تحليل كمي محسن للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي القصير البيوتينيل
Summary
هنا ، نقدم طريقة محسنة في المختبر للكشف عن تفاعلات البروتين وتحديدها والتحقق من صحتها لتسلسلات الحمض النووي الريبي المحددة ، باستخدام مستخلص البروتين الكلي من الخلايا البشرية ، وحبات الستربتافيدين المغلفة بالحمض النووي الريبي البيوتينيل ، وتحليل قياس الطيف الكتلي.
Abstract
تنظم تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي التعبير الجيني والوظائف الخلوية على مستويات النسخ وما بعد النسخ. لهذا السبب ، يظل تحديد الشركاء الملزمين للحمض النووي الريبي محل الاهتمام ذا أهمية كبيرة للكشف عن الآليات الكامنة وراء العديد من العمليات الخلوية. ومع ذلك ، قد تتفاعل جزيئات الحمض النووي الريبي بشكل عابر وديناميكي مع بعض البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) ، خاصة مع البروتينات غير المتعارف عليها. ومن ثم، هناك حاجة ماسة إلى أساليب محسنة لعزل وتحديد هذه الممارسات التجارية التقييدية.
لتحديد شركاء البروتين لتسلسل الحمض النووي الريبي المعروف بكفاءة وكمية ، قمنا بتطوير طريقة تعتمد على سحب وتوصيف جميع البروتينات المتفاعلة ، بدءا من مستخلص البروتين الكلي الخلوي. قمنا بتحسين سحب البروتين باستخدام الحمض النووي الريبي البيوتينيل المحمل مسبقا على حبات مغلفة بالستربتافيدين. كدليل على المفهوم ، استخدمنا تسلسل RNA قصيرا معروفا بربط البروتين المرتبط بالتنكس العصبي TDP-43 والتحكم السلبي في تكوين نيوكليوتيدات مختلفة ولكن بنفس الطول. بعد سد الخرزات باستخدام الحمض النووي الريبي الخميرة ، قمنا بتحميل تسلسل الحمض النووي الريبي البيوتينيلاتي على حبات الستربتافيدين واحتضنها بمستخلص البروتين الكلي من خلايا HEK 293T. بعد الحضانة والعديد من خطوات الغسيل لإزالة المجلدات غير المحددة ، قمنا باستخلاص البروتينات المتفاعلة بمحلول عالي الملح ، متوافق مع كواشف القياس الكمي للبروتين الأكثر استخداما ومع تحضير العينة لقياس الطيف الكتلي. قمنا بقياس تخصيب TDP-43 في القائمة المنسدلة التي تم إجراؤها باستخدام رابط الحمض النووي الريبي المعروف مقارنة بالتحكم السلبي بواسطة مطياف الكتلة. استخدمنا نفس التقنية للتحقق من التفاعلات الانتقائية للبروتينات الأخرى التي تم التنبؤ حسابيا بأنها روابط فريدة للحمض النووي الريبي الذي يهمنا أو عنصر التحكم. أخيرا ، تحققنا من صحة البروتوكول عن طريق اللطخة الغربية من خلال الكشف عن TDP-43 بجسم مضاد مناسب.
سيسمح هذا البروتوكول بدراسة شركاء البروتين في الحمض النووي الريبي ذي الأهمية في الظروف القريبة من الفسيولوجية ، مما يساعد على الكشف عن تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي الفريدة وغير المتوقعة.
Introduction
برزت البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) كلاعبين حاسمين في تنظيم الجينات النسخية وما بعد النسخ ، لأنها تشارك في عمليات مثل الربط mRNA ، وتوطين خلايا الحمض النووي الريبي ، والترجمة ، والتعديل ، والتدهور1،2،3. هذه التفاعلات بين الجزيئين الكبيرين منسقة للغاية ومتوازنة بدقة وضرورية لتشكيل محاور وظيفية ومعالجة. الاختلافات أو عدم التنظيم داخل هذه المحاور لديها القدرة على تعطيل شبكات البروتين والحمض النووي الريبي المنظمة بدقة وترتبط بشكل متزايد بمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية ، بما في ذلك السرطان 4,5 والاضطرابات التنكسية العصبية6،7،8. يمكن أن تكون التفاعلات بين جزيئات الحمض النووي الريبي وشركائها في الارتباط بالبروتين إما مستقرة وسهلة التحقق من صحتها تجريبيا ، أو ديناميكية للغاية وعابرة وأكثر صعوبة في توصيفها.
في السنوات الأخيرة ، بذلت جهود مكثفة لفهم هذه التفاعلات. من بين أكثر الطرق رسوخا ، من المحتمل أن تكون فحوصات سحب البروتين (PDs) هي الأساليب الأكثر تقديرا وشائعة الاستخدام لكشف اللاعبين الرئيسيين الذين يشكلون مجمعات البروتين النووي الريبي (RNP) وشبكات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي الأخرى3،9،10. تشمل PDs مظلة واسعة من التقنيات الإعلامية ، مثل الترسيب المناعي إما للحمض النووي الريبي (RIP) 11,12 أو البروتين (CLIP) 13,14 محل الاهتمام. تستخدم بعض بروتوكولات RNA-PD هذه الحمض النووي الريبي المعروف كطعم للبروتينات15 ، في أغلب الأحيان من خلال الاستفادة من علامات التقارب العالية مثل البيوتين. في هذه الحالة ، يمكن الكشف عن شركاء التفاعل للحمض النووي الريبي البيوتينيل عن طريق تثبيت الحمض النووي الريبي على حبات مغلفة بالستربتافيدين ، مما يتيح العزل الفعال ل RNPs. عادة ما تكون القيود الرئيسية لهذه الأساليب هي تصميم مجسات البيوتينيلات واختبار قدرتها على ربط البروتينات المستهدفة. لهذا الغرض ، قد يكون من المفيد الاعتماد على بيانات CLIP المنشورة للبروتين محل الاهتمام ، إذا كانت متوفرة ، لأنها تكشف ، بدقة عالية ، عن مناطق الحمض النووي الريبي القصيرة التي تتوافق مع قمم التفاعلات مع البروتين المستهدف13,16. يمكن استخدام هذه المناطق نفسها لتطوير مجسات ل PD. قد تكون الطريقة البديلة لتصميم طعوم الحمض النووي الريبي هذه هي التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي (SELEX)17 ، والتي تمكن من تصميم الأبتامير من خلال الاختيار في المختبر ، بدءا من مكتبة عشوائية شاملة وعبر سلسلة من دورات التحسين المدفوعة بتفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك ، فإن SELEX معقدة وتستغرق وقتا طويلا ، وتعتمد النتائج النهائية بشكل كبير على المكتبة الأولية. لتحديد طعم الحمض النووي الريبي لاستخدامه في البروتوكول المقدم هنا ، تم استغلال نهج آخر ، يتكون من استخدام طعم الحمض النووي الريبي المصمم من جديد عن طريق القوة الحسابية لخوارزمية القطالسريع ، والذي يتنبأ بالارتباط التفضيلي لبروتين معين تجاه تسلسلات معينة من الحمض النووي الريبي18،19،20.
البروتوكول المقدم هنا هو نسخة من RNA-PD محسنة لاستئصال شركاء بروتين معينين في ظروف قريبة من الفسيولوجية ، دون استخدام المنظفات أو عوامل تغيير الطبيعة أو درجات الحرارة المرتفعة. يعتمد على حبات نانو فائقة المغناطيسية مغلفة تساهميا بستربتافيدين عالي النقاء واستخدام الحمض النووي الريبي البيوتينيلي المصمم في السيليكو كطعم. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة لعزل شركاء الربط لجزيئات الحمض النووي الريبي البيوتينيل في الظروف الأصلية ، مما يوفر إمكانية لمجموعة واسعة من التطبيقات النهائية. لاختبار هذا البروتوكول ، تم استخدام تسلسل أبتامير الحمض النووي الريبي المفرد المكون من 10 نيوكليوتيد ، والذي تم تصميمه سابقا لربط البروتين 43 المرتبط بالحمض النووي TAR (TDP-43) مع تقارب وخصوصية عالية ،20. بدءا من محللات الخلايا التائية HEK 293T ، تم تحديد تفاعلات أبتامير الحمض النووي الريبي البيوتينيل عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي الذي تم إجراؤه على عينات منفصلة عن طعم الحمض النووي الريبي باستخدام مخزن مؤقت مفرط التوتر. أكد هذا التحليل التحديد الناجح والقياس الكمي ل TDP-43 باعتباره الموثق المفضل.
يتيح هذا البروتوكول التعرف الناجح على تفاعلات البروتين باستخدام قليل قليل النوكليوتيد RNA قصير في المختبر. علاوة على ذلك ، فإن استخدام أبتامير الحمض النووي الريبي المصمم في السيليكو كمجسات PD21,22 يضمن خصوصية الأهداف بتكاليف منخفضة بشكل كبير.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشير هذا العمل إلى تحسين بروتوكول PD الذي يتم إجراؤه باستخدام قليل النيوكليوتيدات الحمضية للحمض النووي الريبي البيوتينيلوت لالتقاط تفاعلات البروتين الخاصة بهم. البروتوكول الموصوف هنا سهل التنفيذ ، ويتطلب القليل من المواد ، وينتج نتائج موثوقة للغاية. الأهم من ذلك ، أن الجوانب الأكثر حداثة لهذا البروتوكول تتكون من استخدام طعم الحمض النووي الريبي المصمم بالكامل في السيليكو والمحدد لهدف البروتين ، وشطف جميع البروتينات المرتبطة بطعم الحمض النووي الريبي عن طريق تعطيل تفاعلاتها مباشرة مع محلول عالي الملح ، بدلا من فصل الستربتافيدين عن البيوتين مع المنظفات والمعالجة بدرجة حرارة عالية.
يستفيد هذا البروتوكول من قوة الرابطة بين البيوتين والستربتافيدين29,30. وفقا لحبيبات الستربتافيدين المختارة ، يجب اختبار تحميل الحمض النووي الريبي البيوتينيل وقياسه قبل المتابعة. أيضا ، قد يؤثر طي الحمض النووي الريبي ثلاثي الأبعاد على كفاءة التحميل على الخرز ، لأنه قد يحد من تعرض البيوتين للستربتافيدين. يؤدي منع الخرزات باستخدام الحمض النووي الريبي غير البيوتينلي إلى تحسين نظافة النتائج عن طريق الحد من التفاعلات غير المحددة مع الخرزات. يجب اختيار مخزن التحميل المؤقت والمخزن المؤقت للشطف اعتمادا على تطبيقات المصب. هنا ، تم اقتراح ظروف معتدلة للغاية ، مناسبة لغالبية التطبيقات وتم تطويرها للحفاظ على مجمعات البروتين المحتملة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة قابلة للتكيف بدرجة كبيرة. يمكن للمستخدم اختيار أي خط خلية وأي حجم للحمض النووي الريبي ، ويمكن أن يقرر تكرار البروتوكول بعد طي / فتح الحمض النووي الريبي لتحديد تأثير الهيكل على خصائص الربط.
جانب أصلي آخر من هذا البروتوكول هو استخدام أدوات التنبؤ بالسيليكو لضمان صحة النتائج20. إن معرفة البروتينات التي يجب تحديدها مسبقا على أنها متفاعلات للحمض النووي الريبي محل الاهتمام يعطي ميزة غير مسبوقة تتمثل في التحقق من صحة الجوانب التقنية للبروتوكول. على سبيل المثال ، باستخدام تحليل بسيط للبنك الدولي ، من الممكن التحقق من وجود هدف بروتين معروف في العينات المشتقة من الخطوات المختلفة للبروتوكول قبل الشروع في تحليل MS ، والذي يتطلب أجهزة متخصصة وأكثر تكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ مؤخرا عن طريقة لاستخدام catRAPID20 ، وهي خوارزمية تنبؤ داخلية للبروتين والحمض النووي الريبي ، لتصميم دي نوفو RNA خاص بالبروتين المستهدف. حتى وقت قريب ، كان خط الأنابيب الوحيد المتاح لتصميم أبتامير الحمض النووي / الحمض النووي الريبي للبروتين المستهدف هو نهج SELEX (التطور المنهجي للروابط عن طريق التخصيب الأسي)31. تتيح طريقة السيليكو تصميما أسرع بكثير وفعالا من حيث التكلفة لأتامرز الحمض النووي الريبي.
ترتبط القيود الرئيسية لهذه الطريقة بالحاجة إلى العمل في المخازن المؤقتة والأدوات الخالية من النيوكلياز. علاوة على ذلك ، إذا اعتبر من الضروري التأكد في المختبر من الارتباط بين الحمض النووي الريبي المصمم من جديد والبروتين المستهدف السابق ل PD ، فيجب إنتاج البروتين وتنقيته وتحديد الارتباط بنهج فيزيائية حيوية. هذا هو القيد الذي يتم مشاركته مع إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
على الرغم من هذه القضايا البسيطة ، فإن الطرق الموثوقة لرسم خريطة تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي ، مثل تلك المعروضة هنا ، يمكن أن تقرب العلماء من الكشف عن شبكات الجزيئات الكبيرة والجهات الفاعلة الرئيسية المعقدة للعديد من الآليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل تلك المشاركة في السرطان ، واعتلال عضلة القلب ، والسكري ، والالتهابات الميكروبية ، والاضطرابات الوراثية والتنكسية العصبية.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا مجموعة أبحاث البروفيسور تارتاليا والدكتور كومو على الدعم المقدم. تلقت EZ تمويلا من زمالة MINDED لبرنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Sklodowska-Curie رقم 754490.
Materials
| 6-well tissue culture plates | VWR | 10861-554 | CELLS |
| Cell scrapers | BIOSIGMA | 10153 | CELLS |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientfic | 11995065 | CELLS |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil | Thermo Fisher Scientfic | 10500064 | CELLS |
| Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA) | Thermo Fisher Scientfic | 14190169 | CELLS |
| Trypsin (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientfic | 15050065 | CELLS |
| Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP) | Cellsignal | 7070 | PD |
| Biotinylated RNA | Eurofins | Custom RNA oligonucleotides | PD |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | PD |
| Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Biorad | 1705061 | PD |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Merck – Sigma Aldrich | 5056489001 | PD |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | PD |
| Recombinant anti-TDP43 antibody | Abcam | ab109535 | PD |
| Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae) | Merck – Sigma Aldrich | R5636-1ML | PD |
| Streptavidin Mag Sepharose | Merck – Sigma Aldrich | GE28-9857-99 | PD |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit | Biorad | 1704272 | PD |
| Acetone | Thermo Fisher Scientfic | 022928.K2 | MS |
| C18 cartridge | Thermo Fisher Scientfic | 13-110-018 | MS |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientfic | 20290 | MS |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | ES902 | MS |
| iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich S.r.l. | I6125 | MS |
| Lys-C/Trypsin | Promega | V5073 | MS |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientfic | 28904 | MS |
| Urea | Thermo Fisher Scientfic | J75826.A7 | MS |
| Equipment | |||
| ChemiDoc imaging system | Bio-Rad | CELLS | |
| Dyna Mag -2 , Magnetic rack | Invitrogen | CELLS | |
| Forma Series 3 water jacketed C02 incubator | Thermo Scientific | PD | |
| PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications | Bio-Rad | PD | |
| Rotating wheel, rotator SB3 | Stuart | PD | |
| Water bath set at 37 °C | VWR | PD | |
| XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system | ThermoFisher Scientific | MS | |
| Easy-nLC 1200 UHPLC | Thermo Scientific | MS | |
| Q exactive Mass Spectrometer | Thermo Scientific | MS | |
| Software | Version | ||
| MaxQuant | 2.0.3.0 | MS | |
| Perseus | 1.6.14.0 | MS |
References
- Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
- Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
- Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90 (2020).
- Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89 (2017).
- Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
- Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
- Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317 (2019).
- Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243 (2018).
- Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203 (2014).
- Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
- Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
- Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
- Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
- Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306 (2022).
- Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13 (2014).
- Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941 (2019).
- UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
- Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
- Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270 (2021).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
