלואורסצנטית A לעומת הזמן ואת המסלול המתאים x כדי לקבוע מתאם אפשרי בין דיפוזיביות התעלה לבין שטף היונים דרך הערוץ. בצע זאת עם כל תוכנת גרפיקה. במקרה של תנועת ערוץ רוחבי חופשי, לקבוע את מקדם הדיפוזיה הצידית D על ידי רגרסיה ליניארית של עיכוב הזמן τ, ולחשב את התזוזה הריבועית הממוצעת של הכתמים מ – x לפי .הערה: מקדמי דיפוזיה אופייניים17 עבור TOM-CC ו- OmpF הנעים בחופשיות בקרומי DIB נעים בין 0.5 ל- 1.5 מיקרומטר2 s-1. מולקולות שקבוע הדיפוזיה שלהן קטן מ-0.01 מ”מ2·s-1 מוגדרות כמשותקות17.
Representative Results
הקלטה אופטית חד-ערוצית אופטית נטולת אלקטרודות בזמן אמת חושפת את יחסי הגומלין בין תנועת חלבונים צידית לבין תפקודן של תעלות יונים בודדות בקרומי DIB. הרכבה מחדש של קומפלקס ליבת TOM מיטוכונדריאלי (איור 1A) לתוך קרום DIB (איור 4D) מדגימה מתאם זמני חזק בין ניידות צידית וחדירות יונים (איור 5A). נראה כי ה-TOM-CC רגיש למצב התנועה הצידית17. תעלות נעות מראות שטף Ca2+ דרך הנקבוביות שלהם ועוצמות נקודות פלואורסצנטיות גבוהות. מולקולות לכודות שאינן נעות מראות עוצמות פלואורסצנטיות נמוכות ובינוניות. עבור נקבובית יבוא החלבונים הכללית של המיטוכונדריה TOM-CC, גישה זו של מולקולה בודדת חשפה מתאם זמני חזק בין ניידות צידית וחדירות יונים, מה שמרמז על כך שלערוץ TOM-CC יש תכונות רגישות למכנו17. עצירה צידית של מולקולות TOM-CC הנעות בחופשיות מלווה בסגירה חלקית או מלאה של ערוץ TOM-CC. הדמיה של ממברנות DIB עם OmpF (איור 1E ואיור 4F), אשר מוטמעות כמעט במלואן בקרום, לא מראה השפעות עצירה וסע (איור 5B). עצירות אקראיות של OmpF אינן קשורות לשינוי בעוצמה, ולכן, עם סגירת הנקבוביות שלה. בהתבסס על אותות פלואורסצנטיים38, ניתן להעריך את דיוק המיקום של הערוצים הבודדים בטווח שבין 5 ל -10 ננומטר. עם זאת, יש לציין כי דיוק זה אינו יכול להיות מושג אם התעלות מתנודדות מעט עקב עיגון נייד עם הידרוג’ל אגרוז, כפי שמוצג, למשל, עבור מולקולות TOM-CC במצב ביניים עם תזוזה ממוצעת של שורש של 120 ננומטר (איור 5A). איור 1: בידוד של TOM-CC. (A) מבנה Cryo EM של N. crassa TOM-CC30,39. מיטוכונדריה מזן N. crassa המכיל Tom22 עם תג 6xHis היו מסיסים ב-DDM ועברו כרומטוגרפיית זיקה Ni-NTA (B) וכרומטוגרפיית חילופי אניון (C). (D) SDS-PAGE של TOM-CC מבודד. (E) מבנה גבישי (PDB, 1OPF) ו-(F) SDS-PAGE של E. coli OmpF מטוהר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תרשים זרימה של הרכבת תא PMMA. שלב 1: כיסוי זכוכית מצופה בהידרוג’ל אגרוז. שלב 2: הכיסוי המצופה בספין מותקן בתא מיקרוסקופיית PMMA בהתאמה אישית. שלב 3: אגרוז נמס נמוך נוסף מתווסף ליציאת הכניסה של תא PMMA על פלטה חמה של 35 מעלות צלזיוס. שלב 4: חד-שכבות ליפידים נוצרות סביב טיפות מימיות בממשק חיץ/שמן (משמאל) ובממשק אגרוז הידרוג’ל/שמן (מימין). שלב 5: טיפות מימיות בודדות מוחדרות לבארות של תא PMMA כדי ליצור דו-שכבה ליפידית במגע של שתי החד-שכבות השומנים. שלב 6: היווצרות קרומי DIB מאומתת על ידי מיקרוסקופ ניגודיות אפנון הופמן. שלב 7: תמונות של אזורים נבחרים של ממברנות DIB עם תעלות יונים שהוחדרו נרכשות במיקרוסקופ TIRF. ירוק: 0.75% אגרוז; צהוב: 2.5% אגרוז המכיל יוני Ca2+ ; מגנטה: שלב השומנים/שמן; כחול כהה: חיץ טיפות מימי המכיל צבע וחלבון רגישים ל-Ca2+. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: מערך ניסויי. (A) ייצוג סכמטי של קרום DIB בבאר PMMA. הדו-שכבה נשענת על סרט אגרוז דק במיוחד של 0.75% כדי לאפשר הדמיה של שטף Ca 2+ דרך תעלת יונים לאורך זמן באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-Ca2+ (Fluo-8) בטרנס. (B) שטף Ca2+ נשלט באופן בלעדי על ידי הלחץ האוסמוטי מסיס לטרנס. זה מאפשר הן את קביעת המיקום בממברנה והן את המצב הפתוח-סגור של התעלה. התעלה המוצגת כאן היא הערוץ מוליך החלבונים TOM-CC של N. crassa mitochondria30. (C) מסלול של ערוץ TOM-CC יחיד. ירוק: ערוץ נע; צהוב: ערוץ שאינו זז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: הדמיה של TOM-CC ו-OmpF בקרומי DIB. (A) קרום DIB שצולם על ידי מיקרוסקופ ניגודיות אפנון הופמן המראה את אזור המגע הדו-שכבתי בין ההידרוג’ל לטיפה. (B) קרום DIB שבור בתמונה כמו ב-(A). חץ, קצה תא PMMA. (C) קרום DIB שצולם במיקרוסקופ TIRF ללא תעלות חלבון. (D) קרום DIB עם TOM-CC משוחזר, מצולם במיקרוסקופ TIRF. הריבועים הלבנים מסמנים כתמים בעוצמה גבוהה (SH), בינונית (SI) ונמוכה (SL). (E) התאמת פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות של שלושת הכתמים המסומנים ב-(A) לפונקציות גאוס דו-ממדיות חושפת את המיקום של TOM-CCs בודדים ושטף Ca2+ דרך התעלה. (F) קרום DIB עם OmpF משוחזר. (G) התאמה גאוסיאנית של הכתם הפלואורסצנטי המסומן ב-(F). בניגוד לקומפלקס החלבון הדו-נקבובי β-חבית TOM-CC, ה-OmpF בעל שלוש הנקבוביות β-חבית חושף מצב חדירות אחד בלבד. גודל פיקסל, 0.16 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: פעילות הערוץ מתואמת עם ניידות צידית של TOM-CC. (A) עקבות המשרעת הפלואורסצנטית (למעלה) והמסלול המקביל (למטה) של TOM-CC מצביעים על כך שפעילות הערוץ הפתוח-סגור של TOM-CC מתואמת עם ניידות הממברנה הצידית של המתחם. המסלול מציג שלושה מצבי חדירות. ירוק: מצב פתוח לחלוטין; צהוב: מצב חדירות ביניים; אדום: מצב ערוץ סגור; כוכב אדום: TOM-CC במצב הביניים מתנדנד סביב מיקומו הממוצע בכ-±60 ננומטר. דיוקי המיקום37 המבוססים על אותות הפלואורסצנטיים במצבים הפתוחים והבינוניים המלאים נעים בין 5 ננומטר ל -10 ננומטר. (B) עקבות משרעת פלואורסצנטית (למעלה) ומסלול מקביל (למטה) של OmpF. OmpF חושף רמת עוצמה אחת בלבד, בין אם הוא בתנועה או לכוד. קטעי המסלול המתאימים לפרקי הזמן של מולקולות לכודות מסומנים באפור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. מאגר ריכוזי מגיבים נפח A1* 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) n-דודציל-β-D-מלטוזיד (DDM), 10% (v/v) גליצרול, 300 mM NaCl ו-1 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) 100 מ”ל A2* 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) DDM, 10% (v/v) גליצרול, 1 M Imidazole ו 1 mM PMSF 100 מ”ל ב1* 20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (עם v) DDM, 2% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) 100 מ”ל B2* 20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) 100 מ”ל * מסירים את הגז ועוברים דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. טבלה 1: פתרונות חיץ לבידוד TOM-CC. מאגר ריכוזי מגיבים נפח ליברות* 1% (w/v) טריפטון, 1% (w/v) NaCl ו-0.5% (w/v) תמצית שמרים 1100 מ”ל ג1 2 mM MgCl2, ו~ 750 יחידות DNAse ו- 50 mM Tris-HCl pH 7.5 20 מ”ל ג2 50 מ”מ Tris-HCl, pH 7.5 50 מ”ל ג3 4% (w/v) נתרן דודציל סולפט (SDS), 2 mM β-מרקפטואתנול ו-50 mM Tris-HCl pH 7.5 50 מ”ל ג4 2% (עם v) SDS, 500 mM NaCl ו- 50 mM Tris-HCl pH 7.5 50 מ”ל ג5 0.5% (w/v) אוקטיל-פוליאתילן (octyl POE), 1 mM EDTA ו-20 mM Tris pH 8.5 1000 מ”ל * יש לעקר לפני השימוש. טבלה 2: פתרונות חיץ לבידוד OmpF.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מספק מבוא לשימוש בקרומי DIB כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תנועת תעלת יונים צידית ותפקוד התעלה באמצעות מיקרוסקופ TIRF של מולקולה יחידה. כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר האפשריים, הכנת ממברנות DIB יציבות עם כמה שיותר ערוצים מופרדים היטב היא חיונית להשגת סדרות זמן של חלקיקים בודדים, אשר ניתן לנתח באופן משביע רצון.
פרמטרים קריטיים שיש לייעל כוללים את בחירת השומנים, ריכוז השומנים בשלב השמן, וריכוזי החלבונים וחומרי הניקוי בטיפות המימיות. השומנים המשמשים הם יוצאי דופן, בכך שהם אינם מראים מעבר פאזה ברור בטמפרטורות נמוכות. DPhPC הוא ליפיד נפוץ לייצור מערכות קרום יציבות40. באופן עקרוני, כל שומנים אשר שומרים על הסביבה הנוזלית שלהם בטמפרטורות נמוכות עשויים להתאים ליישום זה. בנוסף, השומנים לא צריכים להיות רגישים לחמצון. ריכוז חומר הניקוי בטיפות צריך להיות נמוך ככל האפשר כדי למנוע קרע בממברנה. ממברנות יציבות ושיעורי שילוב חלבון טובים מושגים בדרך כלל עם ריכוזי חומרי ניקוי מתחת לריכוז המיצלה הקריטי (cmc), בהתחשב בכך שחלבון הממברנה אינו מזרז.
אם קרומי DIB אינם סובלים דטרגנטים ספציפיים21,41, או אם החלבונים אינם משתלבים מתמיסת דטרגנטים נמוכה בקרומי DIB, ניתן תחילה להרכיב מחדש את תעלות החלבון לשלפוחיות שומנים חד-למלריות קטנות (SUV), אשר לאחר מכן מאוחות לקרומי DIB מצד הטיפה, כפי שהוכח בהצלחה עבור E. coli MscL 42 . לעיתים, קרומי DIB אינם נוצרים מכיוון שריכוז השומנים בשלב השמן נמוך מדי. כדי למנוע התפוצצות של קרומי DIB, יש גם להיות מודעים לכך שהלחץ האוסמוטי בין ההידרוג’ל לטיפה חייב להיות מאוזן במדויק מבלי להשפיע על שטף Ca2+ מסיס לטרנס יתר על המידה. נראה שעובי האגרוז האופטימלי וגודל הרשת חיוניים לצפייה בדיפוזיה של חלבוני הממברנה. יש להימנע מכל ייבוש של שכבת האגרוז. ניתן לקבוע את העובי באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי17. על ידי שינוי ריכוז האגרוז, הנפח ומהירות הסיבוב במהלך ציפוי הסחיטה, ניתן לייעל את גודל ועובי הרשת של ההידרוג’ל. שים לב, עם זאת, שעובי שכבת ההידרוג’ל משפיע על ניגודיות התמונה. כדי ללכוד חלבוני ממברנה ב-DIBs, ניתן להחליף את הידרוג’ל האגרוז באגרוז מסונתז בהתאמה אישית, ללא הצלבה, בשינוי Ni-NTA ובהתכה נמוכה כדי ללכוד אותם באמצעות His-tag17. רקע פלואורסצנטי גבוה מדי נגרם לעתים קרובות על ידי קרע של קרום DIB. זו בעיה במיוחד עם תאים מרובי בארות, מכיוון שהצבע הרגיש Ca2+ מתפזר לתוך ההידרוג’ל. במקרה זה, יש להימנע מבארות סמוכות. הלבנה פלואורסצנטית של הצבע הרגיש Ca2+ מעל הממברנה לא אמורה להיות גורם מגביל משמעותי, שכן היא מוחלפת על-ידי צבעים לא מעוררים בחלק הארי של הטיפה (איור 3A) מחוץ לשדה האוונסצנטי של TIRF. דיוק הלוקליזציה של החלבון ניתן על ידי דיוק התאמת הכתמים וגודל הפיקסלים.
אותות פלואורסצנטיים חלשים יכולים להיגרם על ידי שטף Ca2+ נמוך דרך הערוץ. סיבות אפשריות כוללות: (i) הגדרות TIRF לא מדויקות (למשל, עוצמת לייזר), (ii) לחץ Ca 2+ אוסמוטי על פני הממברנה, או (iii) החדירות הפנימית של Ca2+ של התעלות נמוכה מדי. כדי להתמודד עם הבעיה הראשונה, עוצמת הלייזר, זווית TIRF ורווח המצלמה צריכים להיות אופטימליים. ניתן להתגבר על שתי הבעיות האחרונות על ידי יישום פוטנציאל חשמלי על פני הממברנה 2,43. עם זאת, יישום מתחים חיצוניים יכול לעוות את התוצאה, שכן אפקטים חשמליים יכולים להשפיע על פתיחת התעלה של תעלות יונים מגודרות ליגנד או מכנורגישות שלמעשה אינן מבוקרות מתח. דוגמאות לתעלות כאלה הן טרנסלוקאז החלבון המיטוכונדריאלי TOM-CC27, ותת-היחידה יוצרת-הערוצים שלו Tom40 26,44,45,46. לבסוף, יש לציין כי, החדרת חלבוני ממברנה לתוך ממברנות DIB בכיוון מסוים כדי להשיג פונקציונליות רצויה היא מסובכת, ומחקרים כמותיים הם נדירים47,48. במקרים מסוימים, הכיוון של החלבונים המשולבים הוא אקראי. זוהי בעיה רצינית לחקר חלבוני ממברנה, מכיוון שחלבוני ממברנה מסוימים מופעלים רק בצד אחד של הממברנה.
מיקרוסקופ TIRF הוא שיטה רבת עוצמה לטיפול באירועים של מולקולה בודדת בממברנות נתמכות מישוריות49. דוגמאות לכך כוללות הבהרת מסלול הרכבה וקיפול של חלבוני תעלה כגון α-המוליזין50, פרפרינגוליזין O 51 ו-OmpG52. מחקרים אלה כללו FRET כטכניקה נוספת. בנוסף, הפעלת תעלת היונים המכנורגישה MscL נחקרה בעבר על ידי גירוי מכני של DIB bilayers42 נתמך באמצעות מדידות נוכחיות. בהתבסס על עבודה זו, מחקרים עתידיים יוכלו לשלב את הפלטפורמה המתוארת כאן עם ניסויי FRET של מולקולה בודדת כדי לטפל בתעלות רגישות למכנו ברמת המולקולה הבודדת באופן אופטי17. הזרקת חיץ לתוך הטיפה, מתיחת החד-שכבה הפנימית של DIB, או קשירה ממוקדת של תעלות בודדות להידרוג’ל הבסיסי יכולה לשמש למחקר נוסף לא רק את המנגנון הפיזיקלי של תעלות המופעלות מכנית, המגיבות למתח ו/או עקמומיות הממברנה כפי שמוצג עבור MscL ו-MscS, תחום שתי הנקבוביות K+-channels, TREK-1, TREK-2, ו-TRAAK, ו-PIEZO (לסקירה, ראו53), אך גם קשירה מקומית לשלד התאיים, כפי שמוצג עבור תעלת היונים הרגישה למגע NOMPC54,55.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לביאטה ניטשקה על עזרתה בהכנת חלבונים ולרובין גוש, מיכאל שוויקרט (שטוטגרט) ומקסימיליאן אולבריך (פרייבורג) על דיונים מעמיקים. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המחקר שטוטגרט ביולוגיה של מערכות (SRCSB) ומענק מקרן באדן וירטמברג (BiofMO-6 to SN).
Materials
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| 100x Oil objective Apochromat N.A. 1.49 | Nikon | MRD01991 | TIRF microscope |
| 10x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.25 | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
| 10x objective N.A. 0.25 | Nikon | MRL00102 | TIRF microscope |
| 40x Hoffmann modulation contrast objective NA 0.55 | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
| 488 nm laser, 100 mW | Visitron | TIRF microscope | |
| Adhesive tape | |||
| Äkta pure | Cytiva | Protein purification system | |
| Bradford assay kit, Pierce | Thermo Fisher | 23236 | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | |
| Chelax 100 resin | Biorad | 143-2832 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | MC1024452500 | |
| Dialysis cassettes Slide-A-Lyzer 20 k MWCO | Thermo Fisher | 87735 | |
| DIB chamber | Custom made | PMMA chamber for DIB membranes | |
| Digital power meter and energy console | Thorlabs | PM100D | Laser power meter |
| Dimethyl sulfoxide | Roth | 4720.1 | |
| Double distilled H2O | |||
| Eclipse TS 100 Hoffmann modulation contrast microscope | Nikon | Microscope to assess DIB membrane formation | |
| EDTA | Roth | 8042.2 | |
| EMCCD camera iXon Ultra 897 | Andor | TIRF microscope | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-M | |
| Fixed angle rotor Ti70 | Beckman Coulter | ||
| Fluo-8, CalciFluorTM | Santa Cruz Biotechnology | SC-362561 | Ca2+-sensitive dye |
| French press cell disruption homogenizer | Igneus | Igneus 40000 psi | |
| GFP filter | AHF | Filter seeting used for excitation of DIB-membranes by epifluorescence with white light source | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 4878 | |
| Glass coverslips 40 mm x 24 mm x 0.13 mm | Roth | 1870.2 | |
| Glycerol | Roth | 3783.2 | |
| Hamilton syringe 10 mL | Roth | X033.1 | |
| Hamilton syringe 100 mL | Roth | X049.1 | |
| Hamilton syringe 500 mL | Roth | EY49.1 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer comfort | |
| Heating plate | Minitube | HT200 | |
| Hepes | Roth | 9205.3 | |
| Hexadcane | Sigma-Aldrich | 296317 | |
| His Trap HP 1 mL | Cytiva | 29051021 | Ni-NTA column |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 1.04716.1000 | |
| KCl | Honeywell | 10314243 | |
| KLM spin coater | Schaefer Tec | SCV-10 | |
| List medical L/M-3P-A vertical pipette puller | Artisan Technology Group | 57761-1 | |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| M8 Stereomicroscope | Wild | Stereomicrosope | |
| Matlab | MathWorks | R2022a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroFil pipette tips | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| N2 gas | |||
| NaCl | Roth | 3957.1 | |
| Nanoliter 2010 injector | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | |
| n-dodecyl-b-D-maltoside | Glycon Biochemicals | D97002-C | |
| Ni-NTA agarose, non-crosslinked | Cube Biotech | 124115393 | Custom made |
| NIS-Elements AR software | Nikon | MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930 | Imaging software |
| n-octyl-polyoxyethylene | Sigma-Aldrich | 40530 | |
| O2 gas | |||
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Roth | 6367.3 | |
| Photodiode sensor Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | S130C | Sensor for laser power meter |
| Plasma cleaner | Diener Electronics | Zepto | |
| Preparative ultracentrifuge Optima | Beckman Coulter | ||
| Quad-band TIRF-filter 446/523/600/677 HC | AHF | Filter setting used for excitation of DIB-membranes with 488 nm laser | |
| Resource Q 1 mL | Cytiva | 17117701 | Anion exchange column |
| Silicon oil AR 20 | Sigma-Aldrich | 10836 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Roth | 2326.2 | |
| Super LoLux camera | JVC | Stereomicrosope | |
| Thermoshaker | Gerhardt | THL 500/1 | |
| Ti-E Fluorescence microscope | Nikon | MEA53100 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 9090.3 | |
| Tryptone | Roth | 8952.2 | |
| Ultrasonic bath | Bandelin Sonorex | RK 100 | |
| Vaccum pump | Vacuubrand | MD 4C NT | |
| White light source for epifluorescence illumination (100 W) | Nikon | MBF72655 | TIRF microscope |
| Yeast extract | Roth | 2363.2 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
- Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
- Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
- Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
- Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
- Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
- Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
- Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
- Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
- Schink, K. O., Tan, K. -. W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
- Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471 (2022).
- Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
- Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
- Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
- Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
- Kiessling, V., Yang, S. -. T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
- Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
- Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
- Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
- Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
- Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
- Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
- Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
- Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068 (2007).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices – From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671 (2013).
- Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
- Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
- Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
- Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180 (2017).
- Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
- Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
- Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35 (2018).
- Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
- Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
- Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
- Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119 (2022).
- Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388 (2021).
Citer Cet Article
Wang, S., Nussberger, S. Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. Vis. Exp. (192), e64970, doi:10.3791/64970 (2023).