Este protocolo permite revelar el impacto de los profagos en sus anfitriones. Los cultivos bacterianos se sincronizan utilizando las condiciones que mejor apoyan el estado lisogénico, limitando la inducción espontánea. La RT-qPCR distingue inequívocamente los genes restringidos por profagos y los desacoplados del control de fagos de los que se expresan durante el ciclo de replicación lítica.
Los fagos templados se encuentran integrados como profagos en la mayoría de los genomas bacterianos. Algunos profagos son crípticos y están fijados en el cromosoma bacteriano, pero otros son activos y pueden desencadenarse en una forma replicativa, ya sea espontáneamente o por exposición a factores inductores. Los profagos se asocian comúnmente con la capacidad de conferir la producción de toxinas u otros rasgos asociados a la virulencia en su célula huésped. Estudios más recientes han demostrado que pueden desempeñar un papel mucho más importante en la alteración de la fisiología de sus huéspedes. La técnica aquí descrita nos ha permitido investigar cómo afectan los profagos a la expresión génica en la bacteria oportunista Pseudomonas aeruginosa.
En este trabajo, se comparó el crecimiento de la cepa silvestre de P. aeruginosa PAO1 con el de lisógenos isogénicos portadores de diferentes combinaciones de profagos de la cepa epidémica de Liverpool (LES) LESB58. En un cultivo de lisógenos, una proporción de células bacterianas apoyará la replicación de bacteriófagos líticos (inducción espontánea) con un alto nivel de expresión por célula de genes de fagos tardíos, como los asociados con el ensamblaje de partículas de fagos, enmascarando así el bajo nivel de expresión génica asociada con la expresión génica restringida por lisógenos. Por lo tanto, el impacto de la inducción espontánea puede oscurecer la expresión génica de los profagos en una población de lisógenos.
Se utilizaron experimentos de perfiles de crecimiento para identificar la inducción espontánea, que fue mínima durante la fase temprana de crecimiento exponencial. Este estudio informa sobre cómo preparar cultivos de muestra durante la fase temprana de crecimiento exponencial y cómo establecer controles adecuados a pesar del bajo número de células. Estos protocolos garantizan la comparación fiable y reproducible de bacterias de tipo salvaje y lisogénicas en diversas condiciones, mejorando así el perfil transcriptómico de los genomas de los profagos y ayudando a identificar funciones de los profagos previamente no reconocidas.
Recientemente, la terapia con fagos para hacer frente a la resistencia a los antimicrobianos1 y la edición genética basada en CRISPR-Cas2 han generado un renovado interés en la investigación de bacteriófagos. Una vez más, los avances en biotecnología han permitido una investigación más profunda de las interacciones entre bacterias y fagos3. Sin embargo, el uso terapéutico de los fagos (“terapia con fagos”) se ve obstaculizado por la preocupación de que los fagos actúen como elementos genéticos móviles con la capacidad de transferir genes de virulencia y resistencia horizontalmente4. La extensión de la “materia oscura”5 (genes con funciones desconocidas) es a la vez preocupante y tentadora. La materia oscura se considera una laguna en nuestra comprensión de la biología de los fagos y un recurso en gran medida sin explotar para herramientas moleculares y posibles nuevas terapias6. El desarrollo de técnicas de secuenciación de alto rendimiento, junto con la mejora de la anotación de genes 7,8,9 y los nuevos algoritmos de plegamiento de péptidos10, está mejorando la detección, descripción y predicción funcional de los genes de fagos. Sin embargo, la ciencia aún está lejos de validar las funciones genéticas de la mayoría de los fagos en cultivos o en el mundo real.
La secuenciación de ARN (RNA-Seq) puede mapear globalmente la expresión génica durante la infección por fagos y ha mejorado significativamente la comprensión de los elementos fagos y bacterianos involucrados en los ciclos líticos y lisogénicos11,12. Durante los procesos lisogénicos, los genomas de los fagos templados se integran en el ADN bacteriano para convertirse en profagos13. Los experimentos de perfiles de expresión génica global se pueden utilizar para identificar genes restringidos por profagos que están codificados en genomas de fagos templados, pero que solo se expresan durante el estado lisogénico11. Estos genes no codifican proteínas estructurales de fagos y no están implicados en ningún proceso de infección por fagos. RNA-Seq se puede utilizar para identificar aquellos genes que tienen más probabilidades de influir en la biología del huésped bacteriano, ya sea induciendo una ganancia de función o regulando los genes bacterianos existentes, lo que a menudo permite que las bacterias se adapten a entornos cambiantes. Por lo tanto, se podría estudiar la capacidad de los profagos para actuar como titiriteros microbianos, controlando una serie de funciones bacterianas.
Existen dos barreras principales para el análisis efectivo de la expresión génica restringida por profagos. En primer lugar, la disponibilidad de hosts susceptibles es una cuestión clave. Por definición, los profagos ya están incorporados en el genoma específico de su huésped, por lo que es difícil encontrar un huésped de tipo salvaje susceptible para comparar la expresión génica global en presencia y ausencia del profago. Esto puede lograrse mediante la infección de novo de otro huésped susceptible o la eliminación del profago del aislado original de tipo salvaje, sin alterar el resto del genoma del huésped. La segunda barrera radica en la naturaleza heterogénea de las poblaciones lisogénicas. Algunos profagos se degradan a través de la mutación o la recombinación para volverse “crípticos”, lo que significa que se fijan en un lugar específico del genoma bacteriano. Sin embargo, otros profagos son “activos” y pueden ser inducidos a un ciclo lítico replicativo espontáneamente o después de la exposición a factores inductores. En muchos cultivos lisogénicos, la tasa de inducción espontánea significa que una proporción de las células bacterianas siempre están experimentando replicación de fagos líticos14,15,16. Un alto nivel de expresión de genes de fagos tardíos en estas poblaciones enmascara el bajo nivel de expresión génica asociado con la expresión génica restringida por lisógenos11,17. La proporción de lisógenos sometidos a la inducción espontánea de profagos puede variar según el estado de crecimiento, las condiciones de crecimiento u otros desencadenantes. Por lo tanto, para estudiar los impactos de los profagos sobre el lisógeno, los eventos de inducción espontánea de profagos deben minimizarse tanto como sea posible optimizando las condiciones de crecimiento para favorecer el estado lisogénico.
Este estudio reporta el trabajo preparatorio realizado para investigar la influencia de un conjunto de prófagos cohabitantes de la cepa epidémica de Liverpool (EEI) de Pseudomonas aeruginosa. Se indujeron y aislaron profagos activos del EEI y se utilizaron para infectar la cepa modelo del huésped P. aeruginosa, PAO116,18,19. Se secuenciaron los genomas completos de la cepa silvestre de P. aeruginosa, PAO1, y su lisógeno, PAO1Φ2, (a una profundidad de 30 veces la cobertura) para garantizar la identidad de la cepa salvaje y confirmar que el lisógeno era isogénico. El EEI se ha asociado con un aumento de la morbilidad y mortalidad en pacientes con fibrosis quística, y se ha sugerido que los fagos del EEI 19 ayudan a la adaptación al entorno pulmonar de la fibrosis quística16,19,20. A pesar de la fuerte evidencia de que estos profagos afectan la biología de su huésped20,21, la mayoría de sus funciones génicas aún no han sido caracterizadas, y los mecanismos específicos de interacción son poco conocidos. Un enfoque transcriptómico puede descubrir empíricamente las funciones de los genes de los profagos en un entorno de huésped controlado. Dado que la inducción espontánea puede afectar los perfiles de expresión, este artículo describe cómo optimizar las condiciones de crecimiento para favorecer el estado lisogénico. Esta sincronización de cultivos puede validarse mediante PCR en tiempo real para cuantificar los niveles de expresión de marcadores genéticos clave que se asocian con etapas cruciales de la replicación del fago LES en PAO1. El mismo enfoque se ha utilizado previamente para identificar las funciones restringidas a los profagos de los fagos toxigénicos de Shiga que afectan la motilidad, la resistencia a los ácidos y la resistencia a los antimicrobianos en Escherichia coli11,17,21,22.
La creación de un huésped indicador seleccionable, utilizado anteriormente en ensayos de placa para cuantificar con mayor precisión la inducción espontánea del fago Stx de E. coli MC1061 37,38,39, se ha descrito aquí para el fago LESΦ2 de P. aeruginosa. Esta intervención tiene el beneficio adicional de reducir los pasos y el tiempo de procesamiento de la muestra, lo que permite la evaluación simultánea de las tasas de inducción espontánea en múltiples condiciones de cultivo. Existe el riesgo de generar otras mutaciones durante la creación de variantes resistentes a la rifampicina40; Sin embargo, en este trabajo, la cepa evolucionada solo se utilizó como hospedero indicador para la enumeración de placas de cultivos de interés y no se incluyó en el análisis transcriptómico. Mientras la cepa indicadora seleccionable siga siendo igualmente susceptible a la infección por el fago de interés, no hay preocupación por otras mutaciones adquiridas. Sin embargo, no se detectaron diferencias en los perfiles de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción mediante el análisis de electroforesis en gel de campo de pulsos (PFGE) de PAO1WT y PAO1RIF (datos no mostrados).
Al elegir células huésped, es raro encontrar una cepa indicadora que no albergue ya profagos. Por ejemplo, la PAO1 alberga el profago filamentoso Pf4. Los controles experimentales para este estudio se diseñaron para poder examinar directamente la expresión génica de fagos específicos (en este caso, el profago 2 del EEI) y los efectos que este fago tiene sobre la expresión génica bacteriana. En la comparación de los transcritos de PAO1 portadores del profago 2 del EEI y que carecen del profago 2 del EEI (tanto el lisógeno como el no lisógeno portan la Pf4 endógena), que sirven como controles internos para excluir el impacto de la Pf4 en el huésped. Además, se ha demostrado que Pf4 generalmente no causa lisis en su célula huésped41 y, por lo tanto, no es capaz de confundir los resultados de estos experimentos.
Está bien establecido que un control de calidad cuidadoso es crucial en la preparación de las muestras para producir datos ómicos significativos42. Sin embargo, como se describió anteriormente11, la caracterización cuidadosa de la actividad de los profagos en la preparación de cultivos de lisógenos para tales estudios rara vez se realiza. Aquí, detallamos nuestros protocolos sistemáticos para preparar un conjunto bien controlado y optimizado de cultivos para estudios transcriptómicos con el fin de explorar mejor las interacciones entre bacterias y fagos templados. La sincronicidad de la población se controló sometiendo el cultivo a al menos cuatro duplicaciones antes de tratarlo con el antibiótico inductor norfloxacino. Al determinar la CMI de norfloxacino para la cepa en el estudio, pudimos asegurar que la concentración del agente inductor estaba justo por encima de la CMI para el tratamiento de “inducción”. A continuación, las células tratadas se diluyeron 1:10 para reducir la concentración de norfloxacino por debajo de la CMI después del tratamiento de 1 h con el fin de permitir que las células se recuperaran y completaran el proceso de replicación del fago, terminando en la lisis de la célula y la liberación de la progenie del fago infeccioso. Las células solo entran en el ciclo de replicación lítica después del estímulo de inducción una vez que la concentración de norfloxacino se ha reducido por debajo de la CMI durante el período de recuperación. En este caso, ir por encima de 1 μg·mL−1 de norfloxacino significa que el fármaco no podría diluirse eficazmente por debajo de la CIM, ya que la CMI de norfloxacino para PAO1 es de 0,19 μg·mL−1. El nivel de dilución del inductor debe equilibrarse con la necesidad de recuperación de lisógeno y la retención de la densidad de cultivo para la recolección del ARN. Los datos discutidos aquí demuestran que es posible sincronizar cultivos para crear muestras en las que domina la lisogenia, reduciendo así el ruido de la inducción espontánea y permitiendo la detección de verdaderos cambios en la expresión génica impulsados por la lisogenia. Dado que el estado lisogénico es predominante en la fase inicial y exponencial del crecimiento, cuando la densidad celular bacteriana es baja, sugerimos escalar los cultivos para recolectar suficiente ARN para estudios posteriores de expresión génica, como RNA-Seq.
El uso de norfloxacino como agente inductor para forzar los cultivos en el ciclo lítico está bien reportado43,44; sin embargo, esto también afectará la expresión de otros genes bacterianos en el proceso45,46. Para mitigar esto, las bibliotecas de ARN de cultivos de tipo salvaje de control cultivados en las mismas condiciones de inducción y no inducción deben incluirse en los experimentos de RNA-Seq. El uso de controles internos y genes marcadores clave para validar las etapas de replicación de fagos mediante qRT-PCR también es crucial para realizar comparaciones precisas. El perfil cuantitativo de RT-PCR no puede interpretarse comparando el número absoluto de transcritos de cada gen en varios momentos; Lo que importa es la forma del perfil. En primer lugar, solo se ha muestreado una pequeña región en la transcripción de cualquier gen, por lo que se desconoce si se trata de un elemento de vida corta o más larga27. Ciertamente, el mapeo de RNA-Seq de las transcripciones muestra que la densidad de los datos de mapeo varía significativamente a lo largo de la longitud de un gen. En segundo lugar, es la forma del perfil de expresión génica la que debe interpretarse para un gen marcador asociado con el ciclo lítico o el estilo de vida lisogénico o incluso desacoplado de los circuitos reguladores de fagos11. La inducción espontánea es un problema real en el cultivo de lisógenos y siempre dará lugar a la expresión de genes asociados al ciclo lítico. Sin embargo, el perfil muestra que los genes asociados con el ciclo de replicación lítica están suprimidos en su expresión antes de la inducción (al menos dos pliegues logarítmicos) y regulados al alza después de la inducción.
Los análisis transcriptómicos realizados previamente de las interacciones de los fagos Stx con E. coli apoyan una comprensión profunda de los genes de los fagos involucrados en el mantenimiento de la lisogía y en el desencadenamiento del ciclo lítico11,17. En la actualidad, se han anotado los fagos del EEI de P. aeruginosa, pero sus funciones génicas clave son menos conocidas. Los estudios transcriptómicos permitirán la reanotación de los prófagos del EEI y mejorarán nuestra comprensión de los genes implicados en la lisogenia y el ciclo lítico. La vinculación de la secuencia génica con la función representa un reto importante en el estudio de nuevos profagos, lo que pone de relieve la necesidad de realizar más estudios para confirmar las funciones de los genes de los fagos para la producción de mejores herramientas de anotación47. La aplicación y adaptación más amplia de los protocolos y las medidas de control de calidad adicionales que se detallan en este artículo de vídeo podrían ayudar a desvelar varias funciones de los profagos y, por lo tanto, mejorar los canales de anotación y transformar nuestra comprensión de la biología de los fagos y las bacterias.
PAO1 | 6 | ||
LESB58 | 6 | ||
LES phages | Induced and purified from LESB58 using Norfloxacin. | This study | |
Lysogeny Broth (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
LB Agar | Merck | 1.10283.500 | |
Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
Top Agar | 0.4 g Agar Agar+2.5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave and use. | – | |
Rifampicin | Sigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use) | R3501 | |
Glacial Acetic Acid | Fisher 1% (v/v) in water | 10060000 | |
Norfloxacin | Sigma (Stock: 25 mg/mL of 1% Glacial Acetic Acid-Mix well and use 0.22µm filter to sterilize and store it in -20°C until use;To avoid freeze thaw cycles, store as small aliquotes) | N9890 | |
Phenol saturated with citrate buffer pH 4.3 | Sigma | P-4682 | |
Molecular Biology grade Ethanol | Fisher | 16695992 | |
TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
Chloroform | Fisher | 11398187 | |
Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
Nuclease-free H2O | Invitrogen | 10526945 | |
10X TURBO DNase | Ambion | AM1907 | |
Qubit RNA HS, BR Kit | Invitrogen | Q10210 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
SuperScriptIII first strand synthesis kit | Invitrogen | 18080051 | |
PCR Reagents | Bioline Mytaq Red 2X | BIO-25043 | |
qPCR Reagents | Sensifast SYBR Hi Rox | BIO-92020 | |
PCR purification kit | Isolate II PCR and Gel Kit | BIO-52060 | |
TA cloning kit | TA Cloning Kit, with pCR 2.1 Vector, without competent cells | K202040 | |
StepOne Real Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4376600 |