TACI: Ein ImageJ-Plugin für die 3D-Calcium-Imaging-Analyse
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) ist ein Open-Source-ImageJ-Plugin für die 3D-Calcium-Imaging-Analyse, das die Bewegung auf der z-Achse untersucht und den Maximalwert jedes Z-Stapels identifiziert, um die Intensität einer Zelle zum entsprechenden Zeitpunkt darzustellen. Es kann Neuronen trennen, die sich in lateraler (x / y) Richtung, aber auf verschiedenen Z-Ebenen überlappen.
Abstract
Die Forschung in den Neurowissenschaften hat sich dahingehend entwickelt, dass komplexe Bildgebungs- und Berechnungswerkzeuge verwendet werden, um umfassende Informationen aus Datensätzen zu extrahieren. Die Kalziumbildgebung ist eine weit verbreitete Technik, die eine ausgeklügelte Software erfordert, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, aber viele Labore haben Schwierigkeiten, Berechnungsmethoden anzuwenden, wenn sie Protokolle aktualisieren, um modernen Standards zu entsprechen. Schwierigkeiten entstehen durch mangelnde Programmierkenntnisse und Paywalls für Software. Darüber hinaus zeigen die interessierenden Zellen während der Kalziumbildgebung Bewegungen in alle Richtungen. Es wurden viele Ansätze entwickelt, um die Bewegung in lateraler (x/y) Richtung zu korrigieren.
In diesem Artikel wird ein Workflow beschrieben, bei dem ein neues ImageJ-Plugin, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), verwendet wird, um Bewegungen auf der z-Achse in der 3D-Calcium-Bildgebung zu untersuchen. Diese Software identifiziert den maximalen Fluoreszenzwert aus allen Z-Positionen, in denen ein Neuron erscheint, und verwendet ihn, um die Intensität des Neurons an der entsprechenden T-Position darzustellen. Daher kann dieses Werkzeug Neuronen trennen, die sich in lateraler (x/y) Richtung überlappen, aber auf unterschiedlichen z-Ebenen erscheinen. Als ImageJ-Plugin ist TACI ein benutzerfreundliches Open-Source-Berechnungswerkzeug für die 3D-Kalzium-Bildgebungsanalyse. Wir validierten diesen Workflow mit thermosensitiven Neuronen von Fliegenlarven, die Bewegungen in alle Richtungen während der Temperaturschwankung zeigten, und einem 3D-Kalzium-Bildgebungsdatensatz, der aus dem Fliegengehirn aufgenommen wurde.
Introduction
Der intrazelluläre Calciumspiegel ist ein präziser Marker für die neuronale Erregbarkeit. Die Calcium-Bildgebung misst die Veränderungen des intrazellulären Calciums, um die neuronale Aktivität zu verstehen1. Studien in den Neurowissenschaften haben diese Methode aufgrund der Entwicklung von Techniken zur Messung der intrazellulären Kalziumkonzentration, einschließlich genetisch kodierter Kalziumindikatoren (GECIs), wie GCaMP2,3, die durch genetische Ansätze nichtinvasiv in bestimmten Gruppen von Neuronen exprimiert werden können, zunehmend verwendet. Die geringeren Kosten für Laser und Mikroskopkomponenten haben auch den Einsatz von Calcium-Bildgebungerhöht 4. Wichtig ist, dass die Kalzium-Bildgebung es ermöglicht, sowohl einzelne Neuronen als auch große Neuronenpopulationen gleichzeitig in frei beweglichen Tieren aufzuzeichnen und zu untersuchen5.
Nichtsdestotrotz ist die Analyse von Kalzium-Bildgebungsdaten eine Herausforderung, da (1) die Fluoreszenzänderungen einzelner Zellen im Laufe der Zeit verfolgt werden, (2) das Fluoreszenzsignal intermittierend verschwindet oder mit neuronalen Reaktionen wieder auftaucht und (3) sich die Neuronen in alle Richtungen bewegen können, insbesondere in und aus einer Fokusebene oder auf mehreren Ebenen 4, 6. Preise Die manuelle Analyse ist zeitaufwändig und wird mit zunehmender Länge der Aufzeichnungen und der Anzahl der Neuronen unpraktisch. Es wurden verschiedene Softwareprogramme entwickelt, um den Prozess der Analyse der Kalziumbildgebung zu beschleunigen. Bisher wurde Software in einem begrenzten experimentellen Kontext entwickelt, was es für andere Labore schwierig machte, sie zu übernehmen. Jüngste Bemühungen, moderne Standards für die gemeinsame Nutzung von Software zu erfüllen, haben zur Entwicklung mehrerer Tools geführt, die Kalzium-Bildgebungsdaten über verschiedene Gruppen hinweg konsistent analysieren können 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Die meisten dieser Tools erfordern jedoch Programmierkenntnisse und/oder sind auf kommerzielle Software angewiesen. Mangelnde Programmierkenntnisse und Software-Paywalls halten Forscher davon ab, diese Methoden anzuwenden. Darüber hinaus konzentrieren sich viele dieser Werkzeuge auf die Korrektur der x/y-Bewegung, obwohl auch die Bewegung auf der z-Achse explizit diagnostiziert und korrigiert werden muss6. Es besteht ein Bedarf an einem Berechnungswerkzeug zur Analyse der 3D-Kalziumbildgebung, das sich auf Neuronen konzentriert, die eine Z-Drift aufweisen und auf mehreren Z-Ebenen auftreten. Idealerweise sollte dieses Tool Open-Source-Software verwenden und keine Programmierkenntnisse erfordern, damit andere Labore es problemlos übernehmen können.
Hier haben wir ein neues ImageJ-Plugin, TACI, entwickelt, um 3D-Kalzium-Bildgebungsdaten zu analysieren. Zunächst benennt die Software die 3D-Kalzium-Bildgebungsdaten bei Bedarf um und organisiert sie nach Z-Positionen. Die interessierenden Zellen werden in jeder z-Position verfolgt, und ihre Fluoreszenzintensitäten werden mit TrackMate oder anderen Berechnungswerkzeugen extrahiert. TACI wird dann angewendet, um die Bewegung auf der z-Achse zu untersuchen. Es identifiziert den Maximalwert eines Z-Stapels und verwendet ihn, um die Intensität einer Zelle zum entsprechenden Zeitpunkt darzustellen. Dieser Workflow eignet sich für die Analyse der 3D-Kalziumbildgebung mit Bewegung in alle Richtungen und/oder mit Neuronen, die sich in lateraler (x/y) Richtung überlappen, aber in verschiedenen Z-Positionen auftreten. Um diesen Workflow zu validieren, wurden 3D-Kalzium-Bildgebungsdatensätze von thermosensitiven Neuronen der Fliegenlarven und Pilzneuronen im Gehirn verwendet. Bemerkenswert ist, dass TACI ein Open-Source-ImageJ-Plugin ist und keine Programmierkenntnisse erfordert.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde ein neues ImageJ-Plugin, TACI, entwickelt und ein Workflow zur Analyse der 3D-Kalziumbildgebung beschrieben. Viele derzeit verfügbare Werkzeuge konzentrieren sich auf die Korrektur der x/y-Bewegung, obwohl auch die Bewegung auf der z-Achse explizit diagnostiziert oder korrigiert werden muss6. Während der Bildaufnahme in einem lebenden Organismus ist eine Bewegung auf der z-Achse unvermeidlich, selbst wenn der Organismus immobilisiert ist, und einige Reize, wie z. B. Temper…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ein Zeiss LSM 880 im Fralin Imaging Center wurde verwendet, um die Kalzium-Bildgebungsdaten zu sammeln. Wir danken Dr. Michelle L. Olsen und Yuhang Pan für ihre Unterstützung bei der IMARIS-Software. Wir danken Dr. Lenwood S. Heath für konstruktive Kommentare zum Manuskript und Steven Giavasis für Kommentare zur GitHub README-Datei. Diese Arbeit wurde von NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) und NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) an L.N. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
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