评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病理的协议

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种常见的致盲性疾病，影响55岁以上的人群^1。许多研究人员认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD²的早期和关键的病理生物学事件。RPE是单层极化细胞，其任务是维持邻近光感受器和脉络膜血管的稳态³。存在多种模型来研究RPE内的疾病相关机制，包括细胞培养模型⁴，⁵和小鼠⁶，^7，8。最近的一份报告描述了RPE细胞培养模型⁴的标准化方案和质量控制标准，但没有报告试图标准化小鼠模型中RPE的表型。事实上，许多关于AMD小鼠模型的出版物缺乏对RPE的完整描述或对其中RPE病理的量化。该协议的总体目标是为使用AMD小鼠模型的科学家提供具有无偏定量评估的标准RPE表型方法。

以前的出版物已经通过三种成像技术注意到小鼠中存在几种RPE病理。例如，光学显微镜允许研究人员查看小鼠视网膜的粗大形态（图1A）并检测RPE病理，例如RPE变薄，空泡化和迁移。AMD 小鼠模型中的 RPE 变薄示例是 RPE 高度与其各自对照的偏差（图 1B）。RPE空泡化可分为两类：微空泡化（图1C）和大空泡化（图1D）。RPE微空泡化总结为RPE中存在不影响其总高度的液泡，而大空泡化则表现为存在突出到感光器外部部分的液泡。RPE迁移的特征在于视网膜横截面中RPE单层上方色素的焦点聚集体（图1E）。应该注意的是，AMD供体眼睛中的迁移性RPE细胞对免疫细胞标志物表现出免疫反应性，例如分化簇68（CD68）9，并且可能代表免疫细胞吞噬RPE碎片或RPE经历转分化⁹。另一种称为透射电子显微镜的成像技术可以让研究人员可视化RPE及其基底膜的超微结构（图2A）。该技术可以识别小鼠中主要的亚RPE沉积物，称为基底层流沉积物（BLamD）（图2B）¹⁰。最后，共聚焦显微镜可以通过成像RPE平面支架揭示RPE细胞的结构（图3A）。这种方法可以发现RPE畸形，即RPE与其经典蜂窝形状的偏差（图3B）。它还可以检测RPE多核，即RPE细胞内存在三个或更多细胞核（图3C）。有关当前AMD小鼠模型中存在的RPE病理类型的摘要，我们请研究人员参考文献^6，7中的这些评论。

研究AMD的研究人员应该意识到在表型方案之前使用小鼠研究RPE病理的优缺点。小鼠是有利的，因为它们的寿命相对较短，成本效益，以及它们的遗传和药理可操作性。小鼠还表现出RPE退行性变化，包括RPE迁移，畸形和多核，在AMD供体眼睛中观察到¹¹，¹²，^13，14，¹⁵，^16，17;这表明类似的机制可能是小鼠和人类这些RPE病理发展的基础。然而，存在一些关键差异，限制了小鼠研究对人类AMD的可转化性。首先，小鼠没有黄斑，黄斑是人类视网膜中视力所必需的解剖学上独特的区域，在AMD中优先受到影响。其次，小鼠的一些RPE病理，如RPE变薄和空泡化，在AMD供体的眼睛中并不常见¹⁸。第三，小鼠不会发育玻璃疣，这是AMD病理学的标志¹⁹。玻璃膜疣是含有脂质和蛋白质的沉积物，在RPE基底层和布鲁赫膜（BrM）的内部胶原层之间形成很少的基底膜蛋白¹⁹。玻璃膜疣与BLamD不同，BLamD是小鼠中常见的亚RPE沉积物，无论是它们的组成还是解剖位置。BLamD 是年龄和应激依赖性细胞外基质富集异常，在 BrM 的 RPE 基底层和 RPE²⁰ 的基底折叠之间形成。有趣的是，BLamD在小鼠^和人类中具有相似的蛋白质组成和外观6，^10，21。最近的研究表明，BLamDs可能通过影响AMD进展到后期来影响AMD的病理生物学^18，22;因此，这些沉积物可能代表小鼠视网膜中的患病RPE。了解这些益处和局限性对于有兴趣将小鼠研究结果转化为AMD的研究人员至关重要。

在该协议中，我们讨论了为光，透射电子和共聚焦显微镜准备眼睛以可视化RPE病理的方法。我们还描述了如何以无偏的方式量化RPE病理以进行统计测试。作为概念验证，我们利用RPE表型方案来研究在跨膜蛋白135-（Tmem135）过表达小鼠和老年野生型（WT）C57BL / 6J小鼠中观察到的结构RPE病理。总之，我们的目标是描述表征AMD小鼠模型中RPE的表型方法，因为目前没有可用的标准协议。有兴趣检查和量化光感受器或脉络膜病理的研究人员，这些病理在AMD小鼠模型中也受到影响，可能发现该协议对他们的研究没有用。