Özofagus Fibroblastlarının Organoid Ko-Kültürler Kullanılarak Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Görüntülenmesi

Bu çalışma için hayvan deneyleri Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (etik izin no 14051-2019) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar, Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Derneği Federasyonu’nun tavsiyelerine göre patojensiz koşullarda barındırıldı. 1. Hazırlık Ayrışma için kullanılan enzimatik stok çözeltilerini (bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde çözün. Büyüme faktörü azaltılmış (GFR) bazal membran matrisinin (matris) bir alikotunu 4 °C’de çözün. Kültür ortamını hazırlayın. Organoid kültürler ve ortak kültürler için Tablo 1’de açıklanan ortamı kullanın ve protokole başlamadan önce hazırlayın. 2. Özofagus epitelinin ve stromanın diseksiyonu ve ayrılması NOT: Diseksiyon ve doku işleme için kullanılan tüm aletlerin steril olduğundan emin olun. Hanks’in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) üç özofaj başına 2 mL ayrışma çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın. C57BL/6J fareler gibi tercih ettiğiniz bir fare türünü kullanın. Farelerde özofagus gelişimi doğum sonrası gün (p) 70’ten sonra sona erer, bu nedenle p7013’ten daha eski farelerin kullanılması önerilir. 8-10 organoid ko-kültür oluşturmak için yeterli materyal sağladıkları için dört veya beş fare kullanın.NOT: Organoid oluşturma verimliliği, farelerin yaşı ile birlikte azalır. Spesifik fibroblast alt popülasyonları ilgi çekiyorsa, düşük fibroblast veriminin kurulabilecek organoid ko-kültürlerin sayısını sınırlaması mümkündür. Fibroblast popülasyonlarının izolasyonu için genetiği değiştirilmiş (örneğin, PdgfrαH2BeGFP) veya vahşi tip (WT) fareler kullanın. WT fareleri kullanırken, spesifik fibroblast alt popülasyonlarını FACS yoluyla stromadan izole etmek için antikor boyaması yapın. CO2 boğulması ile fareleri ötenazi yapın. Forseps ve diseksiyon makası kullanarak yemek borusunu diseke edin. Tüm yemek borusunu çıkarmak için, yemek borusunun distal ucunu doğrudan midenin üstünde ve proksimal ucu trakeanın başlangıcında kesin. Yemek borusunu PBS’ye batırın ve buzun üzerine koyun. Bir diseksiyon mikroskobu (toplam büyütme aralığı 8x-40x) ve forseps kullanarak muscularis eksternasını mekanik olarak çıkarın. Disseke özofagusun distal ucunu bir çift forseps kullanarak tutun ve diğer forsepsleri kullanarak kası distalden disseke özofagusun proksimal ucuna kadar tutup çekin. Kas tabakasını çıkarın ve atın. Yemek borusunu uzunlamasına açın. Bu, doku hasarını önlemek için bir top ucuna sahip mikrodiseksiyon yay makası kullanarak en iyi şekilde çalışır. Yay makası topunu yemek borusunun lümenine sokmak için yemek borusunun bir ucunu tutun ve sonuna kadar tutarken yemek borusunu kesin. Yemek borusunu 1,5 mL’lik bir mikro santrifüj tüpüne veya 24 delikli bir plakaya yerleştirin. Açılan yemek borusunu HBSS’de 0.5 mg/mL termolizin içinde 37 °C’de bir rocker-shaker üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin. Yemek borusunu tamamen termolizin çözeltisine batırın.NOT: Kullanılan termolizin çözeltisinin hacmi, kuyuya veya tüp boyutuna bağlıdır. Birkaç özofagus aynı kuyuya veya tüpe yerleştirilebilir ve batırılabilir. Yemek borusunu termolizin çözeltisinden çıkarın. Özofagus epitelini stromadan dikkatlice ayırmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. İnce forseps kullanarak, dokunun hem epitel tarafını hem de stroma tarafını tutun ve iki katmanı ayırmak için yavaşça ayırın.NOT: Stroma, şeffaf epitelin aksine, beyaz ve opak görünümü ile tanımlanır. Stroma lamina propria ve submukozal tabakayı içerir. Epitel ve stromal tabakayı, HBSS’de 200 μL ayrışma çözeltisi içeren iki ayrı 1.5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın. Buz üzerine koyun. 3. Özofagus progenitör hücrelerinin izolasyonu NOT: Özofagus progenitör hücrelerinin izolasyonu (adım 2) ve fibroblastların (adım 3) aynı anda yapılabilir. HBSS’de 50 mL’lik bir tüp hazırlayın % 1 FBS (% 1 FBS). Ayrılmış özofagus epitelini 1.5 mL mikro-santrifüj tüpünden (adım 2.8) temiz bir Petri kabına aktarın ve kıymak için keskin bir neşter kullanın. Kıyılmış dokuyu Petri kabından 200 μL ayrışma çözeltisi ile toplayın ve 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne geri aktarın.NOT: Parçalar 200 μL pipet ucu kullanılarak 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne geri yerleştirilebildiğinde epitel düzgün bir şekilde kıyılır. 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne toplam 1 mL hacme 800 μL taze ayrışma çözeltisi ekleyin.NOT: Yeterli miktarda ayrışma çözümü eklemek önemlidir. Bir ila üç özofaj başına 1 mL çözelti önerilir. Aynı anda daha fazla özofagus işlendiğinde ölçeği artırın. Tüpü kıyılmış epitel tabakası ile 60 dakika boyunca 37 ° C’de bir rocker-shaker üzerine yerleştirin. Sindirimi artırmak için her 15 dakikada bir 200 μL pipet ucu kullanarak çözeltiyi yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 60 dakika sonra, 200 μL pipet ucu kullanarak 20 kez daha yukarı ve aşağı pipet yapın. Çözeltiyi 40 μm’lik bir hücre süzgecinden yeni bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne geçirin. 4 °C’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj.NOT: Hücrelerin filtreye yapışmasını en aza indirmek için hücreleri zorlamadan önce hücre süzgecini %1 FBS ile ıslatın. Epitel tamamen sindirilmeyecek ve doku parçaları hala görülebilecektir. Bununla birlikte, daha uzun inkübasyon, hücre sağkalımını azaltacak ve daha yüksek bir canlı hücre verimi ile sonuçlanmayacaktır. Fazla sıvıyı 1 mL’lik bir pipetle çıkararak süpernatantı atın ve peleti 1 mL’lik %1 FBS’de yeniden askıya alın. 4 °C’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj.Santrifüjleme sırasında, özofagus progenitör hücrelerinin FACS’si için konjuge antikor karışımını hazırlayın. 1 μL CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) ve CD104-A647 (INTEGRIN-β4) bir milyon hücre başına 200 μL’de %1 FBS ile karıştırın.NOT: Bir veya iki özofaj için 1 μL antikor (200 μL son hacim) yeterlidir. Bir kerede daha fazla özofagus işlenirken, antikor boyama çözeltisinin hacmini arttırın. Peleti 200 μL antikor karışımında tekrar askıya alın ve bir akış sitometri tüpüne aktarın. Floresan antikorları ekledikten sonra, sinyalin ağartılmasını önlemek için hücre süspansiyonlarını karanlıkta tutun. Hücreleri 4 ° C’de 30 dakika boyunca inkübe edin. 3 mL% 1 FBS ekleyin ve 4 ° C’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın ve ardından hücreleri FBS’nin% 1’inin en az 200 μL’sinde yeniden askıya alın.NOT: 500 μL% 1 FBS, dört veya beş özofaja kadar kullanılır. Aynı anda daha fazla özofagus işlendiğinde hacmi artırın, böylece 100-300 olay / sn FACS akış hızı elde edilebilir. Daha fazla olay / s sıralama verimliliğini azaltacak ve akış hızındaki bir artış hücre hayatta kalmasını azaltacaktır. Canlı hücreleri izole etmek için FACS sıralamasından 5 dakika önce, 1:10.000’lik son konsantrasyona ölü hücre leke işaretleyicisi ekleyin. Bir FACS makinesi kullanarak progenitör hücreleri sıralayın (geçit stratejisi için Şekil 1’e bakın). Hücreleri 200 μL bazik organoid ortam ile doldurulmuş 1.5 mL mikro santrifüj tüplerinde toplayın (Tablo 1). 4. Fibroblastların stromal tabakadan izolasyonu Stomal tabakayı, diseksiyon makası kullanarak 200 μL ayrışma çözeltisi (adım 2.8) içeren 1.5 mL’lik bir tüpte ince parçalar halinde kesin. Çözelti 200 μL pipet ucu kullanılarak yukarı ve aşağı pipetlenebildikten sonra doku düzgün bir şekilde kıyılır. 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne toplam 1 mL hacme 800 μL taze ayrışma çözeltisi ekleyin.NOT: Yeterli miktarda ayrışma çözümü eklemek önemlidir. Bir ila üç özofaj başına 1 mL çözelti önerilir. Aynı anda daha fazla özofagus işlendiğinde ölçeği artırın. Tüpü 30 dakika boyunca 37 ° C’de bir rocker-shaker üzerine yerleştirin. 15 dakika sonra, sindirimi artırmak için 200 μL pipet ucu kullanarak çözeltiyi yaklaşık 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 30 dakikalık enzimatik parçalamadan sonra, 200 μL pipet ucu kullanarak pipeti 20 kez daha yukarı ve aşağı çekin. Çözeltiyi 70 μm’lik bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne süzün. 4 °C’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj.NOT: Hücrelerin filtreye yapışmasını en aza indirmek için hücreleri zorlamadan önce hücre süzgecini %1 FBS ile ıslatın. Fazla sıvıyı 1 mL’lik bir pipetle çıkararak süpernatantı atın ve peleti 1 mL’lik %1 FBS’de yeniden askıya alın. 4 °C’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj.NOT: Floresan etiketli fibroblastlar içeren genetiği değiştirilmiş bir fare suşu kullanıldığında, antikor boyamaları isteğe bağlıdır. Antikor boyamaları gerekli değilse, adım 3.7 ile devam edin ve numuneyi bir akış sitometri tüpüne aktarın.Santrifüjleme sırasında, fibroblastların FACS izolasyonu için konjuge antikor karışımını hazırlayın. 1 μL CD26-APC (DPP4) ile bir milyon hücre başına %1 FBS’nin 200 μL’sinde karıştırın.NOT: Bir veya iki özofagus için 1 μL antikor yeterlidir. Bir kerede daha fazla özofagus işlenirken, antikor boyama çözeltisinin hacmini arttırın. Peleti %1 FBS’de 200 μL konjuge antikor karışımında tekrar askıya alın ve bir akış sitometri tüpüne aktarın. Hücreleri 4 ° C’de 30 dakika boyunca inkübe edin. 3 mL% 1 FBS ekleyin ve 4 ° C’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Hücreleri FBS’nin% 1’inin en az 200 μL’sinde yeniden askıya alın.NOT: 500 μL% 1 FBS, dört veya beş özofaja kadar kullanılır. Aynı anda daha fazla yemek borusu işlendiğinde hacmi artırın, böylece 100-300 olay / sn akış hızı elde edilebilir. Daha fazla olay / s sıralama verimliliğini azaltacak ve akış hızının arttırılması hücre hayatta kalmasını azaltacaktır. Floresan antikorlar eklendikten sonra, sinyalin ağartılmasını önlemek için hücre süspansiyonları karanlık tutulmalıdır. Canlı hücreleri izole etmek için FACS sıralamasından 5 dakika önce, 1:10.000’lik son konsantrasyona ölü hücre leke işaretleyicisi ekleyin. Bir FACS makinesi kullanarak hücreleri sıralayın (geçiş stratejisi için Şekil 1’e bakın). Hücreleri 200 μL bazik organoid ortam ile doldurulmuş 1.5 mL mikro santrifüj tüplerinde toplayın (Tablo 1). 5. Özofagus organoidlerinin kurulması ve kültürü NOT: ER’yiönceden ısıtın düşük (organoid kokültür), ENR (organoid) ortamı (açıklama için Tablo 1’e bakın) ve 37 ° C’de 48 delikli bir plaka. Çözülmüş matrisi (1. adımda hazırlanan) aliquot’u buzun üzerine yerleştirin. Fare özofagus organoid kültürü için burada verilen matrisin kullanılması önerilir ( Malzeme Tablosuna bakınız), çünkü diğer matris markaları organoid oluşturma verimliliğini olumsuz yönde etkiler. Organoid ko-kültür için, sıralanmış epitel hücrelerini ve fibroblastları bir tüpte 1: 2 oranında karıştırın. Her matris kubbesi için 5.000 epitel hücresi ve 10.000 fibroblast kullanın. Daha fazla kubbe için hazırlanırken, bir tüpe 5.000 epitel hücresi ve 10.000 fibroblastın katlarını ekleyin. Fibroblastsız organoid kültürler için, matris kubbesi başına 5.000 epitel hücresi kullanın. Karışık hücre popülasyonunu 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj edin. Süpernatantı 200 μL pipetle dikkatlice çıkararak atın. Peletleri soğuk bazik organoid ortamda tekrar askıya alarak hücreleri bir kez yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin. % 80 matris ve% 20 soğuk bazik organoid ortamdan oluşan bir karışım hazırlayın. Matris oda sıcaklığında (RT) katılaştıkça her şeyi buzun üzerine yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı 200 μL pipetle dikkatlice çıkararak atın. Hücreleri 10 μL matris karışımı / kubbesi içinde tekrar askıya alın ve tekrar buza koyun. Önceden ısıtılmış 48 delikli plakayı 37 °C inkübatörden alın ve 20 μL pipet kullanarak kuyucuk başına bir matris kubbesi yapın. Her kubbe 10 μL% 80 matris, 5.000 epitel hücresi ve 10.000 fibroblast içerir. Plakayı baş aşağı bir inkübatöre aktarın ve kubbelerin 37 ° C’de 20-30 dakika daha katılaşmasına izin verin.NOT: Matris kubbe hacmindeki azalma ve/veya hücre sayısındaki artış organoid oluşum verimliliğini etkileyecektir. Sadece epitel organoidleri içeren ilgili matris kubbelerine organoid ko-kültürler ve ENR ortamı (Tablo 1) içeren matris kubbelerine 200 μL önceden ısıtılmış ERdüşük ortamı (Tablo 1) ekleyin ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Organoidleri 37 ° C’de ve% 5 CO2’de büyütün. İlk 2 gün boyunca, ortamı 10 μM Kaya inhibitörü (Y-27623) ile destekleyin. Kaya inhibitörü strese bağlı hücre ölümünü önler ve organoid kültürlerin başarılı bir şekilde kurulma şansını arttırır. Ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Sıcaklığa duyarlı matrisin ayrışmasını önlemek için ortamın sıcak olduğundan emin olun. Kaplamadan 6 ila 8 gün sonra deneyin analizlerini yapın. Organoidler kültürde 14 güne kadar tutulabilir. 14. gün civarında kubbe bütünlüğünde kayıp gözlenir. 6. Organoidlerin geçişi NOT: Ko-kültürde yetiştirilen organoidlerin geçişi fibroblast kaybına neden olur. Bu nedenle, geçişi sırasında tüm organoidler için ENR ortamının kullanılması önerilir. ENR, PBS ve 48 delikli plakayı 37 °C’de önceden ısıtın. Ortamı çıkarın ve matris kubbesini içeren kuyucuğu önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. 200 μL soğuk% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin ve matris kubbesini kırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın.NOT: Matris sıcaklığa duyarlı olduğundan ve matris kubbelerinin parçalanmasına yardımcı olduğundan% 0.25 tripsin kullanılması tavsiye edilir. Organoidleri ~ 20 dakika boyunca 37 ° C’de tripsin ile inkübe edin. Organoidlerin ayrışmasını arttırmak için 10 dakika sonra pipet yukarı ve aşağı. Ayrışma sürecini her 5-10 dakikada bir mikroskopla izleyin. Tripsin hücre canlılığını azalttığından, bu ideal ayrışma süresini belirlemeye yardımcı olabilir. 20 dakika sonra, organoidleri ayırmak için organoidleri 200 μL’lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetin. Hücreleri 1,5 mL’lik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın, 1 mL bazik organoid ortam ekleyin ve RT’de 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. İsteğe bağlı: En iyi organoid büyüme koşullarını ve yeni organoidlerin tek hücrelerden türetilmesini sağlamak için, hücreleri önceden ıslatılmış 40 μm hücre süzgecinden geçirin. Hücre süspansiyonunun filtrelenmesi, ayrılması zor olan organoid çekirdeklerin ve hücre kümelerinin çıkarılmasına neden olur. matris ve soğuk bazik organoid ortamdan oluşan bir matris karışımı hazırlayın. Matris RT’de katılaştıkça her şeyi buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı 200 μL’lik bir pipetle dikkatlice çıkararak atın, hücreleri 10 μL matris karışımı / kubbesinde yeniden askıya alın ve karışımı tekrar buza koyun.NOT: Organoidler, kubbe yoğunluğuna bağlı olarak 1:5 ila 1:10 oranında bölünebilir. Epitel hücreleri de sayılabilir ve 5.000 hücre / kubbede yeniden kaplanabilir. Önceden ısıtılmış 48 delikli plakayı 37 ° C inkübatörden alın ve kuyu başına bir kubbe yapın. Plakayı baş aşağı bir inkübatöre aktarın ve kubbelerin 37 ° C’de 20-30 dakika daha katılaşmasına izin verin. İlgili organoid kubbelere 200 μL önceden ısıtılmış ENR ortamı ekleyin. Ortamı ilk 2 gün boyunca 10 μM Kaya inhibitörü (Y-27623) ile destekleyin. Ortamı her 2-3 günde bir yenileyin. Sıcaklığa duyarlı matrisin ayrışmasını önlemek için ortamın sıcak olduğundan emin olun. 7. Tüm montaj boyama için organoid işleme NOT: Organoidlerin plastiklere yapışmasını önlemek için kullanmadan önce uçları ve tüpleri PBS’de FBS ile kaplayın. Pipet uçları için, ucu kullanmadan önce FBS/PBS çözeltisinde bir veya iki kez yukarı ve aşağı pipet yapmak yeterlidir. Tüpler için, tüpü% 10 FBS / PBS ile doldurun ve ardından çözeltiyi çıkarın. Organoid ortamı çıkarın ve matris kubbelerine 200 μL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Plakayı 5-10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Pipeti yukarı ve aşağı çekin ve çözeltiyi 0,6 mL mikro santrifüj yapışkan olmayan borulara aktarın. Organoidlerin tabana yerleşmesini sağlamak için 100 x g’de 30-60 s kısa sürede santrifüj yapın.NOT: Aşırı pipetleme ve uzun santrifüjleme organoidleri kırar ve fibroblast-organoid etkileşimini bozar. Fazla sıvıyı çıkarın ve buz gibi soğuk PBS ekleyin. Organoidlerin tabana yerleşmesini sağlamak için 100 x g’de 30-60 s kısa sürede santrifüj yapın. Fazla sıvıyı çıkarın ve organoidi PBS çözeltisinde buz üzerinde 30 dakika boyunca 200 μL soğuk% 4 formaldehit ile sabitleyin.DİKKAT: Formaldehit toksiktir ve her zaman kimyasal duman davlumbazında kullanılmalıdır. Nitril eldivenler, koruyucu gözlükler ve laboratuvar önlükleri her zaman giyilmelidir. Organoidin sabitlenmesi batmalarına neden olur ve santrifüjlemeye artık gerek yoktur. Tüpü dik yerleştirerek organoidlerin batmasına izin verin ve 2-3 dakika bekleyin, formaldehiti çıkarın ve formaldehiti yıkamak için 500 μL soğuk PBS ekleyin. Organoidlerin batmasına izin verin, fazla PBS’yi çıkarın ve 500 μL taze soğuk PBS ekleyin. Organoidlerin batmasına izin verin, fazla PBS’yi çıkarın ve 500 μL bloke edici tampon ekleyin (PBS’de% 5 normal eşek serumu,% 1 BSA ve% 0.5 Triton X-100). Tüpü RT’de 60 dakika boyunca bir rocker-shaker’a koyun.NOT: Engelleme, 4 ° C’de gece boyunca (O / N) de yapılabilir. Organoidlerin batmasına izin verin, bloke edici tamponu çıkarın ve organoidleri birincil antikorlarla 200 μL bloke tamponunda yeniden askıya alın (bkz. Organoidleri 4 ° C’de bir rocker-shaker O / N üzerinde tutun.NOT: Nükleer proteinlerin, düşük eksprese proteinlerin veya spesifik olmayan boyama gösteren antikorların boyanmasını iyileştirmek için, inkübasyon süresi 4 ° C’de 1 veya 2 gün boyunca arttırılabilir. Organoidleri bir rocker-shaker üzerine yerleştirmek, organoidlerin bir araya toplanmasını önlediği ve lekelenme verimliliğini arttırdığı için çok önemlidir. Organoidlerin batmasına izin verin, birincil antikor karışımını çıkarın ve organoidleri RT’de 60 dakika boyunca PBS’de (% 0.02 Tx) 500 μL% 0.02 Triton X-100 kullanarak yıkayın.NOT: Daha uzun primer antikor inkübasyonu gerektiğinde, 4 °C’de PBS O / N’de% 0.02 Tx ile bir yıkama adımı ekleyin. Organoidlerin batmasına izin verin, yıkama tamponunu çıkarın ve 4 ° C’de tampon O / N’yi bloke etmek için 200 μL floresan konjuge ikincil antikor ekleyin. Floresan sekonder antikorlar ekledikten sonra, sinyalin ağartılmasını önlemek için organoidleri karanlıkta tutun. Organoidlerin batmasına izin verin, ikincil antikor karışımını çıkarın ve organoidleri RT’de 60 dakika boyunca 500 μL% 0.02 Tx kullanarak yıkayın. Gerekirse nükleer boyama için organoidleri 200 μL DAPI (0.25 μg / mL) çözeltisi ile karşı boyayın. Numuneleri RT’de 60 dakika boyunca bir rocker-shaker üzerinde inkübe edin. Organoidlerin batmasına izin verin, DAPI çözeltisini çıkarın ve organoidleri RT’de 15 dakika boyunca 500 μL PBS’de yıkayın. Organoidlerin batmasına izin verin ve tüm fazla sıvıyı çıkarın. Organoidlere 10 μL temizleme çözeltisi ekleyin ve RT’de 15 dakika boyunca inkübe edin.NOT: Temizleme çözeltisi viskozdur, bu nedenle temizleme çözeltisini pipetlemeden önce 20 μL pipet ucunun dış kısmını kesin. Görüntüleme için daha büyük bir ara parça kullanılırsa daha fazla temizleme çözeltisi eklenebilir. Organoidlerin temizlenmediği zamanlarda temizleme çözeltisi yerine montaj çözeltisi kullanılabilir. Temizleme çözümü, görüntüleme sırasında arka planı azaltır ve görüntüleme derinliğini artırır. Bir mikroskop slaytına 0,05 mm çift taraflı yapışkan 4 kuyucuklu bir ara parça yerleştirin. 10 μL temizleme çözeltisini organoidlerle birlikte bir kuyucuğa ekleyin ve ara parçanın üstüne bir kapak kayması yerleştirin.NOT: Organoidler ara parça kullanılmadan da monte edilebilir. Ara parça organoid şeklini sağlam tutar ve organoidlerin düzleşmesini önler. Organoidleri temizlemek için slaytı RT O / N’de tutun. Uzun süreli depolama için, slaytları 4 °C’de tutun. Konfokal mikroskopi sistemi kullanarak görüntüler elde edin.